神經病理性疼痛(neuropathic pain, NP)是一種由神經系統(tǒng)原發(fā)性損害和功能障礙所激發(fā)或引起的疼痛。研究表明，脊髓背角神經元和小膠質細胞（CNS 的常駐巨噬細胞）之間的分子和細胞相互作用是誘導和維持周圍神經損傷后NP 的重要因素。例如，外周神經損傷后，損傷同側背根神經節(jié)(dorsal root ganglia, DRG)中的巨噬細胞數(shù)量明顯增加，同時引起位于損傷側脊髓背角的小膠質細胞活化，導致疼痛加劇，如果用氯膦酸鹽耗竭全身的巨噬細胞后可以減輕疼痛癥狀。然而，由于這些研究并沒有在DRG 中進行，因此不能確定DRG 中巨噬細胞的貢獻。為此，該研究通過使用藥理學與化學遺傳學的方法，探究了DRG 中巨噬細胞在NP 中的作用，以及巨噬細胞與感覺神經元之間的相互作用。首先，研究人員構建了一款巨噬細胞Fas 誘導凋亡的小鼠(marophage Fas-induced apoptosis, MAFIA)，該小鼠在集落刺激因子1 受體(CSF1R)啟動子下游使FK結合蛋白二聚化因子AP20187 (AP)誘導的Fas 自殺基因表達，再通過AP 誘導該小鼠耗竭外周的巨噬細胞，并使用免疫染色觀察了轉錄因子PU.1 (Spi-1 proto-oncogene)、小膠質細胞/巨噬細胞特異性蛋白抗體(Ionized calcium binding adaptor molecule1,Iba1)和GFP，用于證實外周巨噬細胞的耗竭情況，然后通過熒光激活細胞分選 (fluorescence-activated cell sorting, FACS)檢測了巨噬細胞數(shù)量，發(fā)現(xiàn)AP注射停止后的第4 天，巨噬細胞減少的數(shù)量仍然明顯，直到第9 天后才恢復。這說明AP 引發(fā)的巨噬細胞消融在停止給藥后是可以恢復的。

該研究通過軸突切斷術建立選擇性神經損傷(spared nerve injury, SNI)模型，并在該神經損傷模型下對DRG 巨噬細胞的激活進行了研究。通過FACS 對表達趨化因子受體CX3CR1 的DRG 巨噬細胞進行定量分選發(fā)現(xiàn)：在手術后的第4 天(POD4)，造模側L4與L5的DRG 巨噬細胞數(shù)量開始較對側上升，并且這種巨噬細胞的上升在造模后至少持續(xù)4 周(POD28)；這表明DRG 巨噬細胞參與了NP 的發(fā)生與維持。為了進一步確定DRG 中損傷誘導的巨噬細胞擴增的起源，作者檢測了標志著巨噬細胞浸潤的趨化因子受體 CCR2，結果表明：CCR2+巨噬細胞在未受損小鼠的DRG 中同樣顯著增加，說明CCR2 并非浸潤巨噬細胞特異的標志物。于是，選定了Ki67 抗體對 CX3CR1+巨噬細胞進行染色，經FACS 分析顯示神經損傷后1 天(POD1)，同側受傷的 DRG 中 Ki67+CX3CR1+巨噬細胞的百分比與對側未受傷的 DRG 中的巨噬細胞沒有差異，而在第4 天時(POD4)，脊髓腰段中增殖的小膠質細胞(Ki67+CX3CR1+)與對側相比增加超過2 倍；因此得出結論：①CX3CR1+為非浸潤巨噬細胞特異標記物；②軸突切斷可誘導DRG 中巨噬細胞擴增。另外，在局部擴增的巨噬細胞來源上雖然不能排除浸潤，但該研究的觀點是駐留巨噬細胞增殖占主導地位。

為了確定 DRG 巨噬細胞的增加是否有助于NP 的發(fā)展，該研究選擇了 MAFIA 轉基因品系小鼠進行研究。首先，通過每日腹腔注射AP（5 次，10 mg·kg-1）進行誘導并消耗體內的巨噬細胞，注射后第1 天(POD1)出現(xiàn)機械痛閾的上調，且在消除巨噬細胞的過程中會導致小鼠的體重減輕。因此，在注射次數(shù)和注射劑量上進行了調整，并將注射的方式改為每日 AP 注射 3 次 （注射劑量為1.0 mg·kg-1）。在該方案下，AP 注射之后，雖然也會引起小鼠體重的減輕，但并不會影響到MAFIA 小鼠機械痛與熱痛的閾值。接下來使用不同方法來檢查 DRG 和血液單核細胞中的常駐巨噬細胞，通過FACS 檢測DRG駐留(GFP+)巨噬細胞的數(shù)量，結果表明：AP 治療降低了L4-5神經損傷側與對側DRG 中巨噬細胞的數(shù)量，但在第9 天時(POD9)巨噬細胞擴增再次出現(xiàn)。另外，通過巨噬細胞所表達的GFP 和 PU.1 進行免疫染色也證實了這種現(xiàn)象。

既往研究認為AP 不會穿過血腦屏障(blood brain barrier, BBB)，但作者認為必須排除 AP 治療對CNS 的直接作用。于是通過SNI 造模后POD1與POD4 對小膠質細胞進行FACS 分析，發(fā)現(xiàn)其在數(shù)量上沒有影響。同時，對小膠質細胞進行免疫染色后也得出了相同的結論。因此，該研究認為無論是否存在神經損傷，脊髓小膠質細胞和星形膠質細胞都不受AP 治療的影響。

基于上述結果，進一步分析了DRG 巨噬細胞與神經損傷引起的機械痛敏化之間的關系。分別在不同實驗組中每日 AP 注射3 次(1.0 mg·kg-1)后，建立SNI 模型，再通過vonFrey 與熱輻射對小鼠的機械痛閾與熱痛閾進行測定。結果表明：巨噬細胞的消耗延遲了痛閾超敏的發(fā)展，并且這種延遲至少持續(xù)到神經損傷后的第7 天；重要的是，巨噬細胞擴增恢復的小鼠表現(xiàn)出機械性疼痛的敏化。但是，由于AP 治療引起的體重減輕在這些小鼠中持續(xù)存在，作者認為AP 對機械超敏反應的影響不是繼發(fā)于體重減輕，又檢測了AP 治療后小鼠對熱刺激的反應，結果發(fā)現(xiàn)熱痛閾值在 AP 治療前后小鼠沒有差異。因此，認為體重減輕不是巨噬細胞耗竭產生的抗異常性疼痛作用的主要因素。除此之外，本文作者在另一項實驗中將MAFIA 小鼠中分離的骨髓(BM) 祖細胞 (GFP+) 移植到WT 小鼠中，并在AP治療后進行SNI 造模，發(fā)現(xiàn)移植小鼠DRG 中AP介導的巨噬細胞耗竭顯著延遲了神經損傷誘導的機械超敏反應的發(fā)展。

接下來，研究了DRG 與神經損傷部位的巨噬細胞對于NP 的貢獻。由于AP 對于巨噬細胞的消耗是全身性的，所以無法區(qū)分損傷部位與DRG 中巨噬細胞各自的貢獻。因此，設計了一個植入套管并將其縫合到覆蓋損傷部位的肌肉上，用來提供局部的低劑量AP，只針對損傷部位周圍的巨噬細胞進行局部消融，而不會產生全身的作用。在損傷部位使用AP (0.8 μg/20 μl)套管治療后，小鼠并未出現(xiàn)明顯的機械痛閾改變或體重減輕。為探究AP 套管治療是否會影響DRG 巨噬細胞，又對受損神經部位與DRG 進行了組織化學染色和FACS 分析，結果顯示：損傷神經部位GFP+巨噬細胞數(shù)量減少，而DRG 中巨噬細胞數(shù)量無明顯改變，這表明AP 套管治療可以僅在損傷部位消耗巨噬細胞。然后，通過vonFrey 對局部消融巨噬細胞小鼠進行機械痛閾測定，結果顯示：局部AP 治療對神經損傷后小鼠機械痛閾無顯著改變。綜合上述結果得出結論：神經損傷誘導的機械超敏反應的啟動必需要DRG 中巨噬細胞的參與，且與損傷部位巨噬細胞無關。

然后，作者探究了神經損傷觸發(fā) DRG 巨噬細胞和感覺神經元之間的相互作用。軸突切斷刺激DRG 感覺神經元表達CSF1 和CSF1 轉運到脊髓背角后通過 CSF1R 激活小膠質細胞，誘導小膠質細胞增殖，并促進NP 的發(fā)生。在AP 治療的小鼠中，巨噬細胞的消耗并沒有下調損傷誘導的軸突感覺神經元中 CSF1 的表達，為了證明DRG 中神經損傷后CSF1 是否參與誘導巨噬細胞的擴增，使用了CSF1fl/fl的Adv-Cre 品系小鼠，該小鼠的感覺神經元中CSF1 基因表達可被選擇性敲除。神經損傷后第 4 天(POD4)，對腰段脊髓背角小膠質細胞進行 FACS 分析，結果表明：Adv-Cre 小鼠同側損傷誘導的小膠質細胞同WT 小鼠相比，巨噬細胞的激活和增殖都明顯下調，CSF1 條件性敲除可阻止同側軸突切斷的 DRG 中巨噬細胞損傷誘導的擴張，但在全身缺乏CCL2 的小鼠中，DRG 巨噬細胞的擴增并未受到影響。由此得出結論，軸突切斷DRG 感覺神經元通過CSF1 釋放激活DRG 巨噬細胞，并且這種激活不依賴于CCL2。另外，CSF1也在衛(wèi)星細胞中表達，由于DRG 中的衛(wèi)星細胞有助于損傷引起神經病理性疼痛的發(fā)展，但在 AP介導的巨噬細胞耗竭后通過對衛(wèi)星細胞標志物連接蛋白-43 進行檢測，發(fā)現(xiàn)沒有明顯改變，這表明CSF1 的來源并非是衛(wèi)星細胞。

接下來探究了神經損傷誘導DRG 巨噬細胞的激活是否反過來影響感覺神經元？具體來說，作者檢測了四種成熟標記物：ATF332、Atf3、甘丙肽和神經肽 Y (NPY)。在 SNI 造模(POD1)后通過qPCR分析，上述標記物均無顯著改變，但腦源性神經營養(yǎng)因子(BDNF)的上調在AP 治療后被顯著抑制；因此，通過使用原位雜交 (ISH)技術確定了DRG 中BDNF 的來源。ISH 的結果顯示周圍的非神經元細胞中沒有表達BDNF，認為巨噬細胞不表達BDNF；但由于BDNF 的選擇性敲除并不會影響NP 的敏化，因此，推測BDNF 對感覺神經元的影響并不明確。由于白細胞介素1β (IL-1β) 和腫瘤壞死因子α (TNF-α)在 DRG 中的神經元和非神經元細胞中均有表達，并且與NP 有關；因此，在SNI 模型中對IL-1β 和TNF-α 進行了qPCR 分析，結果發(fā)現(xiàn)：IL-1β 有明顯上調，但TNF-α 沒有明顯改變。在給予AP 治療后，IL-1β 表達在造模側與對側均出現(xiàn)降低。令人驚訝的是，只在Itgam+巨噬細胞中檢測到IL-1β 的表達；除此之外，還檢查了兩種假定的抗炎細胞因子，即IL-10 和轉化生長因子β (TGF-β)，結果發(fā)現(xiàn)TGF-β基因表達在神經損傷巨噬細胞耗盡后沒有改變，而IL-10 表達水平太低而無法在DRG 中檢測到。綜上所述，該研究認為神經損傷后IL-1β 的上調主要來自DRG 巨噬細胞，而巨噬細胞耗竭所引起的NP 延遲的原因部分是由于損傷誘導的 IL-1β 減少所致。

最后，作者研究了在NP 中巨噬細胞的擴增是否存在性別差異。通過FACS 分析發(fā)現(xiàn)：雌性小鼠在損傷側的巨噬細胞數(shù)量雖然增加，但與雄性小鼠相比并不顯著；這表明在受到神經損傷刺激后DRG巨噬細胞的增殖存在性別差異。為進一步研究性別差異是否會影響DRG 巨噬細胞在神經損傷疼痛中的功能，仍以上述實驗方法將小鼠按性別分為兩組，通過AP 消耗巨噬細胞后，與雄性小鼠一樣，雌性小鼠的脊髓小膠質細胞不受影響；此外，神經損傷后4周(POD28)通過 AP 給藥引起的巨噬細胞耗竭，當出現(xiàn)明顯的機械性異常性疼痛時，也會在雌性小鼠中產生短暫的、較小的異常性疼痛逆轉。同時，還檢查了缺乏 CCL2 的雄性和雌性小鼠，發(fā)現(xiàn) SNI誘導的機械超敏反應在雄性和雌性小鼠中相似。得出結論：CSF1 對神經損傷誘導的 DRG 巨噬細胞擴增的貢獻存在性別差異，但在功能上，DRG 巨噬細胞對于雄性和雌性小鼠神經損傷誘導的機械超敏反應的啟動和維持是一致的。

綜上所述，該研究通過MIFIA 小鼠與AP 誘導Fas 特異消耗巨噬細胞的方法證明了DRG 巨噬細胞在SNI 中的起始與延續(xù)中都起到了重要作用。并且還發(fā)現(xiàn)DRG 巨噬細胞與感覺神經元之間的相互作用，即神經損傷后CSF1 促使巨噬細胞增殖，反之神經損傷后 DRG 中巨噬細胞產生的IL-1β 感覺神經元進一步敏化。另外，作者還發(fā)現(xiàn)了 DRG 中損傷誘導的巨噬細胞的來源。盡管 CCR2 表達與浸潤巨噬細胞有關，作者在未受損的小鼠DRG 中發(fā)現(xiàn)了許多 CCR2+駐留巨噬細胞。這說明CCR2 并不能作為區(qū)分浸潤巨噬細胞與駐留DRG 巨噬細胞的標志物，而Ki67 則是DRG 巨噬細胞較好的標志物?；谶@些結果，該研究認為該DRG 巨噬細胞在來源上雖然不能排除浸潤，但更認同巨噬細胞擴增主要源自損傷后增殖的駐留 DRG 巨噬細胞，并說明了性別在其中的影響，雖然在巨噬細胞的數(shù)量上雌鼠要低于雄鼠，但在NP 的開始與維持中DRG 巨噬細胞的貢獻是沒有差異的。

該研究已經證明雄性和雌性小鼠中軸突切斷引起的NP 會引起DRG 中巨噬細胞的擴增，巨噬細胞擴增是NP 的發(fā)生和維持所必須的。DRG 中巨噬細胞和感覺神經元之間存在相互作用，這種相互作用與感覺神經元-小膠質細胞連接一致，有助于NP 表型的發(fā)展。上述過程在多大程度上是獨立的，以及是否可以作為一種新的疼痛治療方式仍有待確定。