王輝，周俊，馮奕

男性不育發(fā)病率近年來呈上升趨勢[1]。microRNA（miRNA）是一系列單鏈非蛋白編碼小RNA分子，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)，可游離于體液中[2]。血清、胸腹水等體液miRNA已顯示其作為疾病診斷生物標(biāo)志的巨大潛能。同樣精漿miRNA在生殖疾病病因?qū)W研究方面和生殖遺傳研究領(lǐng)域也具有諸多優(yōu)勢，精漿miR-141表達(dá)與精子的發(fā)生和形成有關(guān)[3]。本研究通過觀察miR-141-5p在特發(fā)性少精子癥和無精子癥中的表達(dá)，為臨床診治提供新的一種分子標(biāo)志物，報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 參照WHO《人類精液檢查與處理實(shí)驗(yàn)室手冊》（第5版）標(biāo)準(zhǔn)，選擇特發(fā)性少精癥（精子濃度＜15×106/ml和精子總數(shù)＜39×106/一次射精）37例，年齡25～39歲，平均（32.1±4.4）歲；特發(fā)性無精癥（精液3 000 r/min離心15 min沉淀物中沒有精子）29例，年齡26～42歲，平均（31.5±6.7）歲。每例患者精液均常規(guī)分析3次以上，每次檢測間隔2個(gè)月；排除精液量異常、血精、液化不良、畸形精子癥、精液白細(xì)胞數(shù)≥1×106/ml以及高熱病史、自身免疫性疾病和接觸化學(xué)及放射性物質(zhì)的相關(guān)職業(yè)者。另外選擇同期因女方不孕，男方生育能力評估正常的健康男性30例，設(shè)為正常對照組，年齡25～39歲，平均（30.2±5.4）歲。3組年齡結(jié)構(gòu)、身體基礎(chǔ)等方面具有可比性，所有對象均簽署知情同意書并經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)同意。

1.2 標(biāo)本采集方法 依WHO要求，禁欲3～7d，排小便，并洗凈雙手和陰莖，再以0.1 mg/ml新潔爾滅對外尿道口消毒，手淫法收集全部精液于干燥消毒的精液釆集器內(nèi)，置37℃多維混勻恒溫箱，待充分液化后行精液常規(guī)分析，3 000 r/min離心15min，取精漿1～2ml，置－80℃冰箱保存。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 精液常規(guī)質(zhì)量參數(shù)分析 用北京偉力計(jì)算機(jī)輔助精子分析系統(tǒng)（CASA），在帶有加熱37℃載物臺的顯微鏡下用已預(yù)熱和已校正的高精度雙池網(wǎng)格精子計(jì)數(shù)板分析精子濃度和前向運(yùn)動(dòng)精子百分率，雙池檢測結(jié)果在95%CI內(nèi)方可判定有效。精子存活率采用低滲膨脹實(shí)驗(yàn)（HOS），精子形態(tài)采用改良Diff-Quick染色法，試劑由BASO公司生產(chǎn)并提供，各標(biāo)本由不同的兩人平行測定2次，取平均值，兩次結(jié)果偏倚≥10%重新實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 精漿游離microRNA的提取（1）預(yù)處理，取200 l液化后精漿加入2 l 100 g/ml蛋白酶K（美國Sigma公司）于37℃水浴箱1 h后，再加入250 l 1×TRI-reagent buffer和0.018 g PEG20000（美國Sigma公司）充分混勻，于室溫下放置15min，然后12000r/min，4℃離心10 min，取上清液用于TRIzol法提取RNA。（2）TRIzol法提取RNA，取200 l預(yù)處理的精漿加入0.75ml TRIzol（美國Invitrogen公司）中充分均勻，將勻漿液倒入1.5 ml離心管中，再依次加入氯仿、異丙醇及95%乙醇，獲得總RNA。（3）提取效率評估，取2 l RNA溶液，加98 l水，混勻后經(jīng)DU800紫外分光光度計(jì)（美國Beckman公司）測定A260/A280比值，1.8～2.0提示無DNA及蛋白質(zhì)污染。

1.3.3 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)RTPCR（1）cDNA的合成：按照TaqManReverse Transcription Buffer 1.50 l，RNase Inhibitor 20 U/l 0.19 l，Nucleasefreewater4.16 l。15 l逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系：RT master mix 7 l，total RNA 5 l，RT primer 3 l。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件：16℃30 min；42℃30 min；85℃5 min；4℃。（2）miR-141-5p及內(nèi)參U6 snRNA擴(kuò)增：根據(jù)TaqMan MicroRNA Assays（ABI公司）提供的引物及探針進(jìn)行擴(kuò)增，20 l PCR反應(yīng)體系：TaqMan Universal PCR Master Mix II 10.00 l，Nuclease-free water 7.67 l，TaqMan Small RNA Assay（20×）1 l，ProductfromRTreaction1.33 l。PCR反應(yīng)條件：50℃2min；95℃10min；95℃15 s；60℃60 s；40次，儀器用美國Stratagene公司Mx3000P型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀。

1.3.4 結(jié)果計(jì)算 精漿miR-141-5p表達(dá)量采用相對定量2-Ct方法Ct=CTmiR-141-5p－CTU6snRNACt=Ct不育患者－Ct正常對照。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組比較采用 檢驗(yàn)，多組比較采用方差分析，多重比較采用LSD法；診斷效能分析采用受試者操作特征（ROC）曲線。＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組精液常規(guī)主要質(zhì)量參數(shù)比較各組精子濃度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.05），其他各質(zhì)量參數(shù)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均＞0.05），見表1。

表1 各組精液常規(guī)主要質(zhì)量參數(shù)比較

2.2 各組精漿miR-141-5p的表達(dá) 各組精漿miR-141-5p的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（=12.224＜0.05）。與正常對照相比，特發(fā)性少精癥和特發(fā)性無精癥精漿miR-141-5p表達(dá)顯著增高（=4.628、4.767，均＜0.05），特發(fā)性無精癥與特發(fā)性少精子癥間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（=2.213＜0.05），見封三彩圖3。

2.3 精漿miR-141-5p對特發(fā)性少精癥和特發(fā)性無精癥的臨床價(jià)值miR-141-5p診斷特發(fā)性無精癥曲線下面積為0.920（95%0.855～0.984），當(dāng)選擇最佳臨界值4.93時(shí)，其診斷敏感性為93.1%，特異性為76.7%。miR-141-5p診斷特發(fā)性少精癥曲線下面積為0.879（95%0.809～0.948），當(dāng)選擇最佳臨界值5.36時(shí)，其診斷敏感性為96.3%，特異性為72.9%。見封三彩圖4～5。

3 討論

不育癥與心血管疾病、腫瘤已成為21世紀(jì)三大健康問題[4]。在我國，有15%～20%的育齡夫婦不能生育，男性因素約占50%[5]。男性不育致病原因復(fù)雜，開展的相關(guān)研究特別是微觀領(lǐng)域的研究尚很缺乏。近年來，世界各地科研工作者和臨床醫(yī)生已在分子領(lǐng)域?qū)δ行圆挥Y進(jìn)行探索并取得了一定進(jìn)展。

microRNA廣泛存在于人類的血液、尿液、唾液、痰液、精液、胸腹水、羊水及乳汁等體液中，在疾病的診斷和預(yù)后方面已經(jīng)顯示了其獨(dú)特的應(yīng)用價(jià)值。miRNA在精液中也非常的豐富，并且穩(wěn)定存在[6-7]，前期研究也表明，一些miRNA分子在男性不育中有相當(dāng)?shù)呐R床價(jià)值[8-9]。有研究發(fā)現(xiàn)，Dicer酶缺陷的老鼠，其生精小管內(nèi)含有的圓形精子細(xì)胞數(shù)量較少，甚至還有一些異常的延伸精子細(xì)胞，延伸精子細(xì)胞通常表現(xiàn)出形態(tài)畸形和運(yùn)動(dòng)力低下等特點(diǎn)，這些因素均可以增加不育癥的發(fā)生率，因此miRNA可以作為一個(gè)關(guān)鍵因素決定生殖細(xì)胞的數(shù)量及功能。miR-141是miR-200家族成員之一，主要參與上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）、增殖、遷移、侵襲及耐藥等多種細(xì)胞過程。miR-141-5p屬于miR-141-5基因家族一員，參與細(xì)胞周期、凋亡的調(diào)控，與精子的發(fā)生、凋亡關(guān)系密切[10]。本研究發(fā)現(xiàn)特發(fā)性少精癥、特發(fā)性無精癥患者精漿miR-141-5p表達(dá)上調(diào)，與對照組相比有顯著性差異。miR-141-5p對特發(fā)性少精子癥和特發(fā)性無精癥均有很好的診斷價(jià)值分別為0.879（95%0.809～0.948），0.920（95%0.855～0.984），并且兩者敏感性和特異性均較高。這提示miR-141-5p功能表達(dá)與精子的發(fā)生和形成有關(guān)，可作為診斷特發(fā)性少精癥和特發(fā)性無精癥較好的分子標(biāo)志物。