黃崇杰，洪滉，劉長寶，曹偉蘭，黃穎鵬，王中林

溫州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院，浙江 溫州 325027，1.肛腸外科；2.綜合外科；3.胃腸外科

大腸癌的發(fā)病率在惡性腫瘤中排名第三，且有逐年升高的趨勢[1]。大腸癌的發(fā)生、進展及預(yù)后情況是一個多因素共同干預(yù)的生物學過程。Ki-67是一種參與細胞增殖分裂的核蛋白，研究認為腫瘤細胞Ki-67的高表達可促進細胞增殖分裂，腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移 能力強[2]。GST-π（glutathione S-transferase π）是一種多功能代謝酶亞型，研究發(fā)現(xiàn)GST-π基因高表達可促進藥物失活及外排，從而增加腫瘤細胞對抗化療藥物。因此GST-π與Ki-67的表達與大腸癌發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移等均具有相關(guān)性，可評估及預(yù)測腫瘤的惡性程度及遠期預(yù)后情況。研究表明超重和肥胖增加了癌癥發(fā)生的風險，也是目前世界嚴重的公共衛(wèi)生問題[3]。體質(zhì)量指數(shù)（body mass index, BMI）與大腸癌發(fā)病、轉(zhuǎn)移、腫瘤耐藥及預(yù)后關(guān)聯(lián)基因的關(guān)系目前仍存在爭議。本研究探討直腸癌組織中GST-π、Ki-67的表達及患者BMI水平與腫瘤臨床生物學特征之間的關(guān)系及臨床意義，對直腸癌患者療效分析及遠期預(yù)后評估提供指導意義。

1 對象和方法

1.1 對象 回顧性分析溫州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院肛腸外科及普通外科于2010年1月1日至2013年1月1日收治的直腸癌手術(shù)患者共308例，行經(jīng)腹或腹腔鏡下直腸癌根治術(shù)（包括直腸癌低位前切除術(shù)、腹會陰聯(lián)合直腸癌根治術(shù)），II期高危及III期患者常規(guī)行術(shù)后輔助化療。收集的臨床資料包括：性別、年齡、基礎(chǔ)疾?。ㄌ悄虿?、高血壓病）、BMI、腫瘤下緣距齒狀線距離、腫瘤大小及浸潤深度（T1-T4）、分化程度（高、中、低分化）、病理類型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期及5年生存率情況。準入標準：①成年且經(jīng)本院術(shù)后病理確診直腸癌；②術(shù)前6個月內(nèi)體質(zhì)量波動低于10%者；③原發(fā)直腸癌；④病例信息資料完整。排除標準：①未成年或臨床病理資料不全者；②原位癌和TNM分期IV期患者；③結(jié)直腸腫瘤家族史；④合并其他惡性腫瘤患者，或其他器官遠處轉(zhuǎn)移；⑤手術(shù)前曾經(jīng)接受新輔助化療的直腸癌患者；⑥行姑息性手術(shù)者；⑦電話失訪，非腫瘤因素死亡的患者。

1.2 方法

1.2.1 分組：根據(jù)患者臨床一般資料及腫瘤病理生物學特征進行分組，按BMI分為：超重組（BMI≥ 24 kg/m2）、正常組（BMI為18.5～24 kg/m2）、消瘦組（BMI＜18.5 kg/m2）；GST-π陽性組、GST-π陰性組；Ki-67高陽性組（Ki-67＞70%）、Ki-67低陽性組（Ki-67≤70%）；SPSS17.0分析BMI及腫瘤指標（GST- π、Ki-67）的表達與患者臨床及病理特征的相關(guān)性，進一步分析BMI與GST-π、Ki-67表達之間的相關(guān)性及臨床意義。分析Ki-67高陽性患者5年生存率與BMI的關(guān)系。

1.2.2 病理標本檢測：聯(lián)合病理科將術(shù)后直腸癌標本取材，將腫瘤組織用中性甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟脫水，將組織用石蠟包埋后切片，厚度4 μm，切片常規(guī)脫蠟，用鼠抗人Ki-67、GST-π單克隆抗體孵育后，采用SP法染色，樹膠封片后高倍顯微鏡下觀察，根據(jù)試劑盒說明書免疫組化實驗步驟對Ki-67、GST-π在直腸癌中的表達情況進行檢測。在高倍光學顯微鏡下隨機觀察切片10個視野并計數(shù)。GST-π的陽性表達染色情況主要定位于胞質(zhì)與胞膜，光鏡下染色后細胞質(zhì)為黃色或棕黃色顆粒的為陽性細胞，計算陽性細胞百分比進行分組，細胞質(zhì)內(nèi)未見陽性細胞或陽性細胞比例＜15%為（-），著色細胞所占比15%～25%為（+），細胞質(zhì)內(nèi)見陽性細胞所占百分比25～75%為（++），細胞質(zhì)內(nèi)見陽性細胞所占百分比＞75%為（+++）。根據(jù)統(tǒng)計需要分為GST-π表達陰性組（-），陽性組（+/++/+++）。Ki-67的表達集中在細胞核，經(jīng)過染色后腫瘤細胞核內(nèi)染色分為未染色、淡黃色顆粒、棕黃色顆?；蚝稚w粒，其中褐色、棕黃色顆粒為陽性細胞，胞漿內(nèi)染色的細胞不作為陽性計數(shù)，根據(jù)腫瘤細胞染色陽性細胞數(shù)計算百分率。統(tǒng)計分析時方便計算，將Ki-67染色陽性細胞數(shù)所占比進行分組：腫瘤細胞染色陽性細胞數(shù)所占百分比≤70%為Ki-67低陽性，腫瘤細胞染色陽性細胞數(shù)所占百分比＞70%為Ki-67高陽性。

1.3 統(tǒng)計學處理方法 采用SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計學分析。計數(shù)資料以例數(shù)（%）表示，兩樣本率或構(gòu)成比比較采用χ2檢驗，多樣本率比較采用行列表的χ2檢驗（單向有序，變量屬性不同，采用秩和檢驗；雙向有序，變量屬性不同，采用等級相關(guān)分析）。BMI與Ki-67陽性表達的相關(guān)性采用單變量Logistic回歸分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 免疫組化檢測GST-π在直腸癌組織中的表達情況 GST-π的陽性表達染色情況主要定位于胞質(zhì)與胞膜，光鏡下染色后細胞質(zhì)為黃色或棕黃色顆粒的為陽性細胞（見圖1）。

圖1 GST-π在直腸癌組織中的表達（×400）

2.2 免疫組化檢測Ki-67在直腸癌組織中的表達情況 Ki-67的表達集中在細胞核，腫瘤細胞核內(nèi)染色分為未染色、淡黃色、棕黃色或褐色顆粒，其中褐色、棕黃色顆粒為陽性細胞（見圖2）。

圖2 Ki-67在直腸癌組織中的表達（×400）

2.3 BMI與患者臨床特征及腫瘤病理的關(guān)系 不同BMI水平在患者性別、糖尿病病史、腫瘤下緣位置、癌結(jié)節(jié)轉(zhuǎn)移、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況之間差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。BMI與患者年齡、高血壓、腫瘤浸潤、腫瘤大小、TNM分期、組織分化程度及術(shù)后5年生存率具有相關(guān)性（P＜0.05）。進一步研究表明，患者年齡、高血壓病、腫瘤直徑≥3 cm與超重相關(guān)（P＜0.05）。腫瘤的浸潤程度、高TNM分期、分化程度及5年生存率低均與消瘦相關(guān)（P＜0.05）。見表1。

表1 BMI與直腸癌臨床生物學特征的關(guān)系[例（%）]

2.4 直腸癌Ki-67的表達與腫瘤臨床及病理特征的關(guān)系 直腸癌組織Ki-67的表達在年齡、性別、是否患基礎(chǔ)疾?。ㄌ悄虿　⒏哐獕翰。⒛[瘤距齒狀線距離、腫瘤大小、分化程度、癌結(jié)節(jié)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況等因素之間差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。Ki-67的表達與BMI、腫瘤浸潤深度、TNM分期及術(shù)后5年生存率相關(guān)，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表2。

表2 Ki-67的表達與直腸癌臨床生物學特征的關(guān)系[例（%）]

2.5 直腸癌GST-π的表達與腫瘤臨床及病理特征的關(guān)系 直腸癌GST-π的表達與患者性別、年齡、是否患基礎(chǔ)疾病（糖尿病、高血壓?。⒛[瘤浸潤程度、腫瘤大小、癌結(jié)節(jié)轉(zhuǎn)移及5年生存率比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。GST-π的表達水平與直腸癌患者BMI相關(guān)（P＜0.05）。GST-π的表達水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況有關(guān)（P＜0.05）。GST-π的表達與腫瘤距齒狀線距離有關(guān)，腫瘤位置越低，GST-π表達水平越高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），GST-π的表達水平與腫瘤TNM分期有關(guān)，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表3。

表3 GST-π與直腸癌臨床病理特征的關(guān)系[例（%）]

2.6 直腸癌組織Ki-67表達與患者BMI的關(guān)系 Ki-67及BMI均與患者術(shù)后5年生存率相關(guān)，進一步分析BMI與Ki-67陽性表達的相關(guān)性，超重且Ki-67高陽性表達直腸癌所占比明顯低于正常BMI組（P＜0.05）。見表4。進一步分析Ki-67高陽性表達的患者術(shù)后5年生存率與肥胖或消瘦的關(guān)系，Ki-67高陽性表達且正常、消瘦、超重的患者5年生存率分別是45.5%，20.0%，45.9%。分組比較患者術(shù)后5年生存率，消瘦組與正常組間差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表5。

表4 BMI與組織Ki-67表達水平的相關(guān)性

表5 Ki-67高陽性表達患者術(shù)后5年生存率與BMI之間的關(guān)系

3 討論

大腸癌是目前全球第三大消化道腫瘤，有研究表明大腸癌的發(fā)病危險因素包括肥胖、吸煙、代謝綜合征和大腸癌家族史等[4]。世界癌癥研究基金會研究表明大腸癌與肥胖密切相關(guān)，肥胖被列為大腸癌的獨立風險因素[5]。大腸癌的發(fā)病率在富裕階段的民族中更為顯著，可能與飲食結(jié)構(gòu)和生活水平有關(guān)，但仍有消瘦的大腸癌患者遠期預(yù)后情況差的結(jié)論[6]，直腸癌患者BMI與臨床特征、病理及遠期生存率的研究目前尚無定論。本研究表明直腸癌患者BMI與發(fā)病年齡、是否患高血壓、腫瘤的大小、腫瘤浸潤、TNM分期、組織分化及術(shù)后5年生存率相關(guān)，而與患者是否有糖尿病、性別、腫瘤位置、癌結(jié)節(jié)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移不相關(guān)。年齡大于70歲的超重患者占比最少，而年紀小于70歲的超重患者占比最多，表明BMI與患者的年齡相關(guān)。年齡大于70歲的超重患者占比低，可能與高齡患者機體功能差，肥胖同時有心腦血管方面慢性疾病及死亡率高有關(guān)。RIM等[7]研究發(fā)現(xiàn)直腸癌患病率男性高于女性，且消瘦人群患III期大腸癌的比例明顯高于超重患者。本研究剔除短期內(nèi)體質(zhì)量變化較大的病例，發(fā)現(xiàn)III期的大腸癌消瘦患者比正常組高，而超重與正常組之間無明顯差異。本研究發(fā)現(xiàn)患者BMI與腫瘤浸潤程度有關(guān)，消瘦與直腸癌浸潤程度呈正相關(guān)（P＜0.05）。腫瘤浸潤程度為（T3+T4）的超重患者占比明顯較高，認為在腫瘤浸潤深度及惡性度方面，消瘦的患者風險更高。本研究還發(fā)現(xiàn)不同BMI與腫瘤分化程度呈相關(guān)性，消瘦組低分化占比較高，明顯高于正常BMI組（P＜0.05）。同時，正常BMI組、消瘦組、超重組術(shù)后5年生存率為52.7%、29.7%、50.6%。與正常BMI組比較，消瘦組患者術(shù)后5年生存率低，而超重組5年生存率差異無統(tǒng)計學意義。SHIBAKITA等[8]研究表明低BMI患者腫瘤更容易進展及發(fā)生淋巴結(jié)及遠處轉(zhuǎn)移，可作為大腸癌的獨立危險因素之一，與本研究結(jié)果相符。

Ki-67是由MKI67基因編碼的，與細胞增殖分裂相關(guān)的核蛋白，其表達與RNA的轉(zhuǎn)錄密切相關(guān)。Ki-67高表達提示腫瘤細胞分裂增殖快，腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移能力就越強。Ki-67蛋白的高表達被認為是乳腺癌、前列腺癌、神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤等惡性腫瘤預(yù)后的不良因素[9-10]。本研究發(fā)現(xiàn)直腸癌患者Ki-67的高陽性表達與腫瘤浸潤、TNM分期、BMI及術(shù)后5年生存率有關(guān)，與患者是否有高血壓病、糖尿病、年齡大小、腫瘤位置、癌結(jié)節(jié)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等因素均不相關(guān)。在腫瘤浸潤深度方面，本研究發(fā)現(xiàn)Ki-67的陽性表達與直腸癌的浸潤深度呈正相關(guān)，T3+T4期直腸癌患者表現(xiàn)明顯，III期的直腸癌較中早期直腸癌高陽性表達高，說明高Ki-67表達提示腫瘤晚期概率大。WANG等[11]研究發(fā)現(xiàn)Ki-67高陽性表達大腸癌與腫瘤分期和術(shù)后5年低生存率差呈相關(guān)性，可作為判斷遠期預(yù)后的指標。Ki-67低陽性組患者術(shù)后5年生存率明顯高于Ki-67高陽性表達的患者，表明Ki-67低陽性表達的腫瘤患者遠期預(yù)后較好，而且Ki-67高陽性表達合并消瘦的患者5年生存率更低，說明消瘦與Ki-67的表達水平可作為評估直腸癌惡性度及預(yù)后的預(yù)測因子。

谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（glutathione S- transferase, GST）是人體內(nèi)生物轉(zhuǎn)化最重要的II相代謝酶，是大腸癌發(fā)病的一個風險因素。JANKOVA 等[12]研究發(fā)現(xiàn)GST-π表達高的大腸癌患者如果未接受化療，那么術(shù)后生存率明顯比低GST-π表達患者低。羅敏等[13]研究表明GST-π高表達直腸癌患者出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的概率大。以上研究結(jié)果表明高GST-π表達大腸癌患者預(yù)后較差。本課題表明直腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與GST-π陽性表達存在正相關(guān)性，GST-π高陽性表達患者術(shù)后隨訪直腸癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的概率越高。III期直腸癌GST-π陽性表達率明顯高于（I+II）期直腸癌，而且組織分化越差，GST-π陽性表達率越高，這與之前JANKOVA等[12]研究相符。KIM等[14]研究表明進展期直腸癌患者，腫瘤位置越低，其總體預(yù)后情況較差。本研究也發(fā)現(xiàn)中低位大腸癌組織GST-π陽性表達比例明顯偏高，提示對化療產(chǎn)生耐藥的可能性大，預(yù)后不佳。但本研究顯示GST-π陽性表達與患者術(shù)后5年生存率無關(guān)，也可能與研究的樣本量有關(guān)。

綜上所述，本研究揭示了直腸癌患者BMI與腫瘤組織Ki-67的表達存在相關(guān)性，可以作為評估大腸癌惡性程度、侵襲轉(zhuǎn)移及預(yù)測預(yù)后的臨床參數(shù)。結(jié)合分析BMI與GST-π、Ki-67的表達水平及相關(guān)性，對評估腫瘤的惡性度、預(yù)后情況起到重要作用。