王一鵬 秦 朗 李 穎

目前，不孕癥影響著全球15%的夫婦，其中男性因素約占50%。引起男性不育的原因主要包括生精障礙、輸精管道梗阻(感染性/輸精管缺如)、性腺附屬器官異常、性功能異常、全身性疾病、應(yīng)用某些藥物或接觸毒物及放射線等。男性不育因素中以生精障礙最為常見(jiàn)，臨床表現(xiàn)為無(wú)精子癥和少弱精子癥，約30%的生精障礙患者存在遺傳學(xué)異常，包括性染色體數(shù)目異常(如47,XXY克氏征)、某些常染色體基因突變以及Y染色體結(jié)構(gòu)或基因異常，而后者是15%的少精子癥或無(wú)精子癥患者發(fā)病的遺傳因素[1]。男性生殖遺傳學(xué)檢查對(duì)于指導(dǎo)臨床治療、提高輔助生殖技術(shù)的有效性和安全性、開(kāi)展胚胎植入前遺傳學(xué)檢測(cè)(preimplantation genetic testing, PGT)等具有重要意義。

一、男性AZF基因微缺失是造成生精障礙的主要遺傳學(xué)因素

Y染色體的雄性特異性區(qū)域(male-specific region of the Y chromosome, MSY)是男性獨(dú)有的基因區(qū)域，該區(qū)域通過(guò)轉(zhuǎn)錄、基因沉默、泛素化等影響精子發(fā)生。MSY區(qū)域內(nèi)包含大量高度同源的回文序列和發(fā)夾結(jié)構(gòu)，這些結(jié)構(gòu)間發(fā)生頻繁的基因轉(zhuǎn)換引起非等位同源性重組(non-allelic homologous recombination, NAHR)。NAHR是防止Y染色體遺傳衰減的機(jī)制之一，但也會(huì)因此導(dǎo)致該區(qū)域內(nèi)較高的基因缺失率。5%～10%的無(wú)精子癥患者和2%～5%的嚴(yán)重少精子癥患者是由于MSY區(qū)域內(nèi)的基因缺失，即Y染色體微缺失(Y-chromosome microdeletions, YCMs)導(dǎo)致[2]。除精液異常外，YCMs還可能與睪丸及附睪發(fā)育異常、精索靜脈曲張、生殖激素異常等不育因素有關(guān)。

1976年，Tiepolo等[3]在6例無(wú)精子癥患者中，發(fā)現(xiàn)Y染色體q11.2區(qū)域的缺失，并將該區(qū)域命名為男性少弱精因子(azoospermia factor，AZF)區(qū)域。研究者根據(jù)Yq11在無(wú)精子男性生殖細(xì)胞發(fā)育不同階段的作用，將76個(gè)離散的“微缺失”位點(diǎn)定位到Y(jié)q11的3個(gè)亞區(qū)，它們被命名為AZFa(近端)，AZFb(中段)和AZFc(遠(yuǎn)端)，各個(gè)區(qū)域均存在導(dǎo)致男性精子生成障礙的候選基因[4]。2015年中華醫(yī)學(xué)會(huì)男科學(xué)分會(huì)發(fā)布的《男性生殖遺傳學(xué)檢查專家共識(shí)》中提出，男性生殖疾病診治中應(yīng)進(jìn)行染色體核型分析、AZF基因微缺失等常規(guī)檢查以及基因突變檢測(cè)等特殊檢查[5]。

二、YCMs的流行病學(xué)

20多年來(lái)，全球范圍內(nèi)多采用巢式或多重PCR進(jìn)行YCMs的檢測(cè)，不同報(bào)道的YCMs檢出率存在差異。美國(guó)生殖醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)(American society for reproductive medicine，ASRM)2012年在男性不育的診療共識(shí)中發(fā)布，一般男性人群中YCMs的發(fā)生率可能為2%[6]。但歐洲男科學(xué)會(huì)(European academy of andrology，EAA)認(rèn)為YCMs在普通男性人群中的發(fā)生率要低得多，約為1/4000(0.025%)[7]。另一項(xiàng)對(duì)超過(guò)10000例的Meta分析顯示，5%北美嚴(yán)重少精癥(精子數(shù)≤1×106/ml)患者存在AZF微缺失，而精液正常男性的發(fā)生率則不到1%，研究者認(rèn)為AZF的缺失是與生精失敗相關(guān)的，北美和歐洲的男性不育指南建議只對(duì)精子濃度為≤1×106/ml的男性進(jìn)行YCMs檢測(cè)[8]。

在既往的報(bào)道中，不育男性的YCMs檢出率存在顯著的地理區(qū)域和種族差異，AZF缺失率從美國(guó)的12.0%和伊朗的24.2%到德國(guó)和奧地利等國(guó)的不到2.0%[9]。2019年的一項(xiàng)研究對(duì)1030例不育的日本男性進(jìn)行了YCMs篩查，嚴(yán)重少精癥或無(wú)精癥男性中YCMs近7%(包括所有AZF重排)，AZFc是最常見(jiàn)的缺失區(qū)域[10]。

三、YCMs檢測(cè)的臨床意義

1.AZF分區(qū)：Y染色體AZF區(qū)包括a、b和c等3個(gè)區(qū)域，這3個(gè)區(qū)域內(nèi)含有多種精子生發(fā)相關(guān)基因，不同區(qū)域出現(xiàn)微缺失時(shí)均有可能通過(guò)影響相關(guān)基因造成少弱精癥。目前主要通過(guò)檢測(cè)序列標(biāo)簽位點(diǎn)(sequence tag site，STS)判斷AZF區(qū)域缺失部位。2012年歐洲男科學(xué)會(huì)發(fā)布的的Y染色體微缺失檢測(cè)專家共識(shí)提出，應(yīng)檢測(cè)6個(gè)STS位點(diǎn)以檢測(cè)AZF基因微缺失，這6個(gè)STS位點(diǎn)分別為AZFa區(qū)的sY84、sY86，AZFb區(qū)的sY127、sY134及AZFc區(qū)的sY254、sY255，該專家共識(shí)一直沿用至今[11]。然而，由于基因變異存在人種以及地域差異，上述6個(gè)STS位點(diǎn)并不完全適合中國(guó)人群。2015年中華醫(yī)學(xué)會(huì)男科學(xué)分會(huì)發(fā)布的《男性生殖遺傳學(xué)檢查專家共識(shí)》中，將Y染色體AZF微缺失檢測(cè)位點(diǎn)擴(kuò)增為8個(gè)，在歐洲共識(shí)的基礎(chǔ)上增加了AZFc區(qū)sY145及sY152位點(diǎn)的檢測(cè)[5]。

在臨床工作中，YCMs檢測(cè)在評(píng)估男性不育癥和低生育能力中至關(guān)重要，往往影響臨床決策和輔助生殖技術(shù)的實(shí)施路徑。在AZFa、AZFb和AZFc缺失中，AZFc缺失是最常見(jiàn)的YCMs，占所有報(bào)告缺失的60%～80%[7]。

2.AZF各區(qū)候選基因及輔助生育策略：AZFa區(qū)的候選基因有USP9Y、DBY和UTY基因，目前臨床共識(shí)推薦sY84及sY86為AZFa區(qū)基因微缺失的檢測(cè)位點(diǎn)。AZFa區(qū)基因發(fā)生微缺失會(huì)導(dǎo)致唯支持細(xì)胞綜合征，臨床表現(xiàn)為睪丸體積的縮小和無(wú)精子癥等[12]。由于AZFa區(qū)包含著精子生成必需的基因，AZFa缺失確診意味著即使采用包括顯微穿刺取精術(shù)(microdissection testicular sperm extraction，mTESE)在內(nèi)的所有取精手術(shù)都不能獲得精子，建議患者供精人工授精(artificial insemination by donor，AID)。

AZFb區(qū)主要候選基因有RBMY1、EIFA1Y、HSFY和PRY等基因，目前臨床共識(shí)推薦sY127及sY134為AZFb區(qū)基因微缺失的檢測(cè)位點(diǎn)。AZFb+c缺失會(huì)導(dǎo)致唯支持細(xì)胞綜合征或精子發(fā)生阻滯，患者多為無(wú)精子癥，故建議AZFb完全缺失(含AZFb+c缺失)的患者AID[13]。

AZFc區(qū)與少弱精癥相關(guān)的候選基因較多，有DAZ、BPY2、CDY1、CSGP4LY和GOLGA2LY等，目前臨床共識(shí)推薦sY145、sY152、sY254及sY255均為AZFc區(qū)基因微缺失的檢測(cè)位點(diǎn)。AZFc區(qū)候選基因中以DAZ基因家族最為重要， DAZ基因家族包含4個(gè)DAZ基因(DAZ1～4)，其功能是靶mRNA轉(zhuǎn)運(yùn)的適配區(qū)和翻譯的激活區(qū)[14]。DAZ基因家族缺失是AZF微缺失中最常見(jiàn)的類型，特發(fā)性無(wú)精子癥及嚴(yán)重少精子癥患者中涉及DAZ缺失的比率分別為13%和6%[15]。

3.AZFc缺失患者體外輔助生育策略的選擇及預(yù)后：AZFc缺失患者的表型具有較高差異，無(wú)精、少精均有可能，由于仍存在產(chǎn)生正常精子的可能，AZFc缺失患者可能是唯一可獲得自身后代的YCMs患者。AZFc缺失的無(wú)精子癥患者，可以試行睪丸取精術(shù)以獲得精子，并通過(guò)行卵胞質(zhì)內(nèi)單精子注射(intracytoplasmic sperm injection，ICSI)進(jìn)行體外輔助受孕。而對(duì)于AZFc缺失合并嚴(yán)重少精子癥患者，可以選擇直接ICSI。

有研究發(fā)現(xiàn)AZFc區(qū)域缺失的少精子癥患者，其精子數(shù)目有進(jìn)行性下降的趨勢(shì)，最后發(fā)展為無(wú)精子癥。因此，對(duì)此類患者建議及早生育或冷凍保存精子[16]。近年來(lái)有研究發(fā)現(xiàn)AZFc微缺失對(duì)ICSI結(jié)果有不利影響，AZFc缺失組ICSI結(jié)局較差，累積臨床妊娠率(45.39% vs 67.49%)、累積活產(chǎn)率(35.15% vs 53.44%)、受精率(46.80% vs 53.37%)，植入率(28.63% vs 31.26%)均低于Y染色體正常組[17]；即使采取了mTESE，AZFc微缺失的無(wú)精子癥患者的ICSI結(jié)果比無(wú)AZF缺失的男性更差[18]。近年來(lái)開(kāi)展的對(duì)12項(xiàng)研究的Meta分析總結(jié)了YCMs對(duì)ART妊娠結(jié)局的影響，發(fā)現(xiàn)與正常組比較，YCMs組受精率顯著降低(P=0.0006)，優(yōu)質(zhì)胚胎率、臨床懷孕率、早期流產(chǎn)率、流產(chǎn)率、活產(chǎn)率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，認(rèn)為YCMs與ART的受精率降低有關(guān)[19]。

mTESE被認(rèn)為是治療男性非阻塞性無(wú)精子癥的“金標(biāo)準(zhǔn)”，大約有52%的精子獲取成功率，然而YCMs男性成功取出精子的概率很可能取決于AZF缺失的區(qū)域[20]；AZFc區(qū)缺失患者的精子獲取率大約為50%～80%，是YCMs中最高的，而AZFa和AZFb區(qū)缺失的患者就有極差的精子獲取率和臨床結(jié)局，多AZF區(qū)域缺失如AZFbc和AZFabc缺失，也同樣有很差的精子獲取結(jié)果[7，8，10]。因此，檢測(cè)YCMs位置和程度，對(duì)ART助孕策略和臨床決策的制定意義重大?；谥皹O低的精子獲得率，對(duì)于AZFa、AZFb、AZFabc或AZFbc缺失的患者不推薦進(jìn)行mTESE[7]。

對(duì)于擬行ART的AZFc缺失患者建議進(jìn)行遺傳篩查和咨詢，其男性后代都將繼承他們父親帶有微缺失的Y染色體，這些男嬰的不育程度將和他們的父親一樣，甚至更嚴(yán)重。此外，Y染色體微缺失是Y染色體結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定的表現(xiàn)之一，AZF缺失患者男性后代罹患Turner綜合征(45,X)和兩性畸形可能性增大，故應(yīng)建議胎兒進(jìn)行產(chǎn)前診斷行染色體核型分析。對(duì)于擬行ART的AZFc微缺失患者，可以進(jìn)行PGT，選擇女?huà)胫踩牖蛘呖紤]供精[8]。

四、YCMs的檢測(cè)方法

已發(fā)現(xiàn)的AZF區(qū)基因微缺失相關(guān)STS位點(diǎn)達(dá)數(shù)百個(gè)，各STS位點(diǎn)對(duì)應(yīng)AZF的不同區(qū)域。國(guó)內(nèi)現(xiàn)有的AZF微缺失臨床檢測(cè)試劑多遵循歐洲專家共識(shí)，檢測(cè)sY84、sY86、sY127、sY134、sY254及sY255這6個(gè)STS位點(diǎn)[7]?？捎糜跈z測(cè)AZF區(qū)域微缺失方法包括多重PCR、實(shí)時(shí)熒光PCR、基因芯片等。

1.多重PCR法：多重PCR結(jié)合瓊脂糖凝膠電泳是EAA/EMQN制定的標(biāo)準(zhǔn)方法，具有以下優(yōu)點(diǎn)：經(jīng)濟(jì)簡(jiǎn)便性，多個(gè)目的基因在同一反應(yīng)管中被檢出，將大大節(jié)省時(shí)間，節(jié)省試劑成本；快速高效性，在同一PCR反應(yīng)管內(nèi)同時(shí)對(duì)多個(gè)目的基因進(jìn)行分型；系統(tǒng)性，多重PCR適宜于成組檢測(cè)[7]。但是多重PCR的局限性在實(shí)驗(yàn)中也凸顯出來(lái)，相對(duì)于常規(guī)PCR有更高的技術(shù)要求，例如針對(duì)每一個(gè)缺失位點(diǎn)都要設(shè)計(jì)單一引物，前期程序復(fù)雜，容易引起假陰性和假陽(yáng)性結(jié)果。而且瓊脂糖凝膠電泳分辨率較低，無(wú)法分辨相對(duì)分子質(zhì)量相對(duì)接近的STS位點(diǎn)，如EAA/EMQN推薦檢測(cè)的6個(gè)STSs中，有兩組相對(duì)分子質(zhì)量接近的STS，分別是sY127(274bp)與sY134(301bp)，sY84(326bp)與sY86(320bp)，以上位點(diǎn)在瓊脂糖電泳條件下很難在一個(gè)泳道分離。因此EAA/EMQN在推薦的檢測(cè)方法中，建議把這些STS分成兩組檢測(cè)，同時(shí)長(zhǎng)時(shí)間電泳確保分辨率，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)耗時(shí)，增加工作量。

2.熒光定量PCR法:熒光定量PCR法是臨床AZF缺失檢測(cè)試劑盒常用的檢測(cè)方法。作為臨床檢驗(yàn)中最常用的分子生物學(xué)手段，熒光定量PCR法的檢測(cè)敏感度和可靠性已經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的臨床驗(yàn)證。但是，由于熒光定量PCR技術(shù)只有對(duì)應(yīng)FAM、VIC、ROX及Cy5 4種熒光染料的檢測(cè)通道，每個(gè)檢測(cè)體系最多可檢測(cè)3個(gè)檢測(cè)指標(biāo)+1個(gè)質(zhì)控指標(biāo)。以現(xiàn)有針對(duì)歐洲共識(shí)6個(gè)STS位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)的試劑盒為例，每例樣本檢測(cè)需至少準(zhǔn)備2個(gè)擴(kuò)增體系，如對(duì)我國(guó)共識(shí)所推薦的8個(gè)STS位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)則需要準(zhǔn)備3個(gè)甚至4個(gè)擴(kuò)增體系。隨著對(duì)人Y染色體生精相關(guān)基因的深入研究，男性生精相關(guān)基因STS檢測(cè)位點(diǎn)還可能進(jìn)一步增加，數(shù)量過(guò)多的擴(kuò)增體系會(huì)顯著增加操作難度及污染風(fēng)險(xiǎn)，造成質(zhì)量控制難度大幅增加[5]。

3.其他檢測(cè)方法：盡管高通量測(cè)序(next-generation sequencing, NGS)技術(shù)在臨床基因檢測(cè)中越來(lái)越受到歡迎，但由于Y染色體結(jié)構(gòu)的特殊性，現(xiàn)階段不適合將WGS應(yīng)用于YCMs篩查。大多數(shù)致病性YCMs廣泛分布在Y染色體常染色質(zhì)的擴(kuò)增子區(qū)，用PCR擴(kuò)增來(lái)篩選STS位點(diǎn)更適合于鑒定這些缺失[21]。隨著分子生物技術(shù)的進(jìn)展，基于基因芯片的基因微缺失檢測(cè)技術(shù)日漸成熟，以基因芯片技術(shù)將逐步取代需要建立多個(gè)擴(kuò)增體系的PCR技術(shù)進(jìn)行多基因位點(diǎn)檢測(cè)。該方法將PCR與分子雜交技術(shù)結(jié)合，具有自動(dòng)化、集成化、微量化、高通量等優(yōu)點(diǎn)，在實(shí)驗(yàn)室間推廣。

五、YCMs的篩查策略

ASRM和EAA/EMQN等專業(yè)協(xié)會(huì)發(fā)布指南建議對(duì)嚴(yán)重少精癥(精子數(shù)量<5×106/ml)的男性進(jìn)行篩查[7]。然而最近的研究表明篩查閾值可能需要調(diào)整。Kohn等[8]開(kāi)展的Meta分析發(fā)現(xiàn)，精子數(shù)量為1×106/ml ～5×106/ml和5×106/ml ～20×106/ml的YCMs發(fā)生率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而在精子數(shù)量為0～1×106/ml和1×106/ml ～5×106/ml的男性中，YCMs的發(fā)生率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.001)，因此建議將檢測(cè)的閾值降低到精子數(shù)1×106/ml以下。Johnson等[22]回顧性研究發(fā)現(xiàn)，以精子數(shù)5×106/ml為篩選閾值具有100%的敏感度和13%的特異性；將該閾值降低到1×106/ml仍具有100%的敏感度，但特異性提高到24%。進(jìn)一步降低到0.5×106/ml可以再增加特異性，由于精子數(shù)為0.5×106/ml ～1×106/ml的男性患者YCMs的發(fā)生率相對(duì)較高，所以仍推薦1×106/ml作為篩查閾值[23]。

研究表明，在建立更好的男性少弱精癥基因篩查和診斷策略前，需要開(kāi)展更多研究來(lái)尋找本效益比和醫(yī)學(xué)收益上比較適當(dāng)?shù)拈撝?，后續(xù)指南應(yīng)建議更新篩查標(biāo)準(zhǔn)，包括更低的篩查閾值和考慮其他變量，以便更加合理地進(jìn)行篩查。