王秋平，宋端慧，藏潔，楊金香，齊云云，韓博

(石河子大學(xué)藥學(xué)院，石河子 832002)

宮頸炎和非特異性宮頸炎的研究屬于疾病病因不明的性傳播感染醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域[1]。嚴(yán)重的宮頸炎會導(dǎo)致不孕和異位妊娠[2]。研究表明，宮頸炎是病原體侵入損傷部位所致，常見病原體包括沙眼衣原體、淋病奈瑟球菌、葡萄球菌、鏈球菌以及大腸埃希菌等[3]。臨床上的治療藥物主要是抗菌藥物。由于抗生素濫用和假陽性診斷可能導(dǎo)致耐藥病原體的出現(xiàn)[2]，尋找既有抗菌又有抗炎作用的中藥進(jìn)行替代治療已成為一種策略。

沒食子是殼斗科植物沒食子樹(QuercusinfectoriaOliv.)幼枝上的干燥蟲癭，由沒食子峰科昆蟲沒食子蜂(Cynipsgallae-tinctoriaeOliv.)幼蟲寄生而形成的。沒食子可治療濕性白帶過多、子宮出血、瀉痢不止等[4]。中藥制劑“沒食子栓”(沒食子是主藥)治療陰道炎和宮頸炎的效果顯著。沒食子含沒食子鞣質(zhì)50%～70%，其次為沒食子酸(2%～4%)及丙酸、樹脂等[5]。沒食子鞣質(zhì)可通過調(diào)控基因表達(dá)、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、血管舒張、調(diào)節(jié)細(xì)胞信號通路等[6-7]發(fā)揮抗炎、抗菌、抗氧化等作用[8-11]。但藥物溶液如婦炎潔，以陰道給藥的方式進(jìn)入體內(nèi)后，極易流出，不利于藥物的吸收。如何改進(jìn)傳統(tǒng)劑型、開發(fā)新制劑，以延長藥物在病變部位的作用時間，是實現(xiàn)婦科中藥制劑臨床合理用藥亟待解決的問題。

溫敏凝膠是指以溶液狀態(tài)給藥后，利用高分子材料對外界溫度的響應(yīng)發(fā)生相轉(zhuǎn)變，由液態(tài)轉(zhuǎn)化為非化學(xué)交聯(lián)半固體凝膠的制劑。在臨床上，溫敏凝膠可用于婦科陰道給藥[12]。本研究擬制備反向溫敏凝膠，以液態(tài)形式存在體外，進(jìn)入體內(nèi)后受熱貼于陰道內(nèi)壁，方便給藥的同時，可減少藥液的流出，延長藥物在病變部位的保留時間，提高生物利用度[13]。在此基礎(chǔ)上，為了增強(qiáng)凝膠系統(tǒng)的緩釋作用，筆者加入了納米顆粒的制備。研究表明，在陰道給藥系統(tǒng)中，納米顆粒在生物粘附、易于滲透黏膜和控制釋放方面具有優(yōu)勢[14]。本研究探討將沒食子多酚納米顆粒-溫敏凝膠復(fù)合制劑應(yīng)用于陰道，以評價治療宮頸炎的可行性，為宮頸炎的新藥開發(fā)提供參考，同時擴(kuò)展沒食子的應(yīng)用范圍。

1 材料與方法

1.1儀器與設(shè)備 Waters HPLC-MS 純化制備系統(tǒng)(美國Waters公司，配有HPLC泵、二元梯度模塊、樣品管理器、紫外-可見檢測器、QDa 檢測器以及Mass Lynx 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng))；掃描電子顯微鏡(SEM，evo18，德國蔡司公司)；超聲波細(xì)胞破碎儀(JY92-IIN，上海冠森生物科技有限公司)；黏度計(DV-C，美國博勒飛Brookfield公司)；酶標(biāo)儀(LL007L67xMark，上海艾研生物科技有限公司)。

1.2藥品與試劑 普朗尼克F-127(批號：04835564，相對分子質(zhì)量12 600，美國Sigma公司)；乙腈(批號：01259913，色譜純，美國Fisher公司)；甲酸(批號：01101164，質(zhì)譜級，上海麥克林有限公司)；消糜栓(批準(zhǔn)文號：國藥準(zhǔn)字Z20025663，規(guī)格：3 g，7粒，通化萬通藥業(yè)股份有限公司)；福林酚試劑(F-C試劑，批號：011003211，規(guī)格：500 mL，山東西亞化學(xué)工業(yè)有限公司)；水合氯醛(批號：04548971，規(guī)格：100 g，含量：99%，山東西亞化學(xué)工業(yè)有限公司)；聚己內(nèi)酯(PCL，批號：S26795，規(guī)格：100 g，上海源葉生物科技有限公司)；海藻酸鈉(批號：S11053，規(guī)格：100 g，上海源葉生物科技有限公司)；泊洛沙姆407(P407，批號：S30692，規(guī)格：500 g，上海源葉生物科技有限公司)；泊洛沙姆188(P188，批號：S25322，規(guī)格：100 g，上海源葉生物科技有限公司)；羥丙基甲基纖維素(HPMC，批號：S14175，規(guī)格：500 g，上海源葉生物科技有限公司)；磷酸鹽緩沖液(PBS，pH值7.4，批號：R20857，規(guī)格：500 mL，上海源葉生物科技有限公司)；沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液(批號：B20851，規(guī)格：1 m L，1000 μg·mL-1，上海源葉生物科技有限公司)；碳酸鈉(批號：S24152，規(guī)格：500 g，含量≥99.8%，上海源葉生物科技有限公司)，苯酚(批號：S30715，規(guī)格：500 g，含量≥99.0%，上海源葉生物科技有限公司)；阿拉伯樹膠粉(批號：S11034，規(guī)格：500 g，上海源葉生物科技有限公司)；大鼠腫瘤壞死因子α(TNF-α)ELISA檢測試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司，批號：201805239)；大鼠表皮生長因子受體(EGFR)酶鏈免疫吸附測定(ELISA)檢測試劑盒(批號：201804234，上海酶聯(lián)生物科技有限公司)；大鼠表皮生長因子(EGF)ELISA檢測試劑盒(批號：2018029322，上海酶聯(lián)生物科技有限公司)。沒食子藥材于2016年3月購自廣東省廣州市，由石河子大學(xué)藥學(xué)院韓博教授鑒定，拉丁名是QuercusinfectoriaOliv.，全藥材入藥，標(biāo)本(No.20160305)置通風(fēng)干燥處，防潮，保存于新疆特色植物藥資源重點實驗室藥劑組。

1.3動物 SD大鼠(潔凈級，雌性，未孕)，體質(zhì)量(180±20) g，購買于新疆實驗動物研究中心，生產(chǎn)許可證號：SCXK(新)2011-0004，動物設(shè)施使用證號：SCXK(新)2011-0004。所有大鼠均置于可控環(huán)境中：溫度(22±2) ℃，濕度(50±10)%，光照，12 h光/暗循環(huán)。動物實驗進(jìn)行之前，給予標(biāo)準(zhǔn)顆粒適應(yīng)性飼養(yǎng)大鼠約1周。在實驗中盡一切努力減輕動物的痛苦。

1.4從沒食子中提取多酚類化合物 精確稱取50.0 g干燥的沒食子粉末，通過水回流提取3次，每次加入純化水2 L，提取液分別用石油醚、二氯甲烷和乙酸乙酯連續(xù)萃取3次，利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將各萃取液分別進(jìn)行濃縮，將乙酸乙酯部分的濃縮液作為樣品，以聚酰胺為吸附劑，用乙醇-水梯度(0%，10%，15%，20%，25%，30%，40%，60%，100%)進(jìn)行洗脫。所得部分分別濃縮、標(biāo)記、避光密封保存。

1.5沒食子多酚成分的HPLC-MS分析 采用HPLC-MS分析沒食子中多酚的成分，HPLC-MS條件為：C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相A為0.2%甲酸溶液，流動相B為色譜乙腈；梯度洗脫程序設(shè)置為0～8 min(93% A)，8～35 min(93%→80% A)，35～50 min(80%→70% A)，50～60 min(70%→0% A)；濃度：1 mg·mL-1；流速：1 mL· min-1；進(jìn)樣量：20 μL；光譜條件為220 nm。

ESI-MS 條件：負(fù)離子模式；掃描范圍：100～1250(m/z)；源溫度：150 ℃；干燥氣溫度：250 ℃；毛細(xì)管電壓2.64 kV；錐孔電壓50 V；碰撞電壓45 V；去溶劑氣體：N2，800 L·h-1。

1.6沒食子納米顆粒(NPs)的制備 利用納米沉淀法將沒食子多酚制備成聚合物納米。分別準(zhǔn)確稱取15 mg海藻酸納和F-127，各自加入純化水3 mL使其完全溶解；將沒食子多酚112.5 mg加入純化水3 mL中，充分混合。在磁力攪拌(700 r·min-1)下，將海藻酸納、F-127、沒食子多酚溶液和純化水7.5 mL混合均勻，利用注射器(5號針頭)將溶于二氯甲烷3 mL中的聚己內(nèi)酯(0.09 g)溶液以1 mL· min-1成滴狀地加入上述混合物中。將所得的膠體懸浮液在室溫下攪拌(500 r·min-1)蒸發(fā)2 h以去除二氯甲烷。將除去二氯甲烷的溶液以超聲波細(xì)胞破碎儀超聲3次(20 kHz)，每次15 min。然后將該納米顆粒溶液以1 1180×g的速度離心5 min，分離上清液和沉淀；用純化水洗滌沉淀3次(2795×g，3 min)，以去除未形成納米顆粒的沒食子多酚。將制備的納米粒利用冷凍干燥機(jī)進(jìn)行分散凍干，并收集用于后續(xù)的實驗。同時，將分離出的上清液和清洗3次沉淀的上清液收集待用。

1.7負(fù)載納米顆粒的溫敏凝膠(NPs-凝膠)的制備 分別準(zhǔn)確稱取0.4 g HPMC、1.25 g P188和10.5 g P407加入50 mL純化水中，用磁力攪拌器將混合物輕輕攪拌至完全溶解，然后在4 ℃下儲存在冰箱中，直到獲得澄清的均勻溶液。在凝膠中加入NPs，混合均勻后存儲于4 ℃冰箱中以便用于后續(xù)實驗。

1.8表征

1.8.1掃描電子顯微鏡(SEM)的表征和Zeta電位的測定 將制備的NPs以及凝膠依次進(jìn)行SEM的表征。借用馬爾文粒度儀，將NPs-凝膠進(jìn)行Zeta電位的測量，以分析評價其膠體穩(wěn)定性。

1.8.2測定NPs-凝膠的膠凝溫度、膠凝時間以及黏度值 將NPs-凝膠溶液放置在燒杯中，并將其置于恒溫加熱磁力攪拌器中，升高溫度的速度是每分鐘1 ℃，記錄磁珠停止轉(zhuǎn)動的時間為膠凝時間，溫度記錄為凝膠溫度。用黏度計測定膠凝溫度下NPs-gel的黏度值。

1.8.3納米顆粒包封率(EE%)的測定 采用福林酚(F-C)法測定并計算納米顆粒的包封率[15]，具體方法如下。首先用沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。將0，0.05，0.10，0.20，0.30，0.50 mL沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液(0.05 mg·mL-1)加入6個試管中，依次標(biāo)號為1—6。每根試管中加入蒸餾水至0.5 mL，然后加入0.5 mL的F-C試劑(1 mol·L-1)。渦旋混合器完全振蕩混勻后，將碳酸鈉(Na2CO3)4 mL溶液(50 mg·mL-1)溶解于各試管中。2～8 min后，將離心管固定在裝有純化水800 mL的燒杯中，燒杯置于540 W的微波爐中加熱6 min。將沒有加入沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的試管溶液設(shè)置為空白，測定每根試管中溶液在765 nm波長處的吸光度值。以標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度為縱坐標(biāo)，以相應(yīng)的沒食子酸濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

測定“1.6”項中收集的所有上清液中沒食子多酚的含量。將0.005 mL上清液、0.495 mL純化水和0.5 mL F-C試劑混合在一起，再加入Na2CO3溶液4 mL(50 mg·mL-1)混合均勻。2～8 min后，將離心管固定在裝有800 mL純化水的燒杯中，燒杯置于540 W的微波爐中加熱6 min，然后測定釋放藥物溶液在765 nm處的吸光度值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和該上清液在765 nm處的吸光度值，按公式(1)計算包封率(EE%)。

EE%=1-C1×V1/m公式(1)

C1為根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算的上清液濃度(mg·mL-1)，V1為上清液體積(mL)，m是制備NPs時加入沒食子多酚的總質(zhì)量(mg)。

R%=(C1×V2)/(m×EE%) 公式(2)

C2為標(biāo)準(zhǔn)曲線計算的釋放多酚濃度(mg·mL-1)，V2是釋放液的體積(mL)，m是制備NPs-gel時加入沒食子多酚的總質(zhì)量(mg)。

1.9動物實驗

1.9.125%苯酚膠漿和消糜栓膠漿的配制 取苯酚6.25 g、阿拉伯樹膠粉18.75 g，加純化水至25.00 mL，配成25%的苯酚膠漿。以體表面積法計算大鼠給藥劑量。正常人對于消糜栓的常用劑量是每天3 g(1粒)，用人的常用劑量乘以人與鼠的換算系數(shù)0.018(此時大鼠的標(biāo)準(zhǔn)體質(zhì)量為200 g)，則大鼠的給藥劑量為270 mg·kg-1·d-1。具體配制如下：取8.30 g消糜栓加熱溶解，加阿拉伯樹膠粉45.00 g，加純化水至25.00 mL，配成0.33 g·mL-1的陽性藥。

1.9.2實驗大鼠宮頸炎模型的建立與給藥 將大鼠隨機(jī)分為6組，每組6只即對照組、陽性藥組、NPs-凝膠組、物理混合物組、空白凝膠組和模型組。采用25%苯酚膠漿誘導(dǎo)大鼠宮頸炎模型。除對照組外，其他大鼠均陰道給藥[用1 mL注射器(針頭換為灌胃針)插入陰道約2 cm處]，每只給予25%苯酚膠漿0.15 mL，3 d一次，共4次，12 d；對照組大鼠則給予等量0.9%氯化鈉溶液替代25%苯酚膠漿。每次給藥結(jié)束后，將每只大鼠倒吊5 min，防止藥液流出。

造模結(jié)束后，不同組接受不同的治療：陽性藥組每天給予270 mg ·kg-1的消糜栓膠漿(0.33 g·mL-1，每只0.15 mL)；NPs-凝膠組給予NPs-凝膠(每只0.15 mL，多酚含量約為30 mg)；物理混合組每只給予空白凝膠和游離沒食子多酚的物理混合物0.15 mL(多酚含量約為30 mg)；空白凝膠組給予相同體積的空白凝膠；對照組和模型組采用相似的陰道給藥途徑給予等體積0.9%氯化鈉溶液。所有大鼠采取陰道給藥的方式連續(xù)給藥7 d，給藥的同時除對照組外其余大鼠繼續(xù)給予25%苯酚膠漿。最后一次給藥后24 h處死動物，收集宮頸組織并計算臟器指數(shù)。

1.9.3一般情況觀察 從造模當(dāng)天開始，觀察并記錄大鼠宮頸口和陰道分泌物，評分標(biāo)準(zhǔn)見表1[16]，查看大鼠是否出現(xiàn)與空白組大鼠不一樣的現(xiàn)象，如扎堆、少動、豎毛等。

表1 外陰紅腫和陰道分泌物評分標(biāo)準(zhǔn)

外陰紅腫和陰道分泌物評分標(biāo)準(zhǔn)具體如下：

根據(jù)外陰紅腫面積的大小分為：①正常：外陰及陰道口黏膜無充血、紅腫(0分)；②輕度紅腫：紅腫占外陰面積小于1/3(1分)；③中度紅腫：紅腫占外陰面積的1/3～2/3(2分)；④重度紅腫：紅腫占外陰面積大于2/3(3分)。

1、完善線路另一側(cè)的斷路器，給線路配置一套光纖差動保護(hù)。光纖差動保護(hù)由于其保護(hù)原理與過度電阻無關(guān)，且動作速度快，可以有效快速切除高阻接地情況下的故障；

根據(jù)陰道分泌物占自制醫(yī)用棉簽面積的大小分為：①正常：無自制醫(yī)用棉條未見分泌物(0分)；②少：陰道分泌物占自制醫(yī)用棉條面積小于1/3(1分)；③中：陰道分泌物占自制醫(yī)用棉條面積的1/3～2/3(2分)；④多：陰道分泌物占自制醫(yī)用棉條面積大于2/3(3分)。

1.9.4組織病理學(xué)檢查 從每組隨機(jī)取出3個宮頸組織樣本，置于10%甲醛溶液中進(jìn)行固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋，縱向切片，厚5 μm，進(jìn)行HE染色。在顯微鏡下進(jìn)行觀察并分析。

1.9.5大鼠宮頸組織腫瘤壞死因子α(TNF-α)、表皮生長因子(EGF)和表皮生長因子受體(EGFR)指標(biāo)檢測 分析大鼠血清中的TNF-α、EGF和EGFR的表達(dá)情況，根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行操作。

2 結(jié)果

2.1LC-MS分析沒食子多酚成分的測定結(jié)果 通過聚酰胺柱對沒食子乙酸乙酯部位化合物的分離，得到了一些特殊的化合物。經(jīng)LC-MS分析，60%乙醇-水梯度部分主要化合物的信息如圖1所示。根據(jù)課題組之前的研究，溶液中所含的主要化合物依次是雙沒食子酸(m/z321)、三-O-沒食子?；咸烟?m/z635)和四-O-沒食子?；咸烟?m/z787)。在選定的色譜條件下，雙沒食子酸、三-O-沒食子酰基葡萄糖和四-O-沒食子?；咸烟堑谋Ａ魰r間分別為24.59，27.36，30.21，31.15，32.49，37.45和38.78 min。由于沒食子?；谄咸烟巧系慕Y(jié)合位點不同，所以，核質(zhì)比相同的同一類化合物有多個保留時間，結(jié)構(gòu)上也因為沒食子?；Y(jié)合位點的不同而有差異。用峰面積歸一化法測定的3種化合物的含量分別為23.42%(m/z321)，33.83%(m/z635)，31.71%(m/z787)。

2.2表征

2.2.1SEM的觀察和分析 依次將凝膠和NPs進(jìn)行了掃描電子顯微鏡的觀察。如圖2所示，圖2b是NPs-gel的圍觀形貌，NPs-gel具有多空隙網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，且空隙之間相互連通，孔徑在2～20 μm范圍內(nèi)。圖2c是NPs的SEM圖，從圖中可以看出，制備的納米顆粒粒徑是(53.20±7.60)nm，且粒徑大小均一。

2.2.2Zeta電位的分析結(jié)果 Zeta電位是指剪切面的電位，是表征膠體分散體系穩(wěn)定性的重要指標(biāo)。經(jīng)馬爾文粒度分析儀的測定，如圖2d所示，沒食子多酚、NPs、空白凝膠、物理混合物和NPs-凝膠的Zeta電位值分別為(-1.66±0.12)，(-15.83±0.21)，(-63.43±6.09)，(-1.04±0.12)和(-94.93±12.17) mV。與NPs-凝膠的Zeta電位值比較，其他各組的數(shù)據(jù)均差異有統(tǒng)計學(xué)意義。NPs-凝膠的Zeta電位絕對值在60 mV以上，表示其有較好的膠體穩(wěn)定性。換言之，將沒食子多酚制成NPs 后，可以提高其膠體穩(wěn)定性，在凝膠中加入納米顆?？梢赃M(jìn)一步提高整個體系的膠體穩(wěn)定性，這將為多酚的運(yùn)輸和儲存帶來了便利。

A.LC-MS分析；B.HPLC分析；峰分布：峰1.間-雙沒食子酸或?qū)?二沒食子酸(m/z 321)；峰2～5. 三-O-沒食子?；咸烟?m/z 635)；峰6～7.四-O-沒食子酰基葡萄糖(m/z 787)。

2.2.3NPs-凝膠的膠凝溫度、膠凝時間以及黏度值的測定和分析 實驗結(jié)果表明，NPs-凝膠的凝膠溫度為(33.33±0.47) ℃，凝膠時間為(118±17) s。黏度計的測量結(jié)果顯示，從20 ℃到32 ℃，隨著溫度的升高，NPs-凝膠的黏度值在150～220 mPa·s范圍內(nèi)波動且呈上升趨勢。當(dāng)溫度上升到33 ℃時，黏度值急劇上升，表明制備凝膠的內(nèi)部結(jié)構(gòu)變化，測定的黏度值是(1076.67±20.55)mPa·s-1。當(dāng)溫度低于33 ℃時，凝膠的黏度較低，主要是以液體狀態(tài)存在；當(dāng)溫度高于33 ℃時，NPs-凝膠溶液轉(zhuǎn)變?yōu)榘牍腆w凝膠狀態(tài)。

2.2.4NPs包封率的測量和分析 經(jīng)過實驗測量和計算，沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=112.564X+0.022，Y代表吸光度，X代表多酚濃度(mg·mL-1)(R2=0.996 7)。通過標(biāo)準(zhǔn)曲線方程和上清液中游離藥物在765 nm處的吸光度值，計算得到NPs的包封率為(14.94±2.52)%(n=3)。

2.2.5體外藥物釋放 如圖2e所示，沒食子多酚在前3 h內(nèi)迅速釋放，釋放3 h后累積釋放率是(98.44±1.68)%。比較之下，NPs-凝膠在釋放48 h時的累積釋放率是(13.81±1.47)%。結(jié)果表明，制備的NPs-凝膠相對于游離的沒食子多酚來說有緩釋的功能，這有利于延長藥物在體內(nèi)的作用時間，減少藥物的浪費(fèi)。

2.3沒食子反向溫敏凝膠對宮頸炎作用的動物實驗

2.3.1大鼠的一般情況和臟器指數(shù) 末次造模結(jié)束后，給予25%苯酚膠漿的大鼠陰道口紅腫，有黏性分泌物流出，毛色變差，食欲下降。每次給予造模藥時，實驗大鼠均表現(xiàn)出抵抗掙扎的行為，給藥后，大鼠喜靜，成群待在籠子的一個角落里，活動明顯減少，由于苯酚對黏膜有強(qiáng)烈的腐蝕作用，導(dǎo)致大鼠在接受了苯酚膠漿后可出現(xiàn)全身輕微顫抖，這是大鼠宮頸及周邊部位疼痛的反映；隨著造模時間的延長，大鼠陰道口有流血的現(xiàn)象。給予藥物治療后，陽性藥組、NPs-凝膠組以及沒食子多酚物理混合組的大鼠逐漸恢復(fù)了行動和飲食。與模型組比較，陽性藥組、NPs-凝膠組以及沒食子多酚物理混合組的大鼠陰道紅腫和陰道分泌物的情況逐漸好轉(zhuǎn)，紅腫逐漸消失，陰道分泌物逐漸減少甚至消失，單因素方差分析顯示差異有統(tǒng)計學(xué)意義；空白凝膠組與模型組的情況相似，紅腫和分泌物持續(xù)存在；NPs-凝膠組的大鼠情況較物理混合組更好(P=0.224，P=0.576)。具體結(jié)果見圖3A和3B。宮頸紅腫和分泌物結(jié)果表明，沒食子多酚在促進(jìn)創(chuàng)面愈合的同時有抗感染及提高免疫的作用。

通過解剖并稱量宮頸質(zhì)量，計算得到宮頸的臟器指數(shù)，具體結(jié)果見圖3C。數(shù)據(jù)顯示，正常組的宮頸臟器指數(shù)是(1.15±0.24)mg·g-1，模型組的臟器指數(shù)明顯升高[(1.84±0.26)mg·g-1](P<0.001)；與模型組比較，除空白凝膠組外，其他組的臟器指數(shù)均顯著性降低(P<0.01)；模型組與空白凝膠組的結(jié)果相似(P=0.586)，NPs-凝膠組與多酚物理混合組的結(jié)果相似(P=0.223)。表明沒食子多酚可以抑制宮頸臟器指數(shù)的增加，緩解宮頸充血水腫的情況，證明其對實驗性宮頸炎有保護(hù)作用。

2.3.2宮頸炎大鼠的組織病理學(xué)分析 對照組大鼠宮頸組織正常。模型組和空白凝膠組大鼠宮頸組織上皮厚度增加，角化層脫落，黏膜及其固有層充血水腫，較多炎細(xì)胞浸潤，腔內(nèi)有大量炎性滲出物及壞死組織。與模型組比較，陽性藥組、NPs-凝膠以及物理混合組的宮頸組織病變減輕，病變處的部分組織已經(jīng)開始修復(fù)，甚至接近正常；炎性細(xì)胞浸潤減輕，炎性滲出減少。提示沒食子多酚對實驗大鼠宮頸炎有一定療效，可加速修復(fù)宮頸黏膜上皮；將沒食子多酚制備成納米顆粒并負(fù)載到可逆溫敏凝膠中治療效果更加顯著。見圖4。

①與NPs-凝膠比較，t=13.272，11.255，4.009，P<0.001。

A.陰道紅腫評分；B.宮頸分泌物評分；C.臟器指數(shù)；①與模型組比較，t=-17.000，-12.649，-11.180，-7.050，P<0.001；②與模型組比較，t=-11.314，-8.367，-8.062，-5.721，P<0.001；③與模型組比較，t=-4.366，-3.939，P<0.001；④與模型組比較，t=-2.880，P<0.01；⑤與模型組比較，t=-1.992，P<0.05；⑥與物理混合組比較，t=-1.668，P<0.001。

2.3.3大鼠宮頸組織TNF-α、EGF和EGFR的表達(dá)水平 經(jīng)給藥治療后，與模型組比較，各治療組大鼠的TNF-α水平降低，逐漸接近于健康正常組大鼠的TNF-α水平，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；空白凝膠組的結(jié)果與模型組相似(P=0.263)，NPs-凝膠組的平均水平比沒食子多酚物理混合組更低，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.484)。相反，對于EGF和EGFR的表達(dá)水平來說，各治療組大鼠炎癥因子水平的表達(dá)較模型組逐漸增加，且均逐漸接近于健康正常組大鼠的水平，差異有統(tǒng)計學(xué)意義?？瞻啄z組的結(jié)果與模型組相似(EGF水平：P=0.878，EGFR水平：P=0.672)，NPs-凝膠組的平均水平比沒食子多酚物理混合組的更高，EGF水平的結(jié)果差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，但EGFR水平的結(jié)果差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.294)。如圖5。

3 討論

通過聚酰胺柱分離得到?jīng)]食子中特定的成分，該組分通過納米沉淀法成功制備納米顆粒，并將其負(fù)載到可逆溫敏凝膠中形成新的劑型。溫敏凝膠與納米顆粒相結(jié)合，在方便藥物傳送的同時，提高生物利用度，減少給藥次數(shù)，進(jìn)而解決患者依從性差的問題，增強(qiáng)療效。

為了實現(xiàn)緩釋效果，溫敏凝膠可以滯留足夠時間，但累計釋放度不高，后續(xù)實驗可在納米顆粒的粒徑、制備納米顆粒和溫敏凝膠的材料等方面出發(fā)，改進(jìn)和提高藥物的累計釋放度。對于給藥頻率，由于NPs-凝膠的載藥量和物理混合組游離沒食子多酚的含量相等，理論上應(yīng)減少給藥次數(shù)，但游離沒食子多酚溶液容易從大鼠體內(nèi)流出，考慮到藥物的有效性和安全性，本實驗暫將給藥頻次定為一天一次。對于更準(zhǔn)確的給藥頻次和給藥劑量的探究，需后續(xù)通過動物實驗檢測血藥濃度后確定。

實驗中用25%苯酚膠漿制備了大鼠宮頸炎模型，觀察沒食子多酚NPs-凝膠對實驗性宮頸炎大鼠的療效。給藥后，大鼠陰道的紅腫情況有所改善，分泌物減少，宮頸的腫大有所減輕。組織病理學(xué)結(jié)果表明，復(fù)合制劑使宮頸炎大鼠宮頸組織病變較模型組減輕，病變處組織已經(jīng)開始修復(fù)，甚至接近正常。TNF-α是一種重要的促炎性細(xì)胞因子，是免疫反應(yīng)的重要調(diào)節(jié)因子[16-17]，可促進(jìn)炎癥的發(fā)生、發(fā)展，不利于組織愈合。如圖5A所示，治療組TNF-α的表達(dá)降低，表明宮頸炎大鼠免疫粘附功能及細(xì)胞吞噬功能增強(qiáng)，即沒食子多酚可通過調(diào)節(jié)免疫功能而達(dá)到治愈的效果。另外，宮頸組織的EGF和EGFR水平均增加，說明沒食子多酚可刺激宮頸上皮細(xì)胞分泌EGF和EGFR，促進(jìn)宮頸鱗狀上皮細(xì)胞的增殖、分化，加速組織的愈合，其中以NPs-凝膠作用尤為顯著。

A.對照組；B.陽性藥組；C.凝膠+NPs組；D.物理混合組；E.空白凝膠組；F.模型組；箭頭的不同顏色表示：黑色表示上皮，紅色表示炎癥細(xì)胞，藍(lán)色表示脫落的角化層，綠色表示宮頸組織充血水腫，橘色表示壞死組織。

A.用ELISA法測定血清中TNF-α的蛋白水平；B.用ELISA法測定血清中EGF的水平；C.用ELISA法測定血清中EGFR的水平；①與模型組比較，t=-3.071，-4.479，-2.052，P<0.001；②與模型組比較，t=-2.128，P<0.01；③與模型組比較，t=6.540，6.159，7.084，P<0.001；④與模型組比較，t=6.534，P<0.01；⑤與物理混合組比較，t=3.841，P<0.01；⑥與模型組比較，t=7.273，5.928，4.226，P<0.001；⑦與模型組比較，t=3.010，P<0.05。

通過藥效學(xué)實驗可以看出，沒食子多酚NPs-凝膠可修復(fù)病變組織，下調(diào)TNF-α，刺激宮頸上皮細(xì)胞分泌EGF，并通過增加宮頸上皮EGF和EGFR表達(dá)，加速組織的愈合，有效抑制宮頸炎的發(fā)展。