譚國(guó)忠， 江千舟

廣州醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院牙體牙髓科·廣州市口腔再生醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)與應(yīng)用研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州（510182）

牙髓根尖周病常規(guī)治療方法為根管治療術(shù)，但治療后由于牙髓和部分牙體組織的喪失牙齒營(yíng)養(yǎng)缺失和抗折能力下降易導(dǎo)致牙折發(fā)生。理想的牙髓治療形式是用健康的牙髓組織取代病變或壞死的牙髓組織，實(shí)現(xiàn)牙髓再生，以恢復(fù)牙齒的正?；盍?。目前，潛在的方法包括根管血運(yùn)重建、干細(xì)胞治療、牙髓植入、支架植入、三維細(xì)胞打印、可注射支架和基因治療［1］。但由于牙髓再生治療技術(shù)尚未成熟，暫無(wú)統(tǒng)一治療標(biāo)準(zhǔn)，確切療效也尚未可知，因此，牙髓再生在牙體牙髓領(lǐng)域的研究仍需更多的探索與深入研究。許多學(xué)者應(yīng)用組織工程技術(shù)，從支架材料、種子細(xì)胞和生長(zhǎng)因子等方面對(duì)牙髓再生的研究進(jìn)行探索，并取得一定進(jìn)展。近年來(lái)隨著3D 打印技術(shù)逐漸應(yīng)用于組織再生領(lǐng)域，通過(guò)3D 打印構(gòu)建的組織工程支架——3D 打印“牙髓復(fù)合體”為牙髓再生的研究提供了新的方向，本文針對(duì)相關(guān)研究作一綜述。

1 3D 生物打印技術(shù)

3D 打印技術(shù)又稱增材制造（additive manufacturing，AM）或快速成型，是一種與傳統(tǒng)減材制造方式相反，以三維數(shù)字模型為基礎(chǔ)，通過(guò)逐層疊加的方式將材料結(jié)合起來(lái)的工藝［2］?；玖鞒淌牵菏紫韧ㄟ^(guò)軟件設(shè)計(jì)和各種掃描系統(tǒng)進(jìn)行數(shù)據(jù)采集，然后將數(shù)據(jù)導(dǎo)入計(jì)算機(jī)軟件進(jìn)行三維重建，以STL 格式保存，最后數(shù)據(jù)經(jīng)3D 打印機(jī)識(shí)別進(jìn)行3D 打印。其主要優(yōu)點(diǎn)包括：精準(zhǔn)制作、快速成型、節(jié)能環(huán)保和可制作個(gè)性化結(jié)構(gòu)等［3-4］。在組織工程牙髓再生的應(yīng)用中，3D 打印存在明顯優(yōu)勢(shì)，可以實(shí)現(xiàn)支架結(jié)構(gòu)和形狀的可變性和可控性。在3D 打印對(duì)支架結(jié)構(gòu)的控制上，能將支架設(shè)計(jì)成微米級(jí)甚至納米級(jí)的多孔各向同性纖維，從而誘導(dǎo)細(xì)胞的分布表現(xiàn)出規(guī)律性和方向性。Hsiao 等［5］利用3D 打印設(shè)計(jì)微絲間隙寬度為150 μm 和200 μm 聚乳酸支架，體外探討不同微絲間隙對(duì)人牙髓干細(xì)胞生長(zhǎng)方向性的影響，結(jié)果顯示前者更容易誘導(dǎo)細(xì)胞定向生長(zhǎng)。3D 打印還可設(shè)計(jì)適應(yīng)患者的個(gè)性化結(jié)構(gòu)支架，Han 等［6］通過(guò)3D 生物打印生產(chǎn)一個(gè)具有特異性形狀的三維牙本質(zhì)-牙髓復(fù)合體，能誘導(dǎo)人牙髓干細(xì)胞在單一結(jié)構(gòu)內(nèi)的局部分化，細(xì)胞的存活率可達(dá)到88%以上。3D 打印技術(shù)在神經(jīng)再生的研究中也取得一定的進(jìn)展，Hu 等［7］采用3D 打印技術(shù)制備了由低溫聚合明膠甲基丙烯酰凝膠和脂肪干細(xì)胞組成的生物導(dǎo)管，成功地連接10 mm 缺損的坐骨神經(jīng)間隙，該技術(shù)在周圍神經(jīng)再生展示了很大的潛力。因此，利用3D 打印支架負(fù)載不同干細(xì)胞形成牙髓神經(jīng)構(gòu)建體，有望在牙髓神經(jīng)再生的研究加以應(yīng)用。近年來(lái)，3D 打印可實(shí)現(xiàn)將生物材料、活細(xì)胞和生物活性分子打印成復(fù)雜的3D 功能組織結(jié)構(gòu)，被定義為“生物打印”［8］。3D 生物打印能精確錨定各種種子細(xì)胞在制造支架上的某些位置，對(duì)細(xì)胞和生物材料定位具有顯著可控性，同時(shí)在內(nèi)部和外部細(xì)節(jié)上保持了很高的準(zhǔn)確性［9］。由此可見，3D 生物打印在牙髓再生的研究中具有較大潛力。

2 3D 打印“牙髓復(fù)合體”的支架材料

在牙髓再生過(guò)程中，理想的支架材料發(fā)揮重要作用，其良好的生物相容性和生物活性有利于種子細(xì)胞的附載和生長(zhǎng)因子的持續(xù)緩慢釋放，也為細(xì)胞的遷徙、增殖和分化提供適宜的微環(huán)境，最終誘導(dǎo)牙髓樣組織的形成。目前應(yīng)用于牙髓再生研究的支架材料主要是天然和人工合成材料兩大類。

天然材料是從自然界提取的可降解材料，成分與細(xì)胞外基質(zhì)相似，通常具備良好的生物活性和細(xì)胞相容性，結(jié)合種子細(xì)胞或生長(zhǎng)因子制備成水凝膠可作為牙髓再生研究的支架材料。Yu 等［10］將明膠與海藻酸鈉結(jié)合，通過(guò)3D 打印技術(shù)制備凝膠支架，驗(yàn)證了該支架可為人牙髓細(xì)胞的生長(zhǎng)提供適宜微環(huán)境，促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)與增殖，可作為組織工程牙髓再生的候選材料。

人工合成材料以聚合物和生物陶瓷類為主，通常具有較好的機(jī)械性能，且能避免病原體傳播和減少免疫原性，但親水性和細(xì)胞相容性較差，在一定程度上限制其應(yīng)用［11-12］。目前，在探索牙髓再生的過(guò)程中，利用光交聯(lián)聚合物（如明膠甲基丙烯酰胺水凝膠）進(jìn)行3D 制造，由于具有良好的生物相容性和高效的血運(yùn)重建功能，已被證明在牙髓和全牙再生方面前景良好［13-14］。也有一些研究報(bào)道聚合物納米纖維在牙髓再生中可取得一定效果［15-16］。在生物陶瓷類的應(yīng)用中，Hilkens 等［17］利用3D 打印制備羥基磷灰石支架，將三維支架負(fù)載牙髓干細(xì)胞和根尖乳頭干細(xì)胞后植入小鼠皮下，結(jié)果表明有血管化牙髓樣組織的形成，為3D 打印“牙髓復(fù)合體”在牙髓再生領(lǐng)域的應(yīng)用帶來(lái)了新的希望。近年來(lái)，多種新型3D 支架材料也已被嘗試應(yīng)用于牙髓再生研究，Ho 等［18］將人牙髓細(xì)胞培養(yǎng)于3D 打印的聚已酸內(nèi)酯復(fù)合支架，結(jié)果顯示支架有利于人牙髓細(xì)胞的增殖和分化。

3 3D 打印“牙髓復(fù)合體”的種子細(xì)胞

應(yīng)用于牙髓再生的種子細(xì)胞通常是干細(xì)胞，基于干細(xì)胞的移植方法已被研究來(lái)取代牙髓和根尖周組織的功能。干細(xì)胞作為牙髓再生的一個(gè)關(guān)鍵要素，主要包括牙髓干細(xì)胞（dental pulp stem cells，DPSCs）、根尖乳頭干細(xì)胞（stem cells from apical papilla，SCAPs）和人脫落乳牙牙髓干細(xì)胞（stem cells from the human pulp of exfoliated deciduous teeth，SHEDs），這些干細(xì)胞在牙髓再生方面存在較大潛能［19］。

牙髓干細(xì)胞具有高增殖率和多分化能力，而且還容易獲取，可在恒牙或乳牙拔除后收集提取。在牙髓再生研究中，Park 等［20］使用3D 生物打印技術(shù)創(chuàng)建包含人牙髓干細(xì)胞的生物工程結(jié)構(gòu)體，結(jié)果顯示細(xì)胞活性在14 d 后超過(guò)90%，牙本質(zhì)涎磷蛋白也有高表達(dá)，提示3D 打印結(jié)構(gòu)體可加速牙髓干細(xì)胞的牙源性分化，具有用于牙髓再生的巨大潛力。

根尖乳頭干細(xì)胞與根尖孔接近，有學(xué)者認(rèn)為這些細(xì)胞在再生過(guò)程中可進(jìn)入根管間隙［21］。最重要的是，根尖乳頭干細(xì)胞在根尖位置能使這些細(xì)胞獲得側(cè)支血液循環(huán)，這讓它們?cè)谒枨矢腥竞蛪乃罆r(shí)也能存活［22］?；谝陨涎芯?，根尖乳頭干細(xì)胞被認(rèn)為是牙髓再生研究的候選細(xì)胞。Athirasala等［23］從人第三磨牙的根尖乳頭中提取根尖乳頭干細(xì)胞，并將細(xì)胞包裹在牙本質(zhì)衍生水凝膠中，經(jīng)DIW 系統(tǒng)生物打印后細(xì)胞培養(yǎng)5 d，存活率高于90%。

人脫落乳牙牙髓干細(xì)胞同樣具有高度增殖能力，能夠形成牙髓樣組織并分化為成牙髓細(xì)胞。Rosa 等［24］研究表明，接種于支架上的人脫落乳牙牙髓干細(xì)胞在植入小鼠皮下能夠形成血管化的牙髓和牙本質(zhì)樣組織。

4 3D 打印“牙髓復(fù)合體”的生長(zhǎng)因子

組織工程中，生長(zhǎng)因子是再生過(guò)程中的關(guān)鍵因素，其能與特定的細(xì)胞膜受體結(jié)合，可激活組織工程中的各種機(jī)制和途徑，如細(xì)胞遷移、存活、粘附、增殖，生長(zhǎng)和分化為所需的細(xì)胞類型［25］。許多生物活性生長(zhǎng)因子在牙本質(zhì)生成過(guò)程中形成于牙本質(zhì)基質(zhì)內(nèi)，不僅有包括驅(qū)動(dòng)根尖乳頭干細(xì)胞的牙源性分化的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）和骨形成蛋白2（bone morphogenetic protein-2，BMP-2），也有促進(jìn)形成血管和牙髓再生的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和血小板源生長(zhǎng)因子（platelet-derived growth factor，PDGF）［26］。在牙髓再生的應(yīng)用中，生長(zhǎng)因子可促進(jìn)根管內(nèi)干細(xì)胞和祖細(xì)胞的趨化、增殖和分化，為牙髓再生提供基礎(chǔ)［27-29］。因此，負(fù)載生長(zhǎng)因子的支架可以進(jìn)一步支持牙源性分化和推動(dòng)牙髓血管重建，促進(jìn)牙髓再生。Ashiry 等［30］用VEGF-2、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）、PDGF、神經(jīng)生長(zhǎng)因子和BMP-7 處理后的自體牙髓嵌入在殼聚糖水凝膠支架，后續(xù)移植到狗的壞死年輕恒牙中，牙髓再生和牙本質(zhì)樣組織的形成均取得理想的效果。雖然生長(zhǎng)因子在牙髓再生過(guò)程中起到關(guān)鍵作用，但是如何在時(shí)間和空間上精準(zhǔn)調(diào)控生長(zhǎng)因子的釋放劑量，進(jìn)一步提高牙髓再生成功率尚有待解決。Huang 等［31］采用3D 打印技術(shù)制備介孔硅酸鈣支架作為藥物載體釋放BMP-2，新型三維支架在BMP-2 傳遞系統(tǒng)中表現(xiàn)良好，人牙髓干細(xì)胞牙源性相關(guān)蛋白表達(dá)上調(diào)。3D 打印支架對(duì)于生長(zhǎng)因子在時(shí)間和空間上的劑量調(diào)控是未來(lái)研究的方向，有利于生長(zhǎng)因子在牙髓再生過(guò)程中發(fā)揮更高的效率。

5 展 望

3D 打印給牙再生研究帶來(lái)重大創(chuàng)新。其中，3D 打印生物工程支架在牙齒及其支持結(jié)構(gòu)（牙周韌帶、牙槽骨和牙骨質(zhì)等）的研究中取得了一定進(jìn)展［8］。由于牙髓系統(tǒng)是一個(gè)高度血管化和神經(jīng)支配的組織，牙髓再生包括牙髓及相關(guān)組織再生、牙本質(zhì)形成、血管重建和神經(jīng)再生，被認(rèn)為是一個(gè)巨大的挑戰(zhàn)?，F(xiàn)階段中，采用3D 打印技術(shù)打印細(xì)胞或生長(zhǎng)因子在牙髓再生的研究尚處于起步階段，通過(guò)將活細(xì)胞和基質(zhì)材料結(jié)合進(jìn)行3D 生物打印用于牙髓再生仍存在一定局限性。其中，如何有效為3D 牙髓構(gòu)造體中的細(xì)胞提供氧氣和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)是研究的一大難點(diǎn)［32］。隨著3D 打印技術(shù)的不斷完善發(fā)展，期待在不久將來(lái)通過(guò)3D 打印可構(gòu)建出功能完整的牙髓支架，形成生物活性良好且具有仿生血管和神經(jīng)效果的3D 打印“牙髓復(fù)合體”，為牙髓再生提供新的選擇和可能性。

【Author contributions】Tan GZ collected the references and wrote the article. Jiang QZ revised and guided the writing of the article. All authors read and approved the final manuscript as submitted.