孔祥瑞，楊 軍，林梓溪，馬定國，王讓劍*，陳常頌*

(1.福建省農(nóng)業(yè)科學院茶葉研究所，福建 福州 350013；2.國家茶葉質(zhì)量安全工程技術研究中心，福建 安溪 362441；3.福安市碧海藍天農(nóng)業(yè)科技發(fā)展有限公司，福建 福安 355000)

核心種質(zhì)作為種質(zhì)資源少而精的縮影性群體，是遺傳理論研究和育種親本選配的重要基礎[1]。因此，核心種質(zhì)構(gòu)建長期以來始終是植物育種研究的熱點和焦點[2-3]。以水稻、小麥、玉米、大豆、棉花、油菜等為代表的大宗作物[4-8]和以樟木、木荷等為代表的木本經(jīng)濟作物[9-11]，都取得了一系列突破性進展。同時，在取樣策略、評價指數(shù)、分析流程等方面積累了很多值得借鑒的技術[12-18]。

茶樹作為南方山區(qū)的重要經(jīng)濟作物，核心種質(zhì)構(gòu)建也有相關文獻可供查閱[19-25]，但專門針對烏龍茶的核心種質(zhì)構(gòu)建的研究卻鮮有報道。從上個世紀五六十年代開始，烏龍茶育種研究方向正式確立[26,27]，經(jīng)過近70年的發(fā)展，在品種和資源數(shù)量上有了很大的積累。截至目前，我國被收集保存的烏龍茶品種和名貴單樅總數(shù)80余個，占我國茶樹品種總數(shù)20%以上[28]。Lin等[29]研究發(fā)現(xiàn)，烏龍茶品種群體內(nèi)具有較高的遺傳多樣性。不斷增長的資源(含品種)數(shù)量和豐富的遺傳多樣性，為開展烏龍茶核心種質(zhì)構(gòu)建提供了客觀條件。

烏龍茶有別于其他茶類最顯著的特征是具有自然優(yōu)雅的花果香，本研究選擇鐵觀音、黃棪、茗科1號(金觀音)等12個在生產(chǎn)應用上綜合性狀表現(xiàn)優(yōu)異，極具高香特征的烏龍茶品種，以揮發(fā)性香氣物質(zhì)為表型性狀，嘗試構(gòu)建烏龍茶核心種質(zhì)篩選技術流程，并結(jié)合SSR標記，對篩選前后2個種群的遺傳多樣性進行比較分析，從而全面評價整套分析流程的可行性。以期為烏龍茶核心種質(zhì)篩選評價和烏龍茶雜交育種親本選配提供理論與技術參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

選擇福建省福安市碧海藍天農(nóng)業(yè)科技發(fā)展有限公司福安基地的12個茶樹品種(種質(zhì))為試驗材料(表1)，均為3齡期無性系植株，田間管理屬同一立地條件隨機區(qū)組種植。2020年10月，以一芽三葉為標準，用液氮取樣，每個品種設3次實驗重復。

表1 12個供試品種(種質(zhì))基本情況

1.2 香氣組分測定

樣品預處理參照李麗霞等[30]的方法，取1.0 g冷凍干燥樣，加入3.2 g NaCl和5 mL 60℃超純水，加蓋密封后在60℃條件下水浴10 min，再經(jīng)固相微萃取50 min和進樣口230℃高溫解析共5 min，-20℃密封保存、待測。

色譜條件：美國Agilent公司DB-5(3 m×0.25 mm×0.25 μm)；柱箱：40℃；進樣口溫度：230℃；載氣：氦氣；采用不分流進樣；流速：1.0 mL·min-1。升溫程序：先40℃保持2 min，以5℃·min-1升溫至85℃保持2 min，再以2℃·min-1升溫至110℃保持2 min，最后以7℃·min-1升溫至220℃保持8 min，總分析時間為123.5 min。

質(zhì)譜條件：EI電離能量：70 eV；掃描范圍為質(zhì)荷比(m/z)35～400；離子源溫度：230℃。

香氣物質(zhì)的定性與定量：對獲得的揮發(fā)性成分總離子色譜圖，通過檢索mainlib、replib和nist_ri譜庫完成定性；依據(jù)峰面積歸一化進行定量。并與相關文獻研究結(jié)果比較[31-33]，完成最終確認。

1.3 核心種質(zhì)構(gòu)建

核心種質(zhì)構(gòu)建通過QGAStation實現(xiàn)[34]，抽樣比率設置為0.25，抽樣方法選多次聚類隨機取樣法，遺傳距離選馬氏距離。

1.4 遺傳多樣性分析

DNA提取和SSR分析參考王讓劍等[35]的方法。群體間遺傳距離及遺傳多樣性指數(shù)等通過軟件Powermarker計算[36]，其中基因型bp轉(zhuǎn)0、1數(shù)據(jù)通過軟件DataFormater完成[37]。個體遺傳結(jié)構(gòu)組成分析由R語言LEA軟件包實現(xiàn)[38]，其他相關數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析及圖表繪制也均由R語言的ggplot2、export等包完成[39]。

2 結(jié)果與分析

2.1 香氣組分的GC-MS分析

經(jīng)SPME-GC-MS獲得香氣組分之后，在控制同一香氣物質(zhì)在不同品種間的保留時間≤0.1 min的條件下，可分離鑒定出的香氣主要成分見表2。

表2 12個烏龍茶品種GC-MS分離主要香氣成分相對含量

2.2 核心香氣組分篩選

因為核心種質(zhì)的分析過程需要構(gòu)建非等長矩陣，即性狀值必須少于品種數(shù)，所以，對上述30個香氣物質(zhì)進行核心成分篩選分析，通過軟件QGAStation，將抽樣比率設置為0.25，在多次隨機抽樣之后，根據(jù)核心香氣成分與原總香氣成分2個種群之間的差異統(tǒng)計分析，在均值未達到差異顯著性水平和極差、變異系數(shù)變化趨勢一致的情況下，獲得橙花叔醇、芳樟醇、香葉醇等7個香氣成分，初步將其作為典型表型性狀供核心種質(zhì)篩選使用，差異統(tǒng)計分析結(jié)果見表3。

表3 核心香氣成分與原香氣成分之間差異分析結(jié)果

2.3 核心種質(zhì)構(gòu)建

在篩選獲得核心香氣組分的條件下，同樣使用軟件QGAStation，將抽樣比率設置為0.25，以多次聚類隨機取樣法進行烏龍茶核心種質(zhì)篩選，其中遺傳距離選用馬氏距離。結(jié)果表明，基于核心香氣組分，12個供試品種中可以篩選獲得3個核心種質(zhì)，分別是金牡丹、鐵觀音和悅茗香。這3個品種構(gòu)建的核心種質(zhì)與包括12個品種的原種質(zhì)種群相比，在各個核心香氣組分表型上的差異統(tǒng)計分析見表4。核心種質(zhì)與原始種質(zhì)之間，除芳樟醇氧化物I的方差呈現(xiàn)P<0.05顯著差異之外，其他所有性狀的均值、方差差異百分率都為0，即無顯著性差異。此外，核心種質(zhì)與原始種質(zhì)間在7個核心香氣表型上的極差和變異系數(shù)高度對應，極差符合率為67.97，變異系數(shù)變化率為105.27，綜合多個統(tǒng)計參數(shù)，證明篩選出的核心種質(zhì)對供試群體具有較好的表征力。

表4 核心種質(zhì)與原種質(zhì)間表型差異

2.4 核心種質(zhì)遺傳評估

2.4.1 遺傳多樣性分析 為了進一步考察整個核心種質(zhì)構(gòu)建流程的可靠性，本研究對所有參試品種進行了40對SSR引物的基因型分型分析，在12份供試材料上共檢測到161個多態(tài)性位點，涉及200個等位變異，平均等位變異數(shù)為4.03，多態(tài)性信息含量(PIC)均值為0.50，說明這40對引物適合揭示該群體的遺傳多樣性。通過計算遺傳多樣性指數(shù)，發(fā)現(xiàn)核心種質(zhì)種群的多樣性指數(shù)變幅為0.08～0.77，可以完全涵蓋原始群體的均值0.55水平，且2個種群間的遺傳距離為0.133，從而在遺傳水平上進一步證實了核心種質(zhì)具有很好的群體表征力。

2.4.2 遺傳背景分析 借鑒群體遺傳學中常用的群體結(jié)構(gòu)分析，采用LEA軟件包的Structure功能來深入考察核心種質(zhì)個體遺傳背景的代表性，參照Evanno等的方法[40]，在K值等于3時，ΔK出現(xiàn)最大值拐點，因此將該供試群體暫定分為3個亞群來繪制Structure圖。結(jié)果顯示(圖1)，金牡丹、鐵觀音和悅茗香在個體遺傳組成上具有高水平的亞群代表性，更進一步證實了這3份材料被篩選成為核心種質(zhì)的合理性。

圖1 12份烏龍茶品種的群體結(jié)構(gòu)圖

3 討論與結(jié)論

3.1 核心種質(zhì)構(gòu)建分析流程

核心種質(zhì)構(gòu)建作為動植物資源育種的核心研究內(nèi)容，從最初的單純依照表型篩選，到現(xiàn)在的多組學聯(lián)合分析，呈現(xiàn)出了解析力度大、精度高的發(fā)展趨勢，同時也對相應抽樣策略和評估算法提出了更高的要求。本研究采用的抽樣和評估方法均為當前的主流算法，根據(jù)分析結(jié)果來看，在以代謝物作為表型，應用多次聚類隨機取樣法可以滿足烏龍茶核心種質(zhì)篩選需求，并通過標記基因型解析方法輔以驗證，進一步保證了分析結(jié)果的正確率。理論上，該分析流程也應該能夠滿足以其他表型值為目標性狀的篩選需求。故此，穩(wěn)健的烏龍茶核心種質(zhì)構(gòu)建分析流程可由極具擴展度的表型值、取樣算法和遺傳評估組成(圖2)。

圖2 烏龍茶核心種質(zhì)篩選分析流程

3.2 小樣本抽樣表型值的取舍

在高通量測試技術不斷發(fā)展的前提下，試驗數(shù)據(jù)的性狀觀察值多于供試材料樣本數(shù)的情況十分常見，使得很多算法因無法構(gòu)建合理矩陣而限制其應用，通常的做法是應用主成分分析、均值聚類等各種算法進行數(shù)據(jù)降維，之后再用降維后的觀測值來做后續(xù)分析。這類處理方法需要耗費大量的計算資源，而且實驗效果也無從保證。本實驗嘗試應用原始數(shù)據(jù)倒置的處理方法，對性狀值進行降維處理，分析結(jié)果與預期是完全吻合的。當將這些篩選出的核心性狀在核心種質(zhì)與原生種質(zhì)2個種群進行小樣本非參數(shù)差異統(tǒng)計檢驗時，7個表型在2個種群間無顯著性差異，且P值0.39～1(圖3)，從而逆向證明了倒置處理針對小樣本進行表型值取舍的可行性。更肯定了該分析流程也可以應用于小樣本群體的核心種質(zhì)構(gòu)建。

圖3 非參數(shù)統(tǒng)計分析在2個種群間的差異檢驗結(jié)果

此外，通過該流程分析獲得的核心表型值與宛曉春等[41]提到的烏龍茶香氣物質(zhì)主要成分相一致，即橙花叔醇對應木香，芳樟醇及其氧化物對應鈴蘭的清爽性花香，香葉醇對應薔薇的溫暖性花香。所以，今后相關研究可以將這7個香氣成分作為烏龍茶呈香重要指標加以利用。理論上，選出的3個核心種質(zhì)可以作為烏龍茶品種香氣改良的優(yōu)選親本加以使用，但由于測試材料數(shù)量有限，3個核心種質(zhì)的實際育種價值還有待深入研究。

就試驗結(jié)果來看，這套技術流程完全可以滿足烏龍茶核心種質(zhì)構(gòu)建分析，而且對表型值有較為寬泛的涵蓋域。此外，對于小樣本高通量表型數(shù)據(jù)也有相應的解決策略，使其在實際應用中具有更大的靈活性。再加上高通量測序技術的不斷發(fā)展和大范圍普及，該流程的基于遺傳信息驗證功能也將使整個分析流程具有更高的穩(wěn)健性和糾錯率，能夠多層面確保篩選獲得的核心種質(zhì)具有較高的表征力。