張杰 唐華平

1濰坊醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院 261053；2青島市市立醫(yī)院東院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科266071

據(jù)WHO統(tǒng)計(jì)，截至2021年3月28日，全球累計(jì)確診新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)126 372 442例，累計(jì)死亡2 769 696例[1]。當(dāng)前，全球范圍內(nèi)COVID-19的確診病例持續(xù)上升，造成了前所未有的醫(yī)療和社會(huì)經(jīng)濟(jì)危機(jī)，解開新型冠狀病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-Co V-2)生物學(xué)信息是及時(shí)有效抗擊這種大流行的基礎(chǔ)。目前已經(jīng)確認(rèn)SARS-Co V-2屬于β冠狀病毒，在全基因組水平上與冠狀病毒序列相似程度高[2-3]。SARS-Co V-2的氨基酸序列與冠狀病毒也有相似之處，通過對(duì)其編碼蛋白的進(jìn)一步研究，為防治工作奠定一定的基礎(chǔ)。目前，一些有效的抗病毒候選藥物和疫苗正在接受緊急研究，為早日戰(zhàn)勝疫情帶來曙光。

1 基因組的相關(guān)研究

SARS-Co V-2是一種基因組大小約為30 kb的包膜、陽性、單鏈的RNA病毒，隸屬于冠狀病毒科的sarbecovirus亞屬，在sarbecovirus亞屬內(nèi)形成了一個(gè)獨(dú)立的亞類[4-6]。約30 kb大小的基因組多達(dá)14個(gè)開放閱讀框(open reading frame，ORF)[7]，基因組G+C含量為38%，基因組包含2個(gè)側(cè)翼未翻譯區(qū)和1個(gè)編碼多蛋白的長(zhǎng)ORF，基因組的排列順序?yàn)椋?'非翻譯區(qū)(untranslated regions，UTR)、復(fù)制酶編碼區(qū)(ORF1ab)、S基因、E基因、M基因、N基因、3'UTR和幾個(gè)未經(jīng)鑒定的非結(jié)構(gòu)ORF，但是缺乏β冠狀病毒特有的血凝素酯酶基因[4-5，8]。其中5'UTR、ORF1ab、S基因、E基因、M基因、N基因和3'UTR的基因預(yù)測(cè)長(zhǎng)度分別為：265、21 291、3 822、228、669、1 260和229nt[9]。有關(guān)研究發(fā)現(xiàn)SARS-Co V-2的E基因、M基因、N基因與相關(guān)冠狀病毒的序列同源性高(均大于90%)，最高的是E基因(98.7%)；但是S基因與相關(guān)冠狀病毒的序列同源性最低，只有75%左右，顯示出了較大差異[3]。有關(guān)學(xué)者還在S基因中發(fā)現(xiàn)了一些重組的證據(jù)，但沒有證據(jù)表明重組促進(jìn)了SARS-Co V-2的出現(xiàn)[2，10]。Kim等[11]采用了兩種互補(bǔ)的測(cè)序技術(shù)，繪制了SARSCo V-2轉(zhuǎn)錄組的高分辨率圖，全面認(rèn)識(shí)了SARS-Co V-2的生命周期和致病性。采用最新生物信息學(xué)方法和更大規(guī)模的數(shù)據(jù)，從蛇基因組中2%的所有蛋白質(zhì)編碼基因擴(kuò)展到脊椎動(dòng)物基因組中10%的所有蛋白質(zhì)編碼基因并進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)SARS-Co V-2與蛇使用的相對(duì)同義密碼子的差異不是最小的，反駁了蛇可作為中間宿主的說法，從側(cè)面反映了在缺乏全面的數(shù)據(jù)或后續(xù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的情況下，應(yīng)謹(jǐn)慎避免對(duì)數(shù)據(jù)作出過度解釋[12]。研究發(fā)現(xiàn)蝙蝠、穿山甲和貓科類冠狀病毒與SARS-Co V-2基因序列最為密切，這表明需要持續(xù)的監(jiān)測(cè)和預(yù)警野生動(dòng)物和家養(yǎng)動(dòng)物中存在的病毒庫，對(duì)于找到中間宿主及切斷傳播途徑具有一定的意義[13]。

SARS-Co V-2是單鏈RNA病毒，每個(gè)復(fù)制周期都會(huì)出現(xiàn)突變，從27個(gè)SARS-Co V-2分離株中分離出6個(gè)基因型，表明已經(jīng)發(fā)生突變，這種變異值得注意，今后要警惕任何快速突變導(dǎo)致疫情的再次暴發(fā)[14]。有學(xué)者對(duì)86個(gè)SARS-Co V-2的基因組進(jìn)行了遺傳分析，發(fā)現(xiàn)了編碼區(qū)和非編碼區(qū)的許多突變和缺失，從而為SARS-Co V-2遺傳多樣性和快速進(jìn)化提供了證據(jù)[15]。Pachetti等[16]用GISAID數(shù)據(jù)庫分析了220個(gè)基因組序列，發(fā)現(xiàn)了8個(gè)新的突變，而且在不同地區(qū)突變的位置及模式不同，這表明SARSCo V-2正在不斷進(jìn)化。COVID-19病死率可能因地理區(qū)域的不同而不同，因此要反映某些突變的存在可能與不同的病死率相關(guān)還需要進(jìn)一步的研究來證實(shí)。此外，Kim等[17]在SARS-Co V-2基因組中確定了767個(gè)同義突變和1 352個(gè)非同義突變。一種新的SARS-Co V-2病毒分離株在刺突蛋白中攜帶一個(gè)點(diǎn)突變(D614G)，并在傳染性上迅速超過其他分離株，進(jìn)一步研究表明Spike蛋白中的D614G突變?cè)鰪?qiáng)了病毒在人類細(xì)胞中的轉(zhuǎn)導(dǎo)，在多個(gè)細(xì)胞系中，攜帶D614G突變的SARS-Co V-2轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的效率是野生型的8倍[18]。病毒突變的生物學(xué)特征可能為致病機(jī)制提供寶貴的見解。分析SARS-Co V-2的基因，對(duì)于其起源、發(fā)病機(jī)制、治療及預(yù)防具有重大意義。

2 蛋白質(zhì)的相關(guān)研究

SARS-Co V-2的基因組可編碼9 860個(gè)氨基酸[4]，其在氨基酸水平上與嚴(yán)重急性呼吸綜合征病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus，SARS-Co V)有差異，存在380個(gè)氨基酸替換，相關(guān)輔助蛋白質(zhì)的氨基酸個(gè)數(shù)也不相等，這可能導(dǎo)致SARS-Co V-2的功能和致病性與SARS-Co V不同[19]。SARS-Co V-2包含16種病毒復(fù)制和發(fā)病所需的非結(jié)構(gòu)蛋白(nonstructural protein，NSP)、4種結(jié)構(gòu)蛋白[棘突蛋白(S)、病毒包膜(E)、基質(zhì)蛋白(M)、核蛋白(N)]以及9種其他輔助因子[6]。5種重要蛋白的氨基酸長(zhǎng)度分別為7 096個(gè)氨基酸(ORF1ab)、1 273個(gè)氨基酸(S蛋白)、75個(gè)氨基酸(E蛋白)、222個(gè)氨基酸(M蛋白)和419個(gè)氨基酸(N蛋白)[13，20]。

NSP2內(nèi)有關(guān)結(jié)構(gòu)域的穩(wěn)定突變可能會(huì)導(dǎo)致高傳染性，NSP3的不穩(wěn)定突變可能是區(qū)別于SARS-Co V的重要標(biāo)志[21]。NSP7b和NSP8可以影響宿主的免疫應(yīng)答信號(hào)，其在進(jìn)化過程中的功能變化可能影響感染人的能力[22]。NSP可以形成一種復(fù)制酶/轉(zhuǎn)錄酶復(fù)合物，其由多種酶組成，包括NSP3、NSP13和NSP10/NSP16等[7]。

S蛋白對(duì)病毒亞型及疫苗應(yīng)答具有重要作用[6]。其能識(shí)別宿主細(xì)胞受體催化膜融合，在相關(guān)酶的作用下，被分成S1和S2亞單位。S1包含一個(gè)信號(hào)肽，其受體結(jié)合區(qū)(receptor binding domain，RBD)與受體結(jié)合；S2高度保守，包含融合肽和細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域，與人類SARS-Co V具有99%的同源性。因此，抗S2的廣譜抗病毒肽有治療病毒的發(fā)展前景[4]。最近的一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)SARS-Co V-2進(jìn)入宿主細(xì)胞需要絲氨酸蛋白酶(TMPRSS2)啟動(dòng)S蛋白，抑制TMPRSS2可阻止感染宿主細(xì)胞，這可作為一個(gè)抑制病毒傳播的新治療靶點(diǎn)[23]。有學(xué)者利用SARS-Co V S蛋白生成多克隆抗體，可以有效阻止SARS-Co V-2感染宿主細(xì)胞，為疫苗和病毒進(jìn)入抑制劑的設(shè)計(jì)提供了藍(lán)圖[24-25]。SARSCo V-2與SARS-Co V S蛋白的RBD相似程度高，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)二者都是利用人血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2(angiotensin converting enzyme 2，ACE2)受 體 進(jìn) 入 宿 主 細(xì) 胞[3，9，23]。Monteil等[26]發(fā)現(xiàn)人類重組可溶性ACE2可以阻斷SARSCo V-2早期階段的感染，為治療和預(yù)防提供了新方向，也間接反映出了SARS-Co V-2通過人ACE2受體進(jìn)入宿主細(xì)胞。β冠狀病毒家族中E蛋白、M蛋白是高度保守的蛋白質(zhì)，而輔助蛋白似乎有更嚴(yán)格的進(jìn)化限制[27]。另外SARSCo V-2病毒主蛋白酶是一種關(guān)鍵的輔酶，在介導(dǎo)病毒復(fù)制和轉(zhuǎn)錄中起著關(guān)鍵作用，可以作為病毒的一個(gè)有吸引力的藥物靶點(diǎn)或新藥先導(dǎo)[28]。這些發(fā)現(xiàn)有助于進(jìn)一步了解SARS-Co V-2發(fā)病機(jī)制，分析SARS-Co V-2與其他冠狀病毒蛋白的差異，為抗病毒治療做鋪墊。

3 疫苗的相關(guān)研究

雖然疫苗的研發(fā)無法影響第一波大流行，卻在預(yù)防感染和第二次大流行上具有重大戰(zhàn)略意義。疫苗種類主要包括經(jīng)典的滅活疫苗、減毒疫苗、蛋白質(zhì)亞單位和病毒樣顆粒疫苗、基于病毒載體的疫苗以及新的基于DNA和m RNA的疫苗等，每種疫苗都有其自身的優(yōu)缺點(diǎn)，所有疫苗都在同時(shí)開發(fā)[6，29-30]。有學(xué)者運(yùn)用免疫原性預(yù)測(cè)模型鑒定出了具有高免疫原性的SARS-Co V-2多肽，通過肌肉注射或皮下注射將其傳遞給宿主以激發(fā)免疫反應(yīng)是疫苗的研發(fā)一個(gè)重要方向[31-33]。隨后有關(guān)學(xué)者發(fā)現(xiàn)冠狀病毒3CL水解酶是病毒蛋白水解酶成熟所必需的，利用3CL水解酶結(jié)合佐劑增強(qiáng)免疫應(yīng)答，通過短肽連接體相互連接，可以構(gòu)建多表位多肽疫苗[34]。回顧抗SARS-Co V RBD單克隆抗體和體外中和SARS-Co V病毒的研究發(fā)現(xiàn)，有開發(fā)針對(duì)SARS-Co V-2的異源SARS-Co V RBD疫苗的可能[35-36]。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，滅活的SARS-Co V-2候選疫苗和DNA疫苗可為小鼠、非人類靈長(zhǎng)類動(dòng)物提供保護(hù)，以抵抗SARSCo V-2的攻擊[37-39]。有趣的是，一種新型的誘騙性細(xì)胞疫苗利用表達(dá)SARS-Co V-2 S蛋白的非復(fù)制細(xì)胞作為免疫原性抗原的載體和呈現(xiàn)者，被宿主免疫系統(tǒng)識(shí)別，從而產(chǎn)生有效的保護(hù)性免疫應(yīng)答，采用這一創(chuàng)新策略可以開發(fā)一種新型疫苗來預(yù)防SARS-Co V-2感染[40]。有關(guān)學(xué)者認(rèn)為理想情況下，可以開發(fā)出一種能夠預(yù)防多種冠狀病毒的疫苗，即“泛冠狀病毒”疫苗。這種疫苗不僅可以預(yù)防目前已知的冠狀病毒，而且可以預(yù)防那些未來出現(xiàn)的新的冠狀病毒[41]。

2020年3月，美國開始了一種新型的mRNA疫苗(m RNA-1273)Ⅰ期臨床試驗(yàn)[42]，希望可以在預(yù)防SARSCo V-2中發(fā)揮作用。DNA和mRNA疫苗更容易設(shè)計(jì)并很快進(jìn)入臨床試驗(yàn)，但是在疫苗進(jìn)入臨床之前還需要科研人員驗(yàn)證其安全性[43]。在驗(yàn)證疫苗安全性上，Zhu等[44]通過人體試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)重組腺病毒5型載體疫苗是相對(duì)安全、可耐受和具有免疫原性的，其具有較大的發(fā)展?jié)摿?。隨后我國在603名成年志愿者中開展了腺病毒5型載體疫苗的Ⅱ期隨機(jī)雙盲試驗(yàn)，在單次免疫后大多數(shù)接受者有了相當(dāng)大的體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)，說明該疫苗是安全有效的[45]。目前已報(bào)道了數(shù)百種SARS-Co V-2候選疫苗，其中有許多處于Ⅱ期臨床試驗(yàn)，有些已經(jīng)進(jìn)入Ⅲ期臨床試驗(yàn)。在一項(xiàng)有關(guān)牛津大學(xué)開發(fā)的載體疫苗Ch Ad Ox1隨機(jī)對(duì)照的Ⅰ/Ⅱ期臨床試驗(yàn)中，所有1 077名參與者均誘導(dǎo)出了針對(duì)SARS-CoV-2的中和抗體，表明該疫苗不僅是有效的，而且具備一定的安全性。目前，美國輝瑞公司和德國Bio NTech公司的m RNA疫苗BNT162b2正在美國、英國和加拿大等地區(qū)進(jìn)行接種。美國莫德納公司的m RNA-1273、俄羅斯衛(wèi)生部研制的Sputnik V和英國阿斯利康公司的AZD1222在其Ⅲ期試驗(yàn)中也取得了巨大成功，正在考慮緊急使用[46]。我國被認(rèn)為是SARS-Co V-2疫苗研發(fā)的世界領(lǐng)先國家之一。截至目前，附條件批準(zhǔn)上市的有3款利用非洲綠猴腎細(xì)胞研發(fā)的滅活疫苗、1款利用5型腺病毒研發(fā)的腺病毒載體疫苗及獲批緊急使用的1款利用我國倉鼠卵巢細(xì)胞研發(fā)的重組亞單位疫苗。我國的疫情防控取得了舉世矚目的成績(jī)，然而病毒基因組的突變?cè)谙拗埔呙绲氖褂脡勖矫嫫鹬匾饔?，相關(guān)疫苗還在試驗(yàn)階段，需要國際合作應(yīng)對(duì)控制COVID-19疫情的重大挑戰(zhàn)。

4 展望

通過有限的治療和預(yù)防措施，抗擊來歷不明、生物學(xué)特性神秘的SARS-Co V-2，是一項(xiàng)具有挑戰(zhàn)性的任務(wù)。對(duì)于控制COVID-19疫情，研究SARS-Co V2的基因組和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)是必不可少的。所有這些知識(shí)將為疫苗和抗病毒治療的發(fā)展鋪平道路。相信在我們的共同努力下會(huì)早日戰(zhàn)勝疫情。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突