孫江峰 董艷華 張小軍

揚(yáng)子江藥業(yè)集團(tuán)江蘇海慈生物藥業(yè)有限公司 江蘇 泰州 225300

引言

鹽酸莫西沙星是臨床上常用的一種抗菌藥物，有抗菌譜廣、抗菌能力強(qiáng)、半衰期長、療效好、副作用小及和其他抗菌藥物之間不會(huì)形成交叉耐藥性等特征，當(dāng)下在國內(nèi)實(shí)現(xiàn)商品化的有鹽酸莫西沙星片、膠囊及注射液，多用于治療成人呼吸道感染，也作為糖尿病、腎損傷患者的一種輔助性藥物。從結(jié)構(gòu)層面上分析，鹽酸莫西沙星的分子內(nèi)存有2個(gè)手性中心，有學(xué)者預(yù)測其可能存有4種異構(gòu)體，4S、7S構(gòu)型是當(dāng)下臨床準(zhǔn)許應(yīng)用的異構(gòu)體，但制造階段可能會(huì)引進(jìn)少許的其他異構(gòu)體，故而精準(zhǔn)分離異構(gòu)體與采用適宜的檢查方法是很有現(xiàn)實(shí)意義的[1]。本文采用HPLC手性流動(dòng)相添加劑法拆分異構(gòu)體，檢測相應(yīng)的含量值。

1 儀器和試藥

高效液相色譜儀（LC-2010C HT型），其內(nèi)含有LCSolution色譜工作站。

鹽酸莫西沙星對照品I（批號：Y 0 0 0 0 7 0 3，純度達(dá)99.906%），R-異構(gòu)體對照品II（批號：20110726，純度99.820%）與原藥（批號20110612、20110620與20110703）；硫酸銅；L-苯丙氨酸；選用蒸餾水、甲醇分別作為超純水、色譜純。

2 操作方法與結(jié)果分析

2.1 配制溶液

對照品II貯備液：準(zhǔn)確稱取10㎎對照品II，將其安置在10ml容量瓶內(nèi)，添加流動(dòng)相溶解并定容處理，便能配制出1㎎/ml對照品II貯備液[2]。

供試品溶液：取10㎎原藥，置于10ml瓶中，操作方法同上制得1㎎/ml的供試品溶液。

2.2 色譜條件和適用性試驗(yàn)

Zorbax SB-C18色譜柱（4.5mm×150mm，5μm）；流動(dòng)相：手性流動(dòng)相添加劑溶液（750㎎硫酸銅+991.3㎎ L- 苯丙氨酸，添加適量蒸餾水溶解并定容到1L）—甲醇（39:11），流速1.0mL/min，柱溫45℃，檢測波長293nm；進(jìn)樣量10μL。

量取對照品I、II適量，添加流動(dòng)相溶解并稀釋制備成含有I 1㎎/ml、II 2μg/ml混合液，將其作為系統(tǒng)適用性試驗(yàn)用溶液。量取適量對照品II，溶解、稀釋制得1μg/ml溶液。取以上兩種溶液作為系統(tǒng)適用性溶液（含有異構(gòu)體0.5%左右）。稱量10μL以上系統(tǒng)適用性溶液，將其輸注至液相色譜儀內(nèi)，R-異構(gòu)體和莫西沙星的留存時(shí)間分別是13.8min、16.6min，兩者的分離度是3,.4，基于R-異構(gòu)體峰進(jìn)行計(jì)量，理論塔板數(shù)是4296。

2.3 線性關(guān)系分析

稱取適量的莫西沙星R—異構(gòu)體對照品，精準(zhǔn)定容，添加溶劑溶解并稀釋制得0. 55、1.10、2.20、2.75、5. 50μg/ml的系列溶液。準(zhǔn)確量取以上系列溶液各10 μL，依次將其輸注至液相色譜儀內(nèi)，記錄相應(yīng)的色譜圖。將峰面積（A：μV×s）、濃度（C：μg/ml）分別設(shè)定為縱、橫坐標(biāo)，以此為據(jù)進(jìn)行線性回歸分析，獲得如下的線性方程：A=3. 926×105C-1. 566×105 r=0. 9995線性范疇是0.55～5.40μg/ml。

2.4 加樣回收率試驗(yàn)

稱取莫西沙星原藥（批號20110612 其內(nèi)R-異構(gòu)體含量0.24%），大概24mg，精準(zhǔn)稱定，共計(jì)8份，依次將其置在50ml量瓶內(nèi)，精確投用“系統(tǒng)適用性試驗(yàn)”下的R-異構(gòu)體儲(chǔ)備液0.5、1.0、1.5mL各3份，添加溶劑溶解并稀釋到設(shè)計(jì)刻度，混合充分搖均，將其設(shè)定成異

構(gòu)體回收率試驗(yàn)中的測試液。取適量測試液與R—異構(gòu)體對照品各10μL，按序注入值液相色譜儀內(nèi)，依照峰面積，利用外標(biāo)法測算出回收率。統(tǒng)計(jì)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，低、中、高濃度回收率（n=3）依次是98.3%、99.7%、99.6%；RSD依次是0.68%、0.92%、0.83%，平均回收率（n=8)達(dá)到了99.3%。

2.5 檢測限與定量限

取適量R—異構(gòu)體對照品溶液，適當(dāng)稀釋處理，進(jìn)樣檢測。當(dāng)信噪比（S/N）達(dá)到3時(shí)，檢測得到R—異構(gòu)體的檢測限是1. 1 ng；當(dāng)信噪比（S/N）是10時(shí)，檢測出R—異構(gòu)體的定量限是3. 5ng[3]。

2.6 進(jìn)樣精密度試驗(yàn)

取適量R—異構(gòu)體對照品溶液，持續(xù)進(jìn)樣6次，檢測R—異構(gòu)體的峰面積，RSD（n=6）是0.29%。

2.7 溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)

稱取原藥（批號20110620）25㎎左右，精準(zhǔn)定容，將其安置于50 mL量瓶內(nèi)，添加適量溶解（超聲波助溶）并稀釋到設(shè)計(jì)刻度，搖勻，將其作為供試品溶液（0.5㎎/mL），考察分析溶液的穩(wěn)定性。室溫條件下分別安置0h、1h、2h、4h、6h、8h 以后分別進(jìn)樣10μL，記錄相應(yīng)的色譜圖，其R—異構(gòu)體峰面積的RSD（n=6）對應(yīng)值是0.94%，提示在室溫條件下本溶液持續(xù)放置8h內(nèi)，依然能維持自身性質(zhì)的相對穩(wěn)定性。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn)

量取相同批次試樣（批號20110703），精準(zhǔn)量取、定容，添加事前準(zhǔn)備好的溶劑進(jìn)行溶解及稀釋處理，配制出濃度大概為0.5㎎/ml的6份供試品溶液，分別規(guī)范的檢測R—異構(gòu)體含量。通過結(jié)果發(fā)現(xiàn)R—異構(gòu)體含量平均值（n=6）s 0.24%,RSD是2.6%，提示本課題研究中采用的HPLC法重復(fù)性優(yōu)良。

2.9 測定R—異構(gòu)體

即稱取適量莫西沙星原藥，添加試劑溶解及稀釋處理，配制成濃度大概0.5㎎/ml供試品溶液，精準(zhǔn)稱取以上溶液及R—異構(gòu)體對照品溶液各10μL，分別進(jìn)樣檢測，形成的色譜圖見圖1，4頻次樣品內(nèi)R—異構(gòu)體含量依次是0.16%、0.24%、0.16%/0.27%。

3 討論

3.1 選擇與優(yōu)化色譜條件

手性流動(dòng)相添加劑法應(yīng)用時(shí)把某種手性金屬離子的配位體添加到色譜洗脫劑內(nèi)，于某種非手性固定相之上拆分對映體。該種方法在確保分離度與較短分析時(shí)間的基礎(chǔ)上，優(yōu)化了配位離子Cu2+與手性配位體L-苯丙氨酸的濃度。流動(dòng)相內(nèi)甲醇的比例是影響留存時(shí)間與分離度的主要因素之一，當(dāng)甲醇占比達(dá)到22%時(shí)，耗用的分析時(shí)間較短，并且分離度能符合設(shè)計(jì)要求。

3.2 溶劑的選擇

先嘗試用甲醇-水作為溶劑，分離度（R=2.3）與柱效（對照品I與II理論板數(shù)均在5000之上）都較好，但對照品II的進(jìn)樣精密度偏大（RSD3.7%， n=5），回收率偏高（平均值127.4%），很難滿足定量分析的要求；當(dāng)溶劑調(diào)換成內(nèi)含手性添加劑的流動(dòng)相時(shí)，能取得較理想的分析結(jié)果，確保測量結(jié)果有較好的重現(xiàn)性。

3.3 檢測濃度的選擇

參照最低檢出濃度要求，應(yīng)用“上推法”去確定供試品溶液濃度，本品的最低檢出濃度0.11μg/ml，供試品溶液濃度應(yīng)達(dá)到最低檢出濃度的2000`5000倍。故而選擇0.5㎎/ml供試液濃度作為測試濃度，在該濃度條件下，0.05%及以上的R-異構(gòu)體都能檢出（信噪比＞6）。