夏 俊，李寧川，宣 磊，沈紫璇

有氧運(yùn)動對高脂誘導(dǎo)肥胖大鼠睪丸組織自噬水平及炎癥因子影響研究

夏 俊1，李寧川2，宣 磊1，沈紫璇1

1.安徽省體育科學(xué)技術(shù)研究所，安徽 合肥，230000；2.揚(yáng)州大學(xué)體育學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州，225000。

研究目的：通過施加有氧運(yùn)動干預(yù)高脂誘導(dǎo)肥胖大鼠，探究其對高脂飲食產(chǎn)生的肥胖所引起的機(jī)體炎癥與自噬之間的關(guān)系。研究方法：40只SD大鼠隨機(jī)分為4組，正常對照組（NC，10只）、高脂飼料組（HC，10只）、普通運(yùn)動組（CE組，10只）、高脂運(yùn)動組（HE，10只）。按照實驗要求，NC組和CE組喂以普通飼料，HF組和HE組喂以高脂飼料。CE組和HE組進(jìn)行10周的游泳運(yùn)動干預(yù)，采用ELisa和RT-PCR法分別檢測大鼠脂代謝、炎癥因子和自噬相關(guān)因子指標(biāo)。研究結(jié)果：（1）與NC組相比，HF組大鼠Lee`s指數(shù)明顯升高（P<0.01）；與HF組相比，10周游泳運(yùn)動大鼠體重、Lee`s指數(shù)顯著下降（P<0.01）。（2）與NC組比較，HF組TG、TC、LDL均顯著升高（P<0.01），HDL顯著降低（P<0.05）；CE組TG、TC均顯著升高（P<0.01），LDL顯著降低（P<0.05）。與HF組比較，HE組TG顯著降低（P<0.01），TC、LDL顯著降低（P<0.05）。（3）與NC組相比，HF組NF-kB、IL-6水平均有顯著性升高（P<0.01），CE組NF-kB、IL-6水平也有顯著性降低（P<0.05）；與HF組相比，HE組NF-kB、IL-6水平均顯著降低（P<0.05）。（4）與NC組相比，HF組Bclin-1、LC3 II值明顯降低，但無顯著性差異，P62值具有顯著性增加（P<0.05），CE組Bclin-1、LC3 II值明顯降低，P62值明顯升高，但均無顯著性差異；與HF組相比，HE組Bclin-1、LC3 II值呈顯著性升高（P<0.05），P62值顯著性降低（P<0.01）。研究結(jié)論：長期有氧運(yùn)動能夠提升高脂膳食肥胖大鼠睪丸組織自噬活性，進(jìn)而抑制炎癥因子的表達(dá)，使大鼠睪丸組織炎癥水平有所改善。

有氧運(yùn)動；自噬；炎癥；高脂飲食；肥胖

高脂飲食可引起肥胖，以及使得機(jī)體脂代謝紊亂，嚴(yán)重肥胖可引起男性生殖功能障礙[1]。以往實驗表明，有氧運(yùn)動能夠改善脂代謝紊亂，減緩脂質(zhì)沉積以起到減脂減肥的作用然而對高脂膳食所引起的機(jī)體炎癥成因卻沒有明確的解釋[2]。運(yùn)動與攝食限制等手段可有效控制肥胖。通過運(yùn)動對肥胖癥大鼠自噬的研究中，大多數(shù)都將肌肉、脂肪作為靶器官或靶組織[3]，而關(guān)于睪丸組織作為生殖功能的重要器官的肥胖引起的自噬變化卻非常少。因此，本研究選取有氧運(yùn)動干預(yù)方式，探究其對高脂飲食產(chǎn)生的肥胖所引起的機(jī)體炎癥中自噬與炎癥之間的相互影響，旨在為高脂飲食所致睪丸組織炎癥的改善提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

4周齡雄性SD大鼠，體重在140±10g，先適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后，在隨機(jī)分為4組，飼養(yǎng)環(huán)境為12h光照循環(huán)，溫度保持在25℃左右。實驗大鼠均從江蘇大學(xué)動物實驗中心購買。

1.2 實驗分組

所有大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為4組：正常對照組（NC組，10只）；高脂飼料組（HF組，10只）；正常運(yùn)動組（CE組，10只）；高脂運(yùn)動組（HE，10只）。按照實驗要求，正常組大鼠投喂普通固體飼料，高脂組大鼠投喂高脂谷底飼料。普通飼料購于江蘇協(xié)同生物有限公司。高脂飼料按配方80.5%的基礎(chǔ)飼料，14%的豬油，2%的膽固醇，0.5%的膽鹽，3%的麻油，由江蘇協(xié)同生物有限公司按配方加工。

1.3 運(yùn)動方案

通過每天1h游泳訓(xùn)練干預(yù)大鼠進(jìn)行實驗，在第1周時，先進(jìn)性10min適應(yīng)游泳訓(xùn)練，之后每天遞加10min，第6天達(dá)到60min運(yùn)動，之后每天保持60min游泳運(yùn)動量，每周6次，共持續(xù)10周。游泳的容器選擇100× 80 cm × 80cm的方形塑料桶，每5只在一個標(biāo)準(zhǔn)桶中游泳訓(xùn)練，水溫保持在33-35℃。

1.4 實驗取血與樣本處理

在處死實驗大鼠的前1天，停止運(yùn)動訓(xùn)練，并且禁食12h，但繼續(xù)保持實驗大鼠的飲水供應(yīng)。在大鼠進(jìn)行麻醉后測量大鼠體重、體長指標(biāo)。按照50mg/kg的劑量，注射2%的戊巴比妥鈉溶液進(jìn)行麻醉。剪開腹腔進(jìn)行腹主動脈取血，置于抗凝管中靜置1h，于離心機(jī)內(nèi)4℃、4000rmp離心15min，制備血清，放于-80℃冰箱保存待測。

1.5 測試指標(biāo)及檢測方法

采用ELISA檢測大鼠血清中甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC）、高密度脂蛋白（HDL）、低密度脂蛋白（LDL）水平及大鼠睪丸組織中IL-6、NF-kB水平；試劑均購自南京諾唯贊生物有限公司。

1.6 Real-TimePCR檢測Beclin-1、LC3-II、P62mRNA的表達(dá)

所有引物均由上海生物有限公司以Gene Bank數(shù)據(jù)庫為參考模板，設(shè)計合成，Beclin-1-F引物序列cctcctccctggaa acaactaa，Beclin-1-R引物序列tagttagcacagtaagcgttca，p62-F引物序列g(shù)aagataaggcttgtcaacgtt，p62-R引物序列tctgagctcact tttacatggt，LC3-II-F引物序列ctaaactaagctatttcggccc，LC3-II-R引物序列caaaagagcaagcctaacaaga。

RT-PCR檢測：采用Triol法提取睪丸中的總RNA，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將所提取的睪丸總RNA在核酸擴(kuò)增儀中反轉(zhuǎn)錄獲取cDNA，利用熒光定量PCR儀進(jìn)行樣本cDNA的擴(kuò)增和熒光定量檢測。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行處理，采用雙因素方差分析和配對樣本t檢驗分析，結(jié)果以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”（X±S）來表示，顯著性差異水平為P<0.05，非常顯著差異為P<0.01。

2 結(jié) 果

2.1 各組實驗大鼠體重、體長及Lee`s指數(shù)

與NC組相比，HF組大鼠體長無明顯差異，但Lee`s指數(shù)明顯升高（P<0.01）；與HF組相比，10周游泳運(yùn)動使大鼠體重、Lee`s指數(shù)顯著下降（P<0.01），體長有明顯增加，但無顯著性差異；普通飼料飼養(yǎng)大鼠10周游泳運(yùn)動后，體重、Lee`s指數(shù)顯著下降（P<0.01），體長無明顯差異（表1）。

表1 各組大鼠體重、體長、Lee`s指數(shù)（n=10）

注：*表示不同組別與NC組比較差異明顯（P<0.05），**表示不同組別與NC組比較顯著性差異（P<0.01）；+表示HE與HF組比較存在明顯差異（P<0.05），++表示HE與HF組比較存在顯著性差異（P<0.01）。下同。

2.2 各組實驗大鼠血清脂代謝指標(biāo)變化

與NC組比較，HF組TG、TC、LDL均顯著升高（P<0.01），HDL顯著降低（P<0.05）；CE組TG、TC均顯著升高（P<0.01），LDL顯著降低（P<0.05）。與HF組比較，HE組TG顯著降低（P<0.01），TC、LDL顯著降低（P<0.05）（表2）。

表2 本研究各組大鼠血清脂代謝指標(biāo)一覽表

注：與NC組相比較，* P<0.05，** P<0.01；與HF相比較+ P<0.05，++P<0.01。

2.3 實驗大鼠睪丸組織NF-kB、IL-6變化

與NC組相比，HF組NF-kB、IL-6水平均有顯著性升高（P<0.01），CE組NF-kB、IL-6水平也有顯著性降低（P<0.05）；與HF組相比，HE組NF-kB、IL-6水平均顯著降低（P<0.05）（表3）。

表3 大鼠睪丸組織炎癥因子NF-kB、IL-6水平

注：與NC組相比較，* P<0.05，** P<0.01；與HF相比較+ P<0.05，++P<0.01。

2.4 實驗大鼠睪丸組織Bclin-1、P62、LC3-II mRNA水平

與NC組相比，HF組Bclin-1、LC3 II值明顯降低，但無顯著性差異，P62值具有顯著性增加（P<0.05），CE組Bclin-1、LC3-II值明顯降低，P62值明顯升高，但均無顯著性差異；與HF組相比，HE組Bclin-1、LC3-II值呈顯著性升高（P<0.05），P62值顯著性降低（P<0.01）。

表4 實驗大鼠睪丸組織Bclin-1、p62、LC3-II mRNA水平

注：與NC組相比較，* P<0.05，** P<0.01；與HF相比較+ P<0.05，++P<0.01。

3 討論與分析

3.1 高脂膳食誘導(dǎo)營養(yǎng)性肥胖大鼠模型建成

肥胖本身是一種慢性低度炎癥的病態(tài)，機(jī)體脂肪的大量堆積，增加內(nèi)臟器官壓力，機(jī)體的長期處于低度炎癥狀態(tài)對多種代謝功能產(chǎn)生阻礙。眾多研究者建立的肥胖大鼠模型主要分為自發(fā)性肥胖模型、轉(zhuǎn)基因動物模型、營養(yǎng)性肥胖動物模型，本實驗所采用的肥胖大鼠模型采用的是高熱量飼料建成的肥胖大鼠模型[4,5]。營養(yǎng)性肥胖模型成功建立并沒有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，通常以高脂飼養(yǎng)組體重超過普通飼養(yǎng)組體重20%為依據(jù)，Lee`s指數(shù)具有顯著性升高以及血清脂代謝指標(biāo)具有顯著性變化[6]。肥胖大鼠模型的建立成功一般參考高脂組大鼠比肥胖組大鼠體重高20%，且血清4項指標(biāo)具有顯著差異。本實驗中，通過10周的飲食干預(yù)，高脂空白組大鼠較空白對照組高出20%，且與NC組相比，HF組大鼠血清TG、TC、HDL均顯著性升高。其結(jié)果與多項高脂飼料誘導(dǎo)的肥胖大鼠模型結(jié)果相似，因此可以判定營養(yǎng)性肥胖大鼠模型建立成功。

3.2 有氧運(yùn)動對高脂膳食肥胖大鼠睪丸組織Bclin-1、P62、LC3-II mRNA水平

肥胖具有脂肪組織不斷擴(kuò)展的特征，當(dāng)能量攝入過多不能即使消耗是，多余的能量就會轉(zhuǎn)化為甘油三酯儲存在脂肪細(xì)胞之中。細(xì)胞自噬的活性也會跟隨機(jī)體環(huán)境的改變而發(fā)生變化，在低度炎癥的肥胖狀態(tài)下，自噬活性隨之改變。Yoshizaki通過建立GFP-LC3轉(zhuǎn)基因小鼠模型，進(jìn)而進(jìn)行16周的高脂飲食干預(yù)，日本學(xué)者Yoshizaki等通過GFP-LC3轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行16周正常膳食和高脂膳食干預(yù)后發(fā)現(xiàn)，小鼠附睪脂肪GFP-LC3信號分布出現(xiàn)顯著性區(qū)別，在正常飲食的小鼠附睪脂肪中信號以散點(diǎn)式分布，高脂膳食干預(yù)組的小鼠同樣是附睪脂肪中，卻檢測不到GFP-LC3信號分布，提示肥胖癥小鼠睪丸組織的自噬水平有所降低[7]。在本實驗中，HF組大鼠較NC組大鼠相比，大鼠睪丸組織自噬標(biāo)志物L(fēng)C3II和Beclin1具有明顯降低，P62水平有所上升，但均沒有顯著性差異，結(jié)果顯示高脂膳食飼養(yǎng)大鼠自噬活性受到抑制并有所減弱。

He等研究發(fā)現(xiàn)，通過運(yùn)動訓(xùn)練干預(yù)能夠?qū)σ吧托∈蠊趋兰〖?xì)胞的自噬活性起到促進(jìn)的作用。同時，運(yùn)動訓(xùn)練能夠減輕野生型小鼠度長期高脂飲食有誘導(dǎo)的葡萄糖耐量以及高脂血癥等癥狀降低[8]。崔迪等研究表明，營養(yǎng)過剩肥胖小鼠骨骼肌ULK1、ATG13、LC3 mRNA及LC3II/LC3I比值降低導(dǎo)致骨骼肌細(xì)胞自噬水平下降，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)代謝廢物不能夠及時清除，而耐力訓(xùn)練集合膳食改善可有效增加LC3的含量，使骨骼肌細(xì)胞自噬水平得以提高[9]。Roche等在進(jìn)行9周高脂誘導(dǎo)肥胖大鼠的實驗中，肥胖組大鼠的自噬因子Beclin1和LC3II相較于對照組，均具有顯著性升高[10]。本實驗中，通過10周游泳運(yùn)動，HE組大鼠較HF組大鼠睪丸組織自噬標(biāo)志物L(fēng)C3II和Beclin1均具有顯著性增加，P62顯著性降低，提示運(yùn)動改善并提高了大鼠睪丸組織自噬活性。

3.3 自噬介導(dǎo)有氧運(yùn)動對高脂膳食大鼠睪丸組織炎癥因子的影響

研究表明，肥胖中脂肪因子的炎癥因子和自噬標(biāo)志物之間存在相互介導(dǎo)及調(diào)節(jié)的作用[11]。通過高脂膳食誘導(dǎo)的肥胖大鼠中脂肪因子的自噬活性相較于正常對照組及偏瘦體重組，自噬標(biāo)志物L(fēng)C3蛋白表達(dá)的變化明顯，具有顯著性增加。在體外實驗的離體細(xì)胞培養(yǎng)中，采用自噬抑制劑處理培養(yǎng)細(xì)胞，檢測到炎癥因子IL-1β、IL-8的額轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)具有顯著增加[12]。在本研究中，與HF組相比，HE組大鼠睪丸組織NF-kB、IL-6水平均顯著性降低，之前結(jié)果顯示，通過10周有氧運(yùn)動發(fā)現(xiàn)，HE組相較于HF組大鼠睪丸組織自噬標(biāo)志物發(fā)生顯著性變化，提示自噬活性具有顯著增強(qiáng)。提示有氧運(yùn)動可通過自噬活性增強(qiáng)進(jìn)而減緩睪丸組織炎癥水平。許多研究證實自噬能夠負(fù)性調(diào)節(jié)炎性機(jī)體的激活[13]。用LPS刺激Atg 16L1缺乏的巨噬細(xì)胞會激活caspase-1，使IL-1β和IL-18釋放增加[14]。在福氏志賀菌感染時，細(xì)菌誘發(fā)的液泡膜殘余物會激活caspase-1，并結(jié)合LC3和P62上，被運(yùn)送至自噬溶酶體進(jìn)行降解，從而抑制炎癥反應(yīng)[15]。

4 結(jié) 論

長期有氧運(yùn)動能夠提升高脂膳食肥胖大鼠睪丸組織自噬活性，進(jìn)而抑制炎癥因子的表達(dá)，使大鼠睪丸組織炎癥水平有所改善。

[1] 李寧川，胡玉龍，陳小燕，等.游泳運(yùn)動對高脂膳食誘導(dǎo)大鼠精子凋亡的影響[J].北京體育大學(xué)學(xué)報，2014，37（06）：66～69.

[2] 李志剛.耐力運(yùn)動對營養(yǎng)性肥胖大鼠Galectin-3表達(dá)的影響[J]中國運(yùn)動醫(yī)學(xué)雜志，2018，37（07）：588～593.

[3] 張禮剛，陳先國，等.細(xì)胞自噬和炎癥小體相互作用的研究進(jìn)展[J].臨床泌尿外科雜志，2015，35（07）：980～984.

[4] 孫 波，李 輝，等.肥胖與慢性炎癥[J].生物學(xué)雜志，2013，4（01）：28～29.

[5] Landry D, Cloutier F, Martin LJ.Implications of leptin in neuroendocrine regulation of male repuduction [J]. Reprod Biol, 2013(13): 1～14.

[6] 孫 志，張中成，劉志誠.營養(yǎng)性肥胖動物模型的實驗研究[J].中國藥理學(xué)通報，2002，18（04）：466～467.

[7] Yoshizaki T, Kusunoki C, Kondo M, et al. Autophagy regulates inflammation in adipocytes.Biochen Biophys Res Commun, 2012, 417: 352～357.

[8] He CC, Bassik MC, Moresi V, et al. Exercise-induced BCL2-regulated autophagy is required for muscle glucose homeostasis. Nature, 2012, 481(7382): 511～515.

[9] 崔 迪，邱守濤，王海燕，等.耐力運(yùn)動對營養(yǎng)性肥胖小鼠骨骼肌細(xì)胞自噬及線粒體自噬的影響[J].體育科學(xué)，2014（12）：63～71.

[10] Rocha-Rodrigues S. Beleza J. Goncalves IO, et al. Endurance training attenuates autophagy and inflammatory changes in visceral adipose tissue from rats in long-standing high-fat diet-induced obesity.Eur J Clin Invest, 2014, 44: 77.

[11] 趙永軍，何玉秀.自噬介導(dǎo)運(yùn)動改善肥胖癥脂肪組織炎癥狀態(tài)研究進(jìn)展[J].中國運(yùn)動醫(yī)學(xué)雜志，2016，35（07）：675～681.

[12] 任彩媛，張向穎，時紅波，等.自噬調(diào)控脂多糖誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎癥因子水平[J].細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志，2017，3（05）：581～585.

[13] Shi CS, Shenderov K, Huang N N, Kabat J, Abu-Asab M, Fitzgerald K A, Sher A,Kehrl JH. Activation of auto phagy by imflammatory signal limits IL-1beta production by targeting ubiquiti nated imflammasomes for desteuction.Nat Immunol 2012, 13: 255～263.

[14] Saitoh T, Fujita N, Jang MH, Uematsu S, Yang BG. Akira S, Loss of the a utophagy protein Atg16L1 enhances endotoxin induced IL-1beta production.Nature, 2008, 456: 264～268.

[15] Dupont N, Lacas-Gervais S. Shigella phagocytic vacuolar men brane remnants participate invasion and are regulated by autophagy. Cell Host Microbe 2009(06): 137～149.

Effect of Aerobic Exercise on Autophagy Level and Inflammatory Factors in Rat Testis Induced by High Fat

XIA Jun1, LI Ningchuan2, XUAN Lei1, et al

1.Anhui Sports Science Institute, Hefei Anhui, 230000, China;2.College of Physical Education Yangzhou University, Yangzhou Jiangsu, 225000, China.

Objective: To investigate the relationship between inflammation and autophagy induced by obesity induced by high-fat diet in obese rats by aerobic exercise. Methods: 40 SD rats were randomly divided into 4 groups: normal control group (NC, 10 rats), high-fat diet group (HC, 10 rats), normal exercise group (CE group, 10 rats), and high-fat exercise group (HE, 10 rats). According to the experimental requirements, NC group and CE group were fed with ordinary feed, HF group and HE group were fed with high-fat feed. The CE group and HE group underwent 10-week swimming exercise intervention, and lipid metabolism, inflammatory factors and autophagy related factors were detected by ELisa and rt-pcr, respectively. Results: (1) Compared with NC group, Lee's index of rats in HF group was significantly increased (P<0.01). Compared with the HF group, the body weight and Lee's index of the 10-week swimming exercise rats decreased significantly (P<0.01). (2) Compared with NC group, TG, TC and LDL in HF group increased significantly (P<0.01), and HDL decreased significantly (P<0.05). TG and TC in the CE group were significantly increased（P<0.01）, and LDL was significantly decreased (P<0.05). Compared with HF group, TG was significantly decreased in HE group (P<0.01), TC and LDL were significantly decreased (P<0.05). (3) Compared with NC group, levels of nf-kb and il-6 in HF group increased significantly (P<0.01), and levels of nf-kb and il-6 in CE group also decreased significantly (P<0.05). Compared with HF group, nf-kb and il-6 levels in HE group were significantly reduced (P<0.05). (4) Compared with the NC group, the II values of bclin-1 and LC3 in the HF group decreased significantly, but there was no significant difference, while the p62 values increased significantly (P<0.05). The II values of bclin-1 and LC3 in the CE group decreased significantly, while the p62 values increased significantly, but there was no significant difference. Compared with HF group, bclin-1 and LC3 II values in HE group increased significantly (P<0.05), and p62 values decreased significantly (P<0.01). Conclusion: long-term aerobic exercise can improve the autophagy activity of testicular tissue of obese rats with high-fat diet, further inhibit the expression of inflammatory factors, and improve the level of testicular tissue inflammation.

Aerobic exercise; Autophagy; Inflammation; High fat diet; Obese

1007―6891（2021）06―0022―04

10.13932/j.cnki.sctykx.2021.06.06

G804.7

A

2020-03-09

2020-03-24