朱閩 彭杰 蔣越 買鵬宇 張禹姝

摘要 目的：基于整合藥理學(xué)和分子對(duì)接技術(shù)預(yù)測(cè)大黃防治前列腺癌可能的質(zhì)量標(biāo)志物。方法：通過中醫(yī)藥整合藥理學(xué)網(wǎng)絡(luò)計(jì)算研究平臺(tái)V2.0（TCMIP V2.0），將大黃化學(xué)信息進(jìn)行靶標(biāo)預(yù)測(cè)，與前列腺癌疾病靶標(biāo)信息進(jìn)行蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，從而開展藥物干預(yù)疾病的關(guān)鍵靶標(biāo)富集分析。在此基礎(chǔ)上，利用大黃的化學(xué)成分、關(guān)鍵靶標(biāo)、疾病通路的多維網(wǎng)絡(luò)，繪制中藥“成分-靶標(biāo)-通路-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖，解析獲得作用于這些關(guān)鍵靶標(biāo)的主要成分，然后依據(jù)中藥質(zhì)量標(biāo)志物（Q-marker）“五原則”結(jié)合已知相關(guān)文獻(xiàn)對(duì)大黃防治前列腺癌的質(zhì)量標(biāo)志物進(jìn)行預(yù)測(cè)分析。最后，應(yīng)用AutoDock Vina分子對(duì)接軟件對(duì)候選成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接計(jì)算和驗(yàn)證。結(jié)果：篩選得到大黃防治前列腺癌的活性成分14個(gè)，關(guān)鍵核心靶標(biāo)21個(gè)，涉及11條信號(hào)通路。分子對(duì)接表明雄激素受體（AR）與大黃蒽醌類中8個(gè)均入最佳藥物油水分配系數(shù)范圍的成分有較好的結(jié)合性。結(jié)論：通過TCMIP V2.0及前期文獻(xiàn)研究基礎(chǔ)上，分析并獲得大黃防治前列腺癌可能的質(zhì)量標(biāo)志物為大黃蒽醌類化合物，具體成分包括大黃素、大黃酸、大黃酚、蘆薈大黃素、大黃素甲醚等，對(duì)藥物和疾病的共同靶標(biāo)AR產(chǎn)生藥理作用。

關(guān)鍵詞 大黃;前列腺癌;質(zhì)量標(biāo)志物;中醫(yī)藥整合藥理學(xué)網(wǎng)絡(luò)計(jì)算研究平臺(tái)2.0;分子對(duì)接;中藥

Abstract Objective：To predict the possible quality markers of Radix et Rhizoma Rhei in the prevention and treatment of prostate cancer based on integrated pharmacology and molecular docking techniques.Methods：Through the integrated pharmacology research platform V2.0（TCMIPV2.0） of traditional Chinese medicine，the chemical information of Radix et Rhizoma Rhei was predicted，and the protein interaction（PPI） network was constructed with the disease target information of prostate cancer，so as to carry out the enrichment analysis of the key targets of drug intervention.On this basis，we used the multi-dimensional network of chemical components，key targets，and disease pathways of Radix et Rhizoma Rhei，draw the network diagram of “component-target-pathway-disease” of Chinese medicinal，analyzed and obtained the main components acting on these key targets，and then base on the quality mark of traditional Chinese medicinal，the “Five Principles” of Q-marker combined with known related literature were used predict and analyze the quality markers of Radix et Rhizoma Rhei in preventing and treating prostate cancer.Finally，the AutoDock Vina molecular docking software was used to calculate and verify the molecular docking of candidate components and key targets.Results：A total of 14 active components of Radix et Rhizoma Rhei against prostate cancer，21 key core targets and 11 signal pathways were screened.Molecular docking showed that there was a good binding between AR and 8 components of Radix et Rhizoma Rhei anthraquinones which were all in the range of optimal oil-water partition coefficient.Conclusion：Based on the integration of pharmacological V2.0 platform and previous literature research，the possible quality markers of Radix et Rhizoma Rhei in the prevention and treatment of prostate cancer are Radix et Rhizoma Rhei anthraquinones，including emodin，Rhein，chrysophanol，aloe-emodin，emodin methyl ether，etc.，which have pharmacological effects on AR of the common target of drugs and diseases.

Keywords Radix et Rhizoma Rhei; Prostate cancer; Quality marker; TCMIP V2.0; Molecular docking; Chinese medicine

中圖分類號(hào)：R285.5文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.20.007

大黃為蓼科植物掌葉大黃、藥用大黃及唐古特大黃的干燥根和根莖，性味苦寒，歸脾、胃、肝、大腸、心包經(jīng)，主瀉下攻積、逐瘀通經(jīng)、清熱瀉火、涼血解毒、利濕退黃[1]。大黃又稱為“將軍”，逐瘀瀉熱、推陳致新是其主要功效，可用于治療積滯便秘、血閉寒熱、癥瘕積聚等[2]。在中醫(yī)學(xué)中，前列腺癌為本虛標(biāo)實(shí)之證，臟腑虧虛為本，濕熱、痰濁、瘀血、氣滯為標(biāo)，且認(rèn)為該病主要臟腑病變責(zé)之于腎和膀胱[3]?；谥嗅t(yī)學(xué)對(duì)前列腺癌發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識(shí)，祛瘀消癥治法可廣泛應(yīng)用于前列腺癌疾病治療。而大黃作為常用的祛瘀消癥藥材，也經(jīng)常用于治療前列腺癌?，F(xiàn)有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道大黃對(duì)前列腺癌有較好的治療效果，有研究顯示，從大黃中提取的大黃素能誘導(dǎo)人前列腺癌細(xì)胞（LNCaP）凋亡，通過雄激素受體（AR）和P53-P21線粒體途徑抑制增殖，有效抑制癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移及再生，在癌細(xì)胞DNA損傷過程中起到良好的修復(fù)作用[4-5]。

盡管大黃治療前列腺癌具有確切療效，但作為常用的大宗藥材之一，由于產(chǎn)地不同，大黃種植質(zhì)量控制、田間管理技術(shù)及產(chǎn)品加工方法有差異，故市場(chǎng)來源不同大黃的有效成分差異較大[6]。藥材品質(zhì)資源混亂，其質(zhì)量難以得到保證，會(huì)直接或間接影響疾病的治療效果。為了有效整治這一現(xiàn)狀，近年來由劉昌孝院士提出了“中藥質(zhì)量標(biāo)志物”及其五原則概念，即通過藥材成分的有效性、特有性、傳遞與溯源、可測(cè)性、配伍環(huán)境5個(gè)方面評(píng)價(jià)和把控藥材的質(zhì)量標(biāo)志物[7]。目前，整合藥理學(xué)已被廣泛應(yīng)用到中藥與方劑及機(jī)體之間的藥效基礎(chǔ)、分子機(jī)制等方面，且能在一定程度上對(duì)中藥質(zhì)量標(biāo)志物進(jìn)行發(fā)掘和深入確證[8-9]。中醫(yī)藥整合藥理學(xué)研究平臺(tái)的構(gòu)建，更為整合藥理學(xué)“多靶點(diǎn)、多層次、多環(huán)節(jié)”策略提供強(qiáng)有力的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)與分析工具[10]。基于此，本研究依據(jù)中藥質(zhì)量標(biāo)志物（Q-marker）“五原則”方法，并借助中醫(yī)藥整合藥理學(xué)網(wǎng)絡(luò)計(jì)算研究平臺(tái)V2.0（TCMIP V2.0），結(jié)合現(xiàn)代藥理文獻(xiàn)對(duì)大黃防治前列腺癌的質(zhì)量標(biāo)志物和其活性成分與關(guān)鍵靶標(biāo)蛋白進(jìn)行模擬結(jié)合研究。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源 中醫(yī)百科全書數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.ehbio.com/ETCM/）是TCMIP V2.0的數(shù)據(jù)來源[11]。本研究基于TCMIP V2.0（http：//www.tcmip.cn/TCMIP/index.php/Home/）“中藥材數(shù)據(jù)庫(kù)”“中藥靶標(biāo)數(shù)據(jù)庫(kù)”“中藥成分?jǐn)?shù)據(jù)庫(kù)”及“疾病相關(guān)分子庫(kù)”等數(shù)據(jù)庫(kù)。其中，中藥靶標(biāo)預(yù)測(cè)及功能分析、疾病相關(guān)分子集及功能挖掘數(shù)據(jù)來源于“基因相關(guān)性數(shù)據(jù)庫(kù)”（DisGeNET）、基因本體（Gene Ontology）數(shù)據(jù)庫(kù)、“人類表型本體”（HPO）數(shù)據(jù)庫(kù)、“DrugBank數(shù)據(jù)庫(kù)”“治療靶標(biāo)數(shù)據(jù)庫(kù)”（TTD）、OMIM（Online Mendelian Inheritance In Man）等資源數(shù)據(jù)平臺(tái)。在蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)信息中，TCMIP V2.0容納了DIP、HAPPI、HPRD、In Act、MINT、OPHID、PDZ Base、Reactome等生物分子相互作用數(shù)據(jù)庫(kù)。通過計(jì)算網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)的3種拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)特征值，即連接度（Degree）、介度（Betweenness）和緊密度（Closeness），篩選網(wǎng)絡(luò)中的核心節(jié)點(diǎn)基因，并實(shí)現(xiàn)核心節(jié)點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的可視化。在獲得目標(biāo)中藥關(guān)鍵網(wǎng)絡(luò)靶標(biāo)基因集的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步開展生物學(xué)功能及通路的富集分析。

1.2 基于“成分-靶標(biāo)-通路-疾病”挖掘大黃防治前列腺癌有效成分 中藥質(zhì)量標(biāo)志物的核心因素是“有效性”。針對(duì)藥材中“成分-靶標(biāo)-通路-疾病”之間的關(guān)聯(lián)性，TCMIP V2.0可任意選定不同類別的節(jié)點(diǎn)，建立中藥多維關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)，實(shí)現(xiàn)對(duì)作用于核心靶標(biāo)的大黃化學(xué)成分的可視化操作，進(jìn)而獲得與有效性相關(guān)的成分。

在TCMIP V2.0的中藥材數(shù)據(jù)庫(kù)中，以“大黃”為關(guān)鍵詞進(jìn)行搜索，得到關(guān)于大黃的化學(xué)成分及其相關(guān)對(duì)應(yīng)的所有靶標(biāo)。然后在中藥靶標(biāo)預(yù)測(cè)功能模塊中，根據(jù)二維結(jié)構(gòu)相似性（MACCS分子指紋）進(jìn)行檢索，對(duì)Tanimoto系數(shù)定義進(jìn)行相似度打分，并與美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）上市藥物的相似度進(jìn)行比對(duì)，從而獲取高可信度（Similar Score≥0.8）的大黃候選靶標(biāo)譜。

在TCMIP V2.0的疾病數(shù)據(jù)庫(kù)中，以“Prostate Cancer”為關(guān)鍵詞進(jìn)行搜索，可得到與前列腺癌相關(guān)的靶點(diǎn)。

根據(jù)中藥（大黃）候選靶標(biāo)和目標(biāo)疾?。ㄇ傲邢侔┗蛑g的互作信息，可建立“中藥-疾病”關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)。基于藥材中“成分-靶標(biāo)-通路-疾病”之間的關(guān)聯(lián)性，任意選定不同類別的節(jié)點(diǎn)，建立有關(guān)中藥的多維網(wǎng)絡(luò)圖，并進(jìn)一步挖掘獲得大黃防治前列腺癌的可能有效成分，初步完成大黃防治前列腺癌關(guān)鍵靶標(biāo)及質(zhì)量標(biāo)志物的篩選。

1.3 基于大黃成分分析質(zhì)量標(biāo)志物 中藥質(zhì)量標(biāo)志物的必備條件是“可測(cè)性”。結(jié)合已知相關(guān)文獻(xiàn)對(duì)大黃的含量檢測(cè)情況，并按照TCMIP V2.0對(duì)初步篩選出的大黃有效成分進(jìn)行整理。

中藥質(zhì)量標(biāo)志物原則之一的“特有性”主要表現(xiàn)為2個(gè)層次：一方面是發(fā)掘能代表與反映同種藥材的共有性并有別于其他藥材的特有性成分，另一方面是能深入反映同一類藥材中所含成分的差異性，包括定性和定量2個(gè)層次[12]。本研究首先從大黃有別于其他藥材的特征性成分即大黃蒽醌類化合物開展研究，其次從不同品種、產(chǎn)地、年限及部位的主要活性化合物大黃蒽醌類含量差異進(jìn)行比較確定大黃的質(zhì)量標(biāo)志物。

1.4 基于大黃成分傳遞與溯源確定質(zhì)量標(biāo)志物 ? 通過TCMIP V2.0中的中藥成分?jǐn)?shù)據(jù)庫(kù)，本研究初步篩選可能作為大黃質(zhì)量標(biāo)志物的有效成分，整理其相關(guān)理化性質(zhì)，包含平衡溶解度和油水分配系數(shù)[13]，并在臨床復(fù)方用藥配伍及工藝研究等方面進(jìn)一步證實(shí)大黃防治前列腺癌的質(zhì)量標(biāo)志物。

1.5 基于分子對(duì)接模擬結(jié)合關(guān)鍵靶標(biāo)蛋白與候選質(zhì)量標(biāo)志物 通過PubChem網(wǎng)站（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）檢索獲取候選質(zhì)量標(biāo)志物的SDF結(jié)構(gòu)文件，并利用Open Babel 2.3.2軟件將SDF文件轉(zhuǎn)化為PDB文件，從Protein Data Bank（http：//www.rcsb.org/pdb）數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索獲得關(guān)鍵靶標(biāo)蛋白PD BID，利用PYMOL 2.3.4軟件對(duì)關(guān)鍵靶標(biāo)蛋白進(jìn)行去水、去配體等操作。采用AutoDockTools軟件對(duì)關(guān)鍵靶標(biāo)蛋白進(jìn)行加氫、平衡電荷等修飾，用Grid程序下的Grid Box命令打開Grid Option工具對(duì)關(guān)鍵靶標(biāo)蛋白進(jìn)行處理，配體結(jié)合口袋的大小由各個(gè)方向上格點(diǎn)的數(shù)目和格點(diǎn)間距共同決定，因此調(diào)整蛋白每個(gè)方向上格點(diǎn)的數(shù)目、結(jié)合口袋的中心以及格點(diǎn)的間距。首先將格點(diǎn)間距設(shè)為1，然后調(diào)整結(jié)合口袋體積使預(yù)對(duì)接的分子在其最伸展的狀態(tài)下也能在盒子內(nèi)轉(zhuǎn)動(dòng)，口袋中心即設(shè)定為結(jié)合位點(diǎn)中心，并將關(guān)鍵靶標(biāo)蛋白和配體小分子分別轉(zhuǎn)化為pdbqt格式。AutoDock Vina是由Scripps研究結(jié)構(gòu)開發(fā)的開源分子對(duì)接軟件，該軟件采用的是擬牛頓方法進(jìn)行局部?jī)?yōu)化，其打分函數(shù)結(jié)合了基于經(jīng)驗(yàn)打分和知識(shí)打分函數(shù)的優(yōu)點(diǎn)，將結(jié)果以一種親和能（Affinity）的形式輸出，通過計(jì)算受體-配體復(fù)合物的空間效果、排斥作用、氫鍵、疏水相互作用以及分子的靈活性等值綜合打分，評(píng)估其親和力，最終給出親和能打分。這種親和能是衡量配體是否能與受體分子有效結(jié)合的重要指標(biāo)，是AutoDock Vina軟件的核心參數(shù)，能值越低表示二者的結(jié)合效果越好。

2 結(jié)果

2.1 基于“成分-靶標(biāo)-通路-疾病”挖掘大黃防治前列腺癌有效成分分析結(jié)果

2.1.1 藥物靶標(biāo)預(yù)測(cè)分析 在TCMIP V2.0中藥（含方劑）靶標(biāo)預(yù)測(cè)及功能分析模塊中，獲取高可信度（Similar Score≥0.8）的大黃及其化學(xué)成分相關(guān)對(duì)應(yīng)的潛在靶標(biāo)，結(jié)果得到大黃化學(xué)成分88種，主要為大黃蒽醌類、蒽酮類等。有研究顯示，從大黃蒽醌類中提取的大黃素能通過下調(diào)趨化因子受體CXCR4的表達(dá)來抑制前列腺癌和肺癌細(xì)胞的侵襲和遷移[13]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，大黃素能夠直接作用于前列腺癌模型裸鼠雄激素受體（AR）并促進(jìn)其降解，從而對(duì)癌細(xì)胞的發(fā)生起到較好的預(yù)防作用[14]。大黃候選靶標(biāo)有actⅢ、AR、ALOX5、CSNK2A1、cyp158a2、CYP1A2、CYP2C9、CYP2D6、CYP2E1、CYP3A4、CYP3A43、CYP3A5、CYP3A7、fabZ、GSTA1、GSTP1、NR1H2、NR1H3、actVA_6、KRT12、KRT2、MAPK8IP1、PTGS1、PTGS2、SCO5081等。對(duì)大黃的預(yù)測(cè)靶標(biāo)進(jìn)行GO和Reactome pathway分析，候選靶標(biāo)基因功能分析的生物過程涉及異源代謝過程、長(zhǎng)鏈脂肪酸生物合成過程、單萜類代謝過程、藥物分解代謝過程等，分子功能涉及氧化還原酶活性、血紅素結(jié)合、鐵離子結(jié)合、單加氧酶活性、芳香化酶活性等，細(xì)胞組分主要集中在細(xì)胞器膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜、膜結(jié)合細(xì)胞器等方面。通路富集分析結(jié)果顯示，涉及通路有異生物素途徑、炎癥消退介質(zhì)反應(yīng)、細(xì)胞色素酶反應(yīng)、藥物代謝酶系統(tǒng)、核受體轉(zhuǎn)錄途徑等。

2.1.2 疾病靶點(diǎn)收集分析 在疾病相關(guān)分子集及其功能挖掘模塊中，獲得與前列腺癌相關(guān)疾病靶標(biāo)71個(gè)，包括HSP90AA1、PTGS2、MMP14、NFKB2、MCL1、SPHK2、HPSE、MMP9、MMP2、MMP3、TP53、NTSR1、MAP3K4、MAP2K7、MAP2K1、MMP13、MMP12、HDAC4、PRKCA、ALOX15、CYP1B1、VDR、GNRH1、LHCGR、FGFBP1、NTRK1、AR、EGFR、TRPV6、NCOA4、NSD1、PSCA、SLC7A1、BDKRB1、FOLH1、STEAP2、KLK3、HPN、TGFβ1、LOX、IL13RA1、IL13RA2、TMPRSS2、OR51E2、TMBIM6、RXRA、USP2、GRN、SRD5A1、SRD5A2、TNFSF4、STEAP1、ENG、CLU、BARD1、BRCA1、BRCA2、BRIP1、CHEK2、KLF6、MAD1L1、MRE11、MSR1、NBN、PALB2、PTEN、RAD50、RAD51、RAD51C、RAD51D、RNASEL。

2.1.3 “藥物-疾病”靶標(biāo)核心網(wǎng)絡(luò)分析 共獲得44個(gè)與前列腺癌以及藥材關(guān)聯(lián)的核心網(wǎng)絡(luò)靶標(biāo)，并通過PPI功能模塊構(gòu)建“藥物-疾病”核心網(wǎng)絡(luò)靶標(biāo)分析圖（圖1），設(shè)置卡值并同時(shí)滿足大于其節(jié)點(diǎn)“連接度”“介度”“緊密度”的中位數(shù)，所得關(guān)鍵核心靶標(biāo)21個(gè)，且大部分為藥物潛在靶標(biāo)（Putative drug Targets），如MMP2、TGFβ1、EGFR、MAP3K4等，已知疾病靶標(biāo)2條，即AR、HSP90AA1，藥物與疾病共有靶標(biāo)2條，即AR、HSP90AA1。

2.1.4 “藥物-靶標(biāo)-通路-疾病”網(wǎng)絡(luò)可視化分析及大黃防治前列腺癌可能的質(zhì)量標(biāo)志物探討 前期通過TCMIP V2.0獲得大黃防治前列腺癌的關(guān)鍵核心靶標(biāo)，可以推測(cè)大黃發(fā)揮藥效的藥理作用與其干預(yù)疾病的共同靶標(biāo)有關(guān)，并在藥物成分、藥物靶標(biāo)和疾病之間的關(guān)系中構(gòu)建大黃防治前列腺癌“藥物-成分-關(guān)鍵靶標(biāo)-通路”多維關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)圖。由圖2可知，大黃中含有多種有效成分，主要包括大黃蒽醌類，對(duì)藥物和疾病的共同靶標(biāo)AR產(chǎn)生藥理作用，具體成分為RheinosideA、RheinosideB、RheinosideC、RheinosideD、Rhein-8-O-β-D-Glucopyranoside、Rhein-8-O-β-D-（6′-Oxalyl）-Glucopyra-Noside、Aloeemodin-8-O-β-D-Glucopyranoside、AnthraglycosideB、Emodin-1-O-β-D-Glucopyranoside、Chrysophanol-8-O-β-D-Glucopyranoside、Chrysophanol-1-O-β-D-Glucoside、Physcion-8-β-D-Glucopyranoside、Physcion-8-O-β-D-Gentiobioside、Physcion-8-O-β-D-Glucopyranoside，可基本歸為大黃素、大黃酸、大黃酚、蘆薈大黃素、大黃素甲醚5大類（以下亦如此統(tǒng)稱）。體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，大黃素通過上調(diào)LRP1基因?qū)R陽(yáng)性表達(dá)下LNCaP細(xì)胞的生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制作用[15]。而大黃酸也可在AR陽(yáng)性表達(dá)下激發(fā)LNCaP細(xì)胞產(chǎn)生S期阻滯，并顯著降低cyclin A和CDK2的表達(dá)含量[16]。Lu等[17]采用大黃酚納米囊調(diào)控細(xì)胞周期相關(guān)蛋白，包括P27、CHK1、cyclin D1、CDK1、P-AMP等活化蛋白激酶（AMPK）和P-蛋白激酶B（AKT），以防止LNCaP細(xì)胞在AR陽(yáng)性表達(dá)下增殖并誘導(dǎo)其凋亡。蘆薈大黃素通過AR陽(yáng)性表達(dá)下抑制PKCα-AKT-mTORC2及其下游底物的活化，從而有效控制前列腺癌模型裸鼠體內(nèi)腫瘤細(xì)胞PC3的增長(zhǎng)趨勢(shì)[18]。白鳳等[19]、李斌鑫等[20]利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法篩選出蒙藥復(fù)方協(xié)日嘎-4的有效成分大黃素和大黃素甲醚，然后對(duì)蒙藥靶向調(diào)控前列腺癌AR等多個(gè)受體進(jìn)行分子對(duì)接且發(fā)現(xiàn)結(jié)合能較低，從而有力闡明該藥治療前列腺癌的效應(yīng)物質(zhì)基礎(chǔ)。

2.2 基于大黃成分探討質(zhì)量標(biāo)志物的分析結(jié)果 ? 2015年版《中華人民共和國(guó)藥典》規(guī)定的大黃含量測(cè)定的成分以游離蒽醌類為主，其中有蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚[1]。劉月紅等[21]運(yùn)用高效液相色譜法（HPLC）同時(shí)測(cè)定了大黃中14個(gè)成分含量，主要包括大黃素、大黃酸、大黃酚、蘆薈大黃素、大黃素甲醚、番瀉苷A、番瀉苷B、沒食子酸、兒茶素、（-）-表兒茶素-3-沒食子酸酯、異蓮花掌苷、4-4′-羥基苯基-2-丁酮、蓮花掌苷、4′-羥基苯基-2-丁酮-4′-O-β-D-（2″-O-桂皮酰基-6″-O-沒食子?；?葡萄糖苷，為大黃藥材多成分含量的測(cè)定及質(zhì)量控制提供便利。屈義虎[22]經(jīng)制備型高效液相色譜純化測(cè)定得到藥用大黃主要5個(gè)游離型蒽醌單體，分別為蘆薈大黃素（99.26%）、大黃酸（98.47%）、大黃素（98.65%）、大黃酚（99.75%）、大黃素甲醚（92.31%），并經(jīng)與標(biāo)準(zhǔn)品比對(duì)得到藥用大黃主要2個(gè)結(jié)合型蒽醌單體，分別為大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷（97.65%）和大黃酸-8-O-β-D-葡萄糖苷（98.32%）。說明大黃中主要活性成分大黃蒽醌類化合物具有高強(qiáng)度的專屬性和藥理活性，并易通過HPLC法測(cè)定，可將其視作大黃質(zhì)量標(biāo)志物。

其一，大黃含有多種有效活性成分，如游離蒽醌類、鞣質(zhì)類、蒽醌苷類等[23]。大黃的主要活性成分大黃蒽醌類化合物在抗炎、抗腫瘤、抗纖維化、保護(hù)心腦血管以及多個(gè)器官組織等方面效果顯著，是大黃發(fā)揮藥理作用的特征性成分[24]。其二，由于大黃來源存在差別，而不同來源的大黃質(zhì)量差異較大。有學(xué)者采用超高效液相色譜法（UPLC）對(duì)3個(gè)不同品種的大黃對(duì)照藥材及不同產(chǎn)地的21批市售大黃飲片建立指紋圖譜，結(jié)果發(fā)現(xiàn)掌葉大黃和唐古特大黃整體色譜峰具有數(shù)量多、面積大的特點(diǎn)，而藥用大黃色譜峰較少且面積小，且其飲片成分含量也隨著產(chǎn)地來源、采收及加工等影響而有一定差異[25]。又有學(xué)者以2015年版《中華人民共和國(guó)藥典》規(guī)定的5種游離蒽醌化合物為基礎(chǔ)，結(jié)合現(xiàn)有文獻(xiàn)分析研究1、2、3年生藥用大黃根、根莖、葉片中10種有效活性成分的含量和變化規(guī)律并建立HPLC圖譜，結(jié)果顯示同一部位大黃的多數(shù)成分含量越高，生長(zhǎng)年限越長(zhǎng)，且同一年份大黃葉片多數(shù)成分含量低于根或根莖，而3年生大黃根及根莖的總蒽醌含量最高（0.32%），說明大黃蒽醌類能較好適應(yīng)該基地的生態(tài)環(huán)境[26]。另有研究表明，同一產(chǎn)地相同年限的掌葉大黃與唐古特大黃游離蒽醌含量差異較大，5年栽培大黃與野生大黃的游離蒽醌總量相近（均高于2.0%），且蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚含量之間均有一定差異，而3年栽培大黃的游離蒽醌總量為0.64%～1.40%，離藥典標(biāo)準(zhǔn)仍有不小差距[27]。

綜上所述，大黃蒽醌類中大黃素、大黃酸、大黃酚、蘆薈大黃素、大黃素甲醚可能是大黃治療前列腺癌的質(zhì)量標(biāo)志物。

2.3 基于大黃防治前列腺癌質(zhì)量傳遞與溯源的質(zhì)量標(biāo)志物分析結(jié)果 研究在前期TCMIP V2.0網(wǎng)絡(luò)可視化分析中獲得了大黃和前列腺癌的共同靶標(biāo)AR產(chǎn)生藥理作用的14個(gè)有效活性成分，并結(jié)合中藥成分?jǐn)?shù)據(jù)庫(kù)，查詢得到上述有關(guān)大黃蒽醌類中5個(gè)有效活性成分的常見理化性質(zhì)如藥物油水分配系數(shù)，具體參考數(shù)據(jù)見表1。通過該平臺(tái)運(yùn)用Pipeline Pilot software（version 7.5）計(jì)算獲得分子溶解度（Molecular Solubility）和藥物在體內(nèi)的吸收水平（ADMET Absorption Level），藥物油水分配系數(shù)由AlogP和logD值表示，在藥物沒有進(jìn)行電離下，AlogP≈logD。目前公認(rèn)的藥物油水分配系數(shù)logP值最佳范圍為-1

2.4 基于分子對(duì)接針對(duì)關(guān)鍵靶標(biāo)與候選質(zhì)量標(biāo)志物分析結(jié)果 為了進(jìn)一步驗(yàn)證前列腺癌中大黃靶點(diǎn)的候選質(zhì)量標(biāo)志物，利用AutoDock Vina 1.1.2軟件對(duì)關(guān)鍵靶標(biāo)蛋白AR（PDBID：5V8Q）與以上8個(gè)配體小分子（AnthraglycosideB、Emodin-1-O-β-D-Glucopyranoside、Chrysophanol-1-O-β-D-Glucoside、Chrysophanol-8-O-β-D-Glucopyranoside、RheinosideB、Aloeemodin-8-O-β-D-Glucopyranoside、Physcion-8-O-β-D-Glucopyranoside、Physcion-8-β-D-Glucopyranoside，以下分別對(duì)應(yīng)簡(jiǎn)稱01～08配體小分子）分別進(jìn)行分子對(duì)接驗(yàn)證。圖3A.AR與01配體小分子之間的結(jié)合模式，氨基酸殘基Thr755、Trp751、Glu681與01配體小分子形成氫鍵相互作用，氨基酸殘基Pro801、Phe804、Pro682、Gly683、Gln711、Val684、Arg752與01配體小分子形成疏水相互作用。圖3B.AR與02配體小分子之間的結(jié)合模式，氨基酸殘基Glu678、Glu681、Trp751、Gly683、Gln711與02配體小分子形成氫鍵相互作用，氨基酸殘基Val684、Pro682、Pro801、Lys808、Arg752、Ala748與02配體小分子形成疏水相互作用。圖3C.AR與03配體小分子之間的結(jié)合模式，氨基酸殘基Val685、Gly683、Glu678、Trp751與03配體小分子形成氫鍵相互作用，氨基酸殘基Pro682、Glu681、Leu805、Pro801、Phe804、Arg752、Tyr763、Pro766、Val684與03配體小分子形成疏水相互作用。圖3D.AR與04配體小分子之間的結(jié)合模式，氨基酸殘基Gly683、Glu681、Trp751、Thr755與04配體小分子形成氫鍵相互作用，氨基酸殘基Val684、Gln711、Pro682、Phe804、Pro801、Ala748、Arg752與04配體小分子形成疏水相互作用。圖3E.AR與05配體小分子之間的結(jié)合模式，氨基酸殘基Thr755、Trp751、Glu681、Gln711與05配體小分子形成氫鍵相互作用，氨基酸殘基His714、Val715、Pro682、Gly683、Lys808、Phe804、Arg752、Val684與05配體小分子形成疏水相互作用。圖3F.AR與06配體小分子之間的結(jié)合模式，氨基酸殘基Trp751、Thr755、Glu681、Gln711、Gly683與06配體小分子形成氫鍵相互作用，氨基酸殘基Val685、Val684、Pro682、Ala748、Arg752、Phe804、Pro801與06配體小分子形成疏水相互作用。圖3G.AR與07配體小分子之間的結(jié)合模式，氨基酸殘基Glu678、Trp751與07配體小分子形成氫鍵相互作用，氨基酸殘基Glu681、Pro682、Gly683、Val684、Pro766、Tyr763、Arg752與07配體小分子形成疏水相互作用。圖3H. AR與08配體小分子之間的結(jié)合模式，氨基酸殘基Tyr763、Gly683、Glu678、Trp751與08配體小分子形成氫鍵相互作用，氨基酸殘基Val684、Pro682、Glu681、Leu805、Pro801、Phe804、Thr755、Arg752、Pro766與08配體小分子形成疏水相互作用。本研究選擇關(guān)鍵靶標(biāo)蛋白AR是因?yàn)樵凇八幬?成分-關(guān)鍵靶標(biāo)-通路”多維關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)中處于關(guān)鍵位置，同時(shí)它參與了多條重要通路，提示其在前列腺癌對(duì)大黃化合物的反應(yīng)中可能起關(guān)鍵作用。分子對(duì)接結(jié)果分析見表2，靶蛋白和對(duì)應(yīng)的化合物分子的得分小于-7，表明靶蛋白和化合物分子之間結(jié)合點(diǎn)位較好，同時(shí)根據(jù)分子對(duì)接分析成功地預(yù)測(cè)了大黃蒽醌類中8個(gè)均入最佳藥物油水分配系數(shù)范圍的化合物與該被測(cè)靶蛋白AR亦具有較好的結(jié)合性?？傮w表明，這些結(jié)果進(jìn)一步證明AR在前列腺癌中作為大黃蒽醌類化合物的治療靶點(diǎn)。

3 討論

前列腺癌是指前列腺發(fā)生的上皮惡性腫瘤，常見于60歲以上老年男性。盡管我國(guó)前列腺癌的發(fā)病率與西方國(guó)家相比較低，但隨著生活水平的提高和生存環(huán)境的改善，最新流行病學(xué)統(tǒng)計(jì)顯示近年來呈增長(zhǎng)趨勢(shì)[30]。前列腺癌的發(fā)病機(jī)制尚不明確，轉(zhuǎn)移途徑可經(jīng)局部、淋巴和血行，目前臨床治療方法主要包括藥物治療、手術(shù)治療、化學(xué)治療、放射治療、冷凍治療等，但每種治療方法都存在其局限性，因此尋找新的治療藥物和手段具有積極意義[31]。中醫(yī)藥在前列腺癌的診治方面頗具特色，不良反應(yīng)率低，具有一定的臨床安全性，如健脾利濕化瘀方對(duì)人前列腺癌C4-2細(xì)胞抑制增殖作用顯著，且大黃在復(fù)方中起著化瘀消癥的功效[32]。然而中醫(yī)藥具有“多靶點(diǎn)、多層次、多環(huán)節(jié)”的作用，即各種化學(xué)成分聯(lián)合起效的特點(diǎn)，故其治療疾病的具體分子機(jī)制和質(zhì)量標(biāo)志物難以被分析挖掘。本研究通過TCMIP V2.0平臺(tái)預(yù)測(cè)大黃防治前列腺癌的有效成分及其潛在作用靶標(biāo)，并依據(jù)中藥質(zhì)量標(biāo)志物“五原則”結(jié)合文獻(xiàn)對(duì)大黃防治前列腺癌的質(zhì)量標(biāo)志物進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，以求進(jìn)一步探索前列腺癌與宿主的關(guān)系。

研究發(fā)現(xiàn)，大黃防治前列腺癌的質(zhì)量標(biāo)志物可能以大黃蒽醌類化合物為主。根據(jù)中藥多維關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)圖分析，關(guān)于藥物與疾病的共有靶標(biāo)為AR和HSP90AA1，發(fā)現(xiàn)多數(shù)化學(xué)成分作用于前者，且前列腺癌與雄激素受體聯(lián)系密切[33]。因此，作用于核心靶標(biāo)AR的大黃化學(xué)成分可能是大黃發(fā)揮藥理作用的有效活性成分，并且大部分為大黃蒽醌類化合物，具體可歸為大黃素、大黃酸、大黃酚、蘆薈大黃素、大黃素甲醚5大類。本研究又根據(jù)確定質(zhì)量標(biāo)志物的其他原則，深入挖掘并確認(rèn)大黃防治前列腺癌的質(zhì)量標(biāo)志物可能為大黃蒽醌類化合物AnthraglycosideB、Emodin-1-O-β-D-Glucopyranoside、Chrysophanol-8-O-β-D-Glucopyranoside、Chrysophanol-1-O-β-D-Glucoside、RheinosideB、Aloeemodin-8-O-β-D-Glucopyranoside、Physcion-8-β-D-Glucopyranoside、Physcion-8-O-β-D-Glucopyranoside，這些化合物均涉及以上5大類。這與現(xiàn)有的有關(guān)大黃的文獻(xiàn)報(bào)道一致，或許是大黃防治前列腺癌質(zhì)量標(biāo)志物篩選的重要依據(jù)[34-35]。與此同時(shí)，本研究通過分子對(duì)接技術(shù)來探討大黃關(guān)鍵靶標(biāo)AR和成分治療前列腺癌的物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制，為進(jìn)一步開展的實(shí)驗(yàn)研究提供了參考和線索。但是，鑒于中藥化學(xué)成分并不是簡(jiǎn)單相加、中藥成分含量及濃度會(huì)影響藥效、中藥成分與靶點(diǎn)的作用類型多樣化等復(fù)雜特點(diǎn)，后續(xù)仍需要對(duì)大黃的具體藥效成分群和候選靶標(biāo)開展進(jìn)一步的體內(nèi)外驗(yàn)證與臨床轉(zhuǎn)化研究，以期開發(fā)出更適用于臨床治療前列腺癌的有效天然化學(xué)成分。

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（2020-12-01收稿 責(zé)任編輯：魏慶雙，徐穎）