朱澤，俞立峰，朱偉東

腦出血是由非外傷性腦實(shí)質(zhì)內(nèi)血管破裂導(dǎo)致的出血，具有較高的死亡率和發(fā)病率，其中17%～55%的患者為急性腦出血，成為威脅人類健康及生活質(zhì)量的重大疾病之一。腦出血患者發(fā)病較為復(fù)雜，主要與腦血管的病變有關(guān)，與高血脂、糖尿病、高血壓、血管老化及吸煙等密切相關(guān)?；颊叱３Ｔ谇榫w激動(dòng)、費(fèi)勁用力時(shí)突然發(fā)病，1個(gè)月內(nèi)病死率高達(dá)40%，幸存者中多數(shù)留下不同程度的運(yùn)動(dòng)障礙、認(rèn)知障礙或語(yǔ)言吞咽障礙等后遺癥。神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子受體p75（p75NTR）為腫瘤壞死因子受體超家族成員之一，為跨膜蛋白。研究表明神經(jīng)p75NTR可增加細(xì)胞凋亡，加重病情的發(fā)展[1]。LINGO-1屬于一種Nogo受體作用蛋白，主要存在于含亮氨酸重復(fù)系列和免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域中，對(duì)髓鞘形成、神經(jīng)元活性具有重要作用[2]。血清微RNA-23a-3p（miR-23a-3p）是miRNA中的一員，廣泛調(diào)控機(jī)體各種生理和病理過(guò)程，在細(xì)胞分化中起重要作用[3]。本文分析p75NTR、LINGO-1、miR-23a-3p在腦出血中的表達(dá)及與病情嚴(yán)重程度的相關(guān)性，報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取浙江省諸暨市中醫(yī)醫(yī)院2018年5月至2020年5月收治的腦出血患者132例（腦出血組），其中男63例，女69例；年齡50～72歲，平均（58.0±14.0）歲。另選本院健康人80例作為健康組，其中男42例，女38例；年齡50～75歲，平均（59.4±12.5）歲。兩組一般資料差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均＞0.05）。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)，患者家屬均知情同意并簽署了知情同意書。

納入標(biāo)準(zhǔn)：符合腦出血診斷標(biāo)準(zhǔn)[4]，且經(jīng)顱腦CT掃描證實(shí)有出血灶，患者神經(jīng)功能發(fā)生缺損，伴有嘔吐、頭疼、血壓升高等癥狀。排除標(biāo)準(zhǔn)：伴有凝血功能障礙、感染性疾病者；心肺、肝腎等重要器官損傷；行激素、免疫抑制劑治療者；因顱內(nèi)畸形導(dǎo)致的腦內(nèi)出血者；蛛網(wǎng)膜下腔出血、出血性腦梗死者；患有感染性疾病者；既往有腦器質(zhì)行疾病者。

1.2 方法

1.2.1 p75NTR、miR-23a-3p檢測(cè) 采集研究對(duì)象清晨空腹靜脈血8 ml，以離心半徑8cm，轉(zhuǎn)速3000r/min，進(jìn)行10min離心處理，分離出上層血清，保存于－20℃冰箱中待用。采用Trizol法提取樣本RNA，使用Takara逆轉(zhuǎn)錄試劑盒行逆轉(zhuǎn)錄處理后獲得總cDNA，采用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物序列，啟動(dòng)PCR儀，反應(yīng)體系：0.4 l上下游引物、1 lcDNA模板、10 l SYBGreen，加蒸餾水至20 l。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性1 s、95℃5 s、60℃31 s，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，采用2－△△Ct方法計(jì)算出p75NTR、miR-23a-3p表達(dá)量。p75NTR上 游 引 物 序 列：5’-AACAAGACCTCATAGCCAGCA-3’，下游引物序列：5’-CAGGATGGAGCAATAGACAGG-3’；miR-23a-3p 上 游 引 物 序 列：5’-GCGATCACATTGCCAGGG-3’，下游引物 序 列：5’-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3’；內(nèi)參U6引物序列：上游：5’-CTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3’，下游：5’-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3’。

1.2.2 LINGO-1檢測(cè) 收集研究對(duì)象空腹靜脈血8 ml，將其置于離心管中，以12000r/min離心5min，取上清，于－20℃保存。取50 g蛋白加入2×SDS凝膠緩沖液，在95～100℃中加熱5～15 min使蛋白變性。之后將分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)膜、取模，4℃環(huán)境下在5%脫脂牛奶中固定、封閉處理時(shí)間1 h，用封閉液稀釋一抗后加入洗滌液，待吸盡封閉液后加入稀釋好的一抗，緩慢搖動(dòng)孵育1～2h后加入洗滌液，搖動(dòng)5min，吸完后重復(fù)加入，洗滌5min 3次。吸進(jìn)洗滌液后加入用封閉液稀釋好的二抗，緩慢搖動(dòng)孵育1～2 h后加入洗滌液，再次連續(xù)洗膜5min 3次。定量分析蛋白表達(dá)情況，以GAPDH為內(nèi)參。

1.2.3 嚴(yán)重程度評(píng)估 采用美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院腦卒中評(píng)分量表（NIHSS）評(píng)估病情嚴(yán)重程度，重度：NIHSS＞15分，肌力為0～Ⅰ級(jí)，患者出現(xiàn)意識(shí)重度障礙。中度：NIHSS5～15分，肌力為Ⅱ～Ⅲ級(jí)，出現(xiàn)中度意識(shí)障礙。輕度：NIHSS1～4分，肌力在Ⅲ級(jí)以上，患者意識(shí)清楚。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法 采用SPSS26.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表達(dá)，多組比較采用方差分析，兩組比較采用獨(dú)立樣本 檢驗(yàn)；危險(xiǎn)因素分析采用二分類多因素Logistic回歸模型分析；相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 健康組和腦出血組p75NTR、LINGO-1、miR-23a-3p水平比較腦出血組p75NTR、LINGO-1、miR-23a-3p水平高于健康組（均＜0.05），見表1。

表1 健康組和腦出血組p75NTR、LINGO-1、miR-23a-3p水平比較

2.2 不同腦出血嚴(yán)重程度患者p75NTR、LINGO-1、miR-23a-3p水平比較 重度腦出血患者32例，中度腦出血患者44例，輕度腦出血患者56例。隨著腦出血嚴(yán)重程度的加重，p75NTR、LINGO-1、miR-23a-3p的升高加?。ň?.05），重度腦出血＞中度腦出血＞輕度腦出血患者（均＜0.05）。見表2。

表2 不同腦出血嚴(yán)重程度患者p75NTR、LINGO-1、miR-23a-3p水平比較

2.3 影響腦出血嚴(yán)重程度的多因素分析 將腦出血發(fā)生作為因變量，將p75NTR、LINGO-1、miR-23a-3p作為自變量，納入二分類多因素Logistic回歸模型分析，結(jié)果顯示p75NTR、LINGO-1、miR-23a-3p為影響腦出血嚴(yán)重程度的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（均＜0.05），見表3。

表3 影響腦出血嚴(yán)重程度的多因素分析

2.4 p75NTR、LINGO-1、miR-23a-3p之間相關(guān)性分析 p75NTR與LINGO-1呈正相關(guān)（=0.479＜0.05），p75NTR與miR-23a-3p呈正相關(guān)（=0.388，＜0.05），LINGO-1與miR-23a-3p呈正相關(guān)（=0.361＜0.05）。

3 討論

腦出血的發(fā)生是由腦血管病變引起的，當(dāng)血流流入腦實(shí)質(zhì)中，破壞腦實(shí)質(zhì)正起血腦屏障破壞，影響患者預(yù)后[5]。

p75NTR屬于跨模型蛋白，在神經(jīng)細(xì)胞的分化、生存、凋亡中發(fā)揮著重要作用，其與細(xì)胞凋零有關(guān)，可以使體外培養(yǎng)的雪旺氏細(xì)胞、運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元、感覺神經(jīng)元和交感神經(jīng)元發(fā)生凋亡，下調(diào)或阻斷p75NTR表達(dá)可以減少凋亡[6]。本研究結(jié)果顯示，腦出血發(fā)病后，p75NTR表達(dá)明顯升高，且隨著病情的發(fā)展表達(dá)加劇。這表示p75NTR與腦出血患者的病情、嚴(yán)重程度存在一定聯(lián)系。

LINGO-1是一種重要的跨膜蛋白、腦內(nèi)神經(jīng)再生抑制因子，可以負(fù)向調(diào)節(jié)少突膠質(zhì)細(xì)胞分化、抑制神經(jīng)元生長(zhǎng)和髓鞘生成，其在神經(jīng)干細(xì)胞成熟過(guò)程中調(diào)節(jié)神經(jīng)元的凋亡[7]。研究表明，LINGO-1可以抑制軸突再生、少突膠質(zhì)細(xì)胞分化和髓鞘形成、神經(jīng)元存活[8]。本研究結(jié)果顯示，LINGO-1隨著腦出血的發(fā)生逐漸升高，且隨著病情的加重升高加劇。這表示LINGO-1與腦出血患者的病情、嚴(yán)重程度存在一定聯(lián)系。

miR-23a-3p是一種功能性miRNA，與多種炎癥疾病存在密切聯(lián)系[9-10]。miR-23a家族包括 miR-23a-5p和miR-23a-3p。miR-23a-3p在細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等生物學(xué)活動(dòng)中發(fā)揮著重要作用；此外，其在其他疾病治療中也發(fā)揮著重要作用。miR-23a-3p的異常表達(dá)與疾病的部分臨床特征有關(guān)，可以作為診斷相關(guān)疾病，預(yù)測(cè)疾病復(fù)發(fā)和預(yù)后的重要指標(biāo)。本研究結(jié)果顯示，miR-23a-3p在腦出血患者體內(nèi)升高，且隨著病情的加重逐漸升高。這表示miR-23a-3p與腦出血患者的病情、嚴(yán)重程度存在一定聯(lián)系。本研究還發(fā)現(xiàn)p75NTR、LINGO-1、miR-23a-3p三者間均呈正相關(guān)，提示著三者可能共同參與此病的發(fā)生進(jìn)展，但本研究并未深入分析其具體作用機(jī)制，還需后續(xù)研究進(jìn)一步分析驗(yàn)證。