李冰 韓琳 韓佳麗 高譽珊 沈一凡 秦建國

摘要 目的：探討通絡(luò)益腎方對單側(cè)輸尿管結(jié)扎大鼠腎間質(zhì)纖維化及腎上腺髓質(zhì)素（ADM）表達(dá)的影響，并探究其可能的機制。方法：將50只雄性SD大鼠按隨機數(shù)字表法分為5組：假手術(shù)組、模型組、通絡(luò)益腎方組、纈沙坦組、ADM觀察組，每組10只。分別采取相應(yīng)的干預(yù)措施。Masson染色觀察大鼠腎臟的病理改變;免疫組織化學(xué)法檢測大鼠腎臟E-鈣黏蛋白（E-cadherin）的表達(dá);放射免疫法檢測大鼠血清ADM水平;ELISA檢測大鼠血清Ⅲ型前膠原（PCⅢ）、腎組織ADM水平，并對腎組織ADM和E-cadherin進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果：與假手術(shù)組比較，模型組血清ADM、PCⅢ水平明顯升高（P<0.01），腎組織E-cadherin、ADM水平降低（P<0.01）。與模型組比較，通絡(luò)益腎方組和纈沙坦組血清ADM、PCⅢ水平降低（P<0.01、P<0.05），腎組織E-cadherin、ADM水平升高（P<0.01、P<0.05）;ADM觀察組血清PCⅢ水平降低（P<0.05），血清ADM、腎組織E-cadherin、ADM水平升高（P<0.05）。其中腎組織ADM與E-cadherin水平呈顯著正相關(guān)（r=0.62，P<0.01）。結(jié)論：通絡(luò)益腎方能夠改善腎間質(zhì)纖維化模型（UUO）大鼠腎間質(zhì)纖維化，抑制纖維化指標(biāo)PCⅢ的表達(dá)，上調(diào)E-cadherin的表達(dá)，其作用機制可能是通過上調(diào)腎臟局部ADM蛋白表達(dá)而實現(xiàn)的。

關(guān)鍵詞 通絡(luò)益腎方;腎間質(zhì)纖維化;單側(cè)輸尿管梗阻;腎上腺髓質(zhì)素;血清PCⅢ;E-鈣黏蛋白

Abstract Objective：To investigate the effect of Tongluo Yishen Recipe（TLYSR） on renal interstitial fibrosis and ADM expression in UUO rats，and to explore its possible mechanism.Methods：A total of 50 male SD rats were randomly divided into 5 groups：a sham operation group，a model group，a TLYSR group，a valsartan group and a ADM treatment group，with 10 rats in each group.Corresponding intervention measures were taken in each group.The pathological changes of kidney were observed by Masson staining; the expression of E-cadherin in kidney was detected by IHC; the content of serum ADM was detected by radioimmunoassay; the content of serum PCⅢ and ADM in renal tissue were detected by ELISA，and the correlation between ADM and E-cadherin was analyzed.Results：Compared with sham operation group，the levels of serum ADM and PCⅢ in model group were significantly increased（P<0.01），and the levels of E-cadherin and ADM in renal tissue were decreased（P<0.01）.Compared with the model group，the contents of serum ADM and PCⅢ in TLYSR group and valsartan group were decreased（P<0.01，P<0.05），and the contents of E-cadherin and ADM in renal tissue were increased（P<0.01，P<0.05）; the contents of serum PCⅢ in ADM treatment group were decreased（P<0.05），and the contents of serum ADM，E-cadherin and ADM in renal tissue were increased（P<0.05），and the levels of ADM and E-cadherin in the renal tissue were positively correlated（r=0.62，P<0.01）.Conclusion：TLYSR can improve renal interstitial fibrosis in UUO rats，inhibit the expression of fibrosis index PCⅢ and up regulate the expression of E-cadherin，which may be achieved by up regulating the expression of ADM protein in kidney.

Keywords Tongluo Yishen Recipe; Interstitial fibrosis; UUO; ADM; PCⅢ; E-cadherin

中圖分類號：R289.5文獻(xiàn)標(biāo)識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.20.010

腎間質(zhì)纖維化（Renal Interstitial Fibrosis，RIF）是細(xì)胞外基質(zhì)（Extracellular Matrix，ECM）過度沉積而造成的，是影響腎功能的重要因素，是各種慢性腎病進(jìn)展為終末期腎病（End Stage Renal Disease，ESRD）的主要病因，改善腎間質(zhì)纖維化對于延緩ESRD的進(jìn)程意義重大[1]。研究表明，腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化（Epithelial Mesenchymal Transition，EMT）是腎間質(zhì)纖維化的主要機制之一，故進(jìn)一步研究EMT的調(diào)控機制和減少ECM的合成是拮抗腎間質(zhì)纖維化的重要途徑[2-3]。腎上腺髓質(zhì)素（Adrenomedullin，ADM）是一種血管活性多肽，可通過抑制轉(zhuǎn)化生長因子-β1的表達(dá)，抑制腎小管上皮細(xì)胞的遷移等發(fā)揮拮抗腎間質(zhì)纖維化的作用[4-5]。本課題組前期實驗研究表明，活血化瘀中藥能減輕腎間質(zhì)纖維化病變，并明顯上調(diào)ADM的表達(dá)[6-7]。為進(jìn)一步證明其可能的作用機制，本研究以通絡(luò)益腎方為干預(yù)藥物，觀察通絡(luò)益腎方對單側(cè)輸尿管梗阻大鼠腎間質(zhì)纖維化及ADM表達(dá)的影響，探討該方發(fā)揮抗纖維化可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 選取雄性SD大鼠50只，6周齡，體質(zhì)量（200±10）g，購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司[許可證號：SCXK（京）2012-0001]。飼養(yǎng)于SPF動物房內(nèi)，飼養(yǎng)室溫為25 ℃左右，濕度為50%左右，恒溫恒濕，12 h/12 h明暗交替環(huán)境，自由飲水和進(jìn)食。本研究經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物倫理委員會批準(zhǔn)（BUCM-4-2016111701-4023）。

1.1.2 藥物 通絡(luò)益腎方顆粒（丹參20 g、紅花10 g、雞血藤15 g等，北京康仁堂藥業(yè)有限公司）;纈沙坦膠囊（北京諾華制藥有限公司，批號：x1810）;腎上腺髓質(zhì)素（AnaSpec公司，美國，貨號：AS-60454）。

1.1.3 試劑與儀器 磷酸鹽緩沖液（PBS）（福建邁新生物技術(shù)有限公司，貨號：PBS-0060）;兔抗E-cadherin抗體（Proteintech公司，美國，批號：20874-1-AP）;Masson三色染色試劑盒（福建邁新生物技術(shù)有限公司，貨號：MST-8003）;ADM放免試劑盒（北京華英生物技術(shù)研究所，批號：20170922）;ADM ELISA試劑盒（北京華英生物技術(shù)研究所，批號：20161207）;PCⅢ試劑（北京華英生物技術(shù)研究所，批號：HY-E0007）;封閉山羊血清工作液（北京康為世紀(jì)公司，貨號：CW0130S）;兔超敏二步法免疫組織化學(xué)檢測試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，貨號：PV-9001）;抗原修復(fù)液（福建邁新生物技術(shù)有限公司，貨號：DIG-3008）;DAB顯色試劑盒（福建邁新生物技術(shù)有限公司，貨號：DAB-0031）;4%多聚甲醛（北京索萊寶生物科技有限公司，貨號：P1110-500）;多聚賴氨酸（福建邁新生物技術(shù)有限公司，貨號：GLU-0040）。生物組織包埋機（金華市益通醫(yī)療設(shè)備有限公司，型號：YD-6L）;酶標(biāo)儀（無錫華衛(wèi)德朗儀器有限公司，型號：DR-200BS）;光學(xué)顯微鏡（Olympus公司，日本，型號：CKX41）;分光光度計（上海佑科儀器儀表有限公司，型號：N5000）;-80 ℃冰箱（青島海爾公司，型號：DW-86L578J）;高速冷凍離心機（Hitachi公司，日本，型號：CP100WX）。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 選取50只SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，分別置于代謝籠里取尿，檢測其尿蛋白和尿紅細(xì)胞指標(biāo)均為陰性結(jié)果后開始實驗。將大鼠按隨機數(shù)字表法分為5組：假手術(shù)組、模型組、通絡(luò)益腎方組、纈沙坦組、ADM觀察組，每組10只。給予10%的水合氯醛，按30 mg/（kg體質(zhì)量）的劑量腹腔注射麻醉，切開背部暴露出大鼠右側(cè)腎臟，剝離出輸尿管后于其中上1/3處結(jié)扎并剪斷，縫合腹部。假手術(shù)組僅剝離出輸尿管后不結(jié)扎，隨即縫合腹部。

1.2.2 給藥方法 通絡(luò)益腎方組給予通絡(luò)益腎方1.5 g/（kg·d），灌胃給藥;纈沙坦組給予纈沙坦10 mg/（kg·d），灌胃給藥;ADM觀察組于術(shù)中皮下埋放微量滲透泵，持續(xù)給予ADM（1～50）300 ng/h;假手術(shù)組、模型組、ADM觀察組均每日予以等量的生理鹽水灌胃。各組大鼠灌胃2周后稱重殺檢。由于術(shù)后感染，殺檢時每組只剩下8只大鼠。

1.2.3 指標(biāo)檢測與方法

1.2.3.1 腎組織病理學(xué)檢測 4 ℃條件下迅速剝離右側(cè)腎臟，冠狀位縱向剖開，放入4%多聚甲醛中固定，石蠟包埋腎組織后切片，行Masson染色測定，光學(xué)顯微鏡下觀察腎組織病理學(xué)改變。

1.2.3.2 各組大鼠血清ADM、血清Ⅲ型前膠原（PCⅢ）水平檢測 收集各組血液樣品后，分離血漿，按照說明書進(jìn)行檢測：腹主動脈取血2 mL，注入含有EDTA和抑肽酶抗凝的試管中，混勻，4 ℃、3 000 r/min離心10 min，離心半徑8 cm，取上清液，置于EP管中，-80 ℃冰箱保存。采用放射免疫法測定血清ADM水平;酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）法測定血清PCⅢ水平。

1.2.3.3 各組大鼠腎組織ADM水平檢測 腹主動脈取血后，處死大鼠，取其新鮮右側(cè)腎臟，剝離腎被膜，吸取血跡，輕輕研磨腎臟組織，于100 ℃的水浴鍋中水浴10 min，再次進(jìn)行研磨，然后4 ℃，3 000 r/min離心5 min，離心半徑8 cm，取離心后的上清液，保存于-20 ℃的冰箱中。采用ELISA法檢測腎組織ADM水平。

1.2.3.4 各組大鼠腎組織E-cadherin表達(dá)檢測 ? 采用免疫組織化學(xué)（SABC）法檢測：一抗為小鼠抗大鼠E-cadherin（1∶800）單克隆抗體，搖勻，放置于濕盒中，用保鮮膜包裹，在4 ℃的冰箱中過夜;二抗為山羊抗小鼠IgG，搖勻，濕盒中放置25 min;DAB顯色，光學(xué)顯微鏡下觀察顯色情況，顯色呈棕黃色后終止染色。采用Image pro plus 6.0圖像分析軟件在200倍光鏡下觀察表達(dá)情況，每只大鼠選取5張切片，計算每張切片平均光密度值（累計光密度/視野面積），進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組采用單因素方差分析，同時進(jìn)行方差齊性檢驗，方差齊性采用LSD-t檢驗，方差不齊性采用Tamhane-t檢驗;相關(guān)性采用Pearson相關(guān)性分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠腎組織病理改變比較 腎組織Masson染色顯示，假手術(shù)組腎臟基本無病變;模型組可見腎間質(zhì)變寬，充滿藍(lán)紫色條索狀膠原，部分腎小管萎縮;與模型組比較，通絡(luò)益腎方組、纈沙坦組、ADM組上述病變有不同程度的減輕。見圖1。

2.2 各組大鼠血清ADM、PCⅢ水平表達(dá)比較 與假手術(shù)組比較，模型組血清ADM水平明顯升高（P<0.01）;與模型組比較，通絡(luò)益腎方組和纈沙坦組明顯降低（P<0.01），ADM觀察組升高（P<0.05）。其中通絡(luò)益腎方組和纈沙坦組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見表1。

與假手術(shù)組比較，模型組血清PCⅢ水平明顯升高（P<0.01）;與模型組比較，通絡(luò)益腎方組、纈沙坦組、ADM觀察組明顯降低（P<0.01、P<0.05、P<0.05），其中3組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見表2。

2.3 各組大鼠腎臟E-cadherin、ADM水平比較及相關(guān)性分析 在假手術(shù)組中E-cadherin表達(dá)主要見于腎小管細(xì)胞胞質(zhì)和胞膜。與假手術(shù)組比較，模型組E-cadherin水平減少（P<0.01）;與模型組比較，通絡(luò)益腎方組、纈沙坦組、ADM觀察組增加（P<0.01、P<0.01、P<0.05），3組間兩兩比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。與假手術(shù)組比較，模型組腎組織ADM水平降低（P<0.01）;與模型組比較，通絡(luò)益腎方組、纈沙坦組、ADM觀察組升高（P<0.05），其中3組間兩兩比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見圖2，表3。

腎組織ADM水平與E-cadherin水平相關(guān)性分析數(shù)據(jù)顯示，ADM與E-cadherin水平正相關(guān)（r=0.62，P<0.01）。見圖3。

3 討論

腎間質(zhì)纖維化在中醫(yī)上屬于“水腫”“關(guān)格”“癃閉”“溺毒”等范疇。關(guān)于此病的病機認(rèn)識，目前尚未有統(tǒng)一定論，多數(shù)醫(yī)者認(rèn)為該病是正氣漸虛，邪毒漸盛，正邪相爭，邪毒旺盛，正氣衰竭的病理過程，以腎虛為本虛之根本，痰濕、濕熱、瘀血、濁毒為標(biāo)實[8-9]。秦建國教授結(jié)合多年臨床經(jīng)驗，基于“久病必瘀”“久病入絡(luò)”的中醫(yī)理論，認(rèn)為本病是因?qū)嵵绿摱桑C關(guān)鍵為“腎絡(luò)瘀損”[10-11]。病久瘀血阻于腎絡(luò)，腎絡(luò)瘀阻后引起該部分腎絡(luò)結(jié)構(gòu)的損傷和功能的廢用，進(jìn)而致使其他腎絡(luò)過亢而損傷廢用，最終腎體受傷，腎氣化失司，水飲內(nèi)停，溺毒留滯，百病叢生[12]。提出“通絡(luò)益腎”的治則，治以通絡(luò)益腎方。該方臨床療效顯著，由丹參、紅花、雞血藤組成，結(jié)合本病病程較長，故方中選用了具有較強活血化瘀功效的丹參、紅花，雞血藤活血通絡(luò)，可活腎之血絡(luò)，通腎經(jīng)之責(zé)，三藥合用共奏活血化瘀通絡(luò)之效。

腎小管上皮轉(zhuǎn)分化是腎間質(zhì)纖維化的中心環(huán)節(jié)，轉(zhuǎn)分化后形成的肌成纖維細(xì)胞能增殖并分泌大量細(xì)胞外基質(zhì)，肌成纖維細(xì)胞的增殖和細(xì)胞外基質(zhì)的過度聚集是腎間質(zhì)纖維化的主要病理特征[13]。當(dāng)發(fā)生腎小管上皮轉(zhuǎn)分化時，E-cadherin減少或缺失，上皮細(xì)胞黏附性減少，基質(zhì)膠原成分積聚，腎小管基底膜崩解等，其中E-cadherin表達(dá)的減少和缺失是最顯著的特征，也是腎小管上皮轉(zhuǎn)分化的第一步[14-15]。Ⅲ型膠原是細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分之一，血清PCⅢ是Ⅲ型膠原的前體。研究表明，血清PCⅢ是腎間質(zhì)纖維化的獨立影響因素，故將E-cadherin、PCⅢ作為研究腎間質(zhì)纖維化的重要觀察指標(biāo)[16]。本研究Masson染色結(jié)果顯示，各手術(shù)組可見不同程度的纖維組織增生，發(fā)生纖維化改變，各觀察組較模型組膠原纖維沉積減少，纖維化程度減輕，說明通絡(luò)益腎方能夠抑制纖維組織增生;模型組腎組織E-cadherin表達(dá)較假手術(shù)組明顯降低，血清PCⅢ表達(dá)較假手術(shù)組明顯升高，通絡(luò)益腎方組、纈沙坦組、ADM組腎組織E-cadherin表達(dá)較模型組有不同程度升高，血清PCⅢ表達(dá)較模型組有不同程度降低，說明通絡(luò)益腎方能抑制腎間質(zhì)細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)化，減少細(xì)胞外基質(zhì)沉積，進(jìn)而抑制腎間質(zhì)纖維化的進(jìn)程。

ADM作為一種血管活性多肽，在腎臟中的表達(dá)和分布較多，以自分泌或旁分泌的方式，發(fā)揮擴張血管、降低血壓，拮抗TGF-β1表達(dá)，抑制細(xì)胞增殖，抑制腎小管上皮、內(nèi)皮、血管平滑肌細(xì)胞遷移等生物學(xué)作用。目前研究表明，各種腎臟疾病的發(fā)病機制與ADM密切相關(guān)，在疾病的進(jìn)程中存在著不同程度表達(dá)的變化，提示ADM在腎臟疾病的治療中可能有重要的前景[17]。

Dong等[18]研究表明，ADM可通過調(diào)節(jié)HIF-1對遠(yuǎn)程缺血預(yù)處理引起的大鼠腎臟損傷起到保護(hù)作用。郝娟等[19]研究發(fā)現(xiàn)，ADM能抑制ALD誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞自噬，從而減少腎小管損傷，延緩腎損傷過程。本實驗中，大鼠腎組織ADM檢測結(jié)果顯示，模型組腎組織ADM水平較假手術(shù)組降低，通絡(luò)益腎方組、纈沙坦組、ADM組較模型組升高，說明藥物的治療可以上調(diào)腎組織ADM水平。與此同時，本實驗亦觀察了血清ADM水平變化，發(fā)現(xiàn)模型組血清ADM較假手術(shù)組升高，通絡(luò)益腎方和纈沙坦組較模型組降低，ADM組較模型組升高。說明單側(cè)輸尿管結(jié)扎造成大鼠腎臟損傷時，血清ADM代償性增加，這一點與以往的研究結(jié)果一致[20-22]。給予外源性ADM治療后，血清ADM、腎組織ADM均增加，據(jù)此我們推測ADM對單側(cè)輸尿管結(jié)扎大鼠腎臟的保護(hù)作用與血清ADM無關(guān)，與腎臟局部ADM密切相關(guān)，提示ADM可能以旁分泌的方式參與該病的進(jìn)程。分析腎組織ADM與E-cadherin的相關(guān)性，結(jié)果顯示，腎組織ADM與E-cadherin呈顯著正相關(guān)性，表明通絡(luò)益腎方能夠改善腎間質(zhì)纖維化模型（UUO）大鼠的腎間質(zhì)纖維化，抑制纖維化指標(biāo)PCⅢ的表達(dá)，上調(diào)E-cadherin的表達(dá)，其作用機制可能是通過上調(diào)腎臟局部ADM蛋白表達(dá)而實現(xiàn)的，但其具體機制尚待進(jìn)一步研究。

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（2020-11-20收稿 責(zé)任編輯：楊覺雄）