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        豬傳染性胃腸炎病毒疫苗株S 基因的克隆及其與流行株的比對分析

        2021-11-29 08:43:56侯宏艷潘孝成張丹俊趙瑞宏胡曉苗周學(xué)利
        畜牧與飼料科學(xué) 2021年5期
        關(guān)鍵詞:檢測

        侯宏艷,潘孝成,尹 磊,張丹俊,趙瑞宏,胡曉苗,周學(xué)利

        (安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所 安徽省畜禽疫病研究中心 畜禽產(chǎn)品安全工程安徽省重點實驗室, 安徽 合肥230031)

        豬傳染性胃腸炎病毒(transmissible gastroenteritis virus,TGEV) 可引起各種年齡豬病毒性腸炎,感染后引起豬嘔吐、嚴重腹瀉和脫水,仔豬1~28 d 是該病最易感日齡,每年的1—2 月是該病高發(fā)期[1-4]。 TGEV 除了與引起豬腹瀉的豬輪狀病毒(porcine rotavirus,PoRV)、 豬 流 行 性 腹 瀉 病 毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV) 等混合感染,還能與豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRSV)、豬圓環(huán)病毒 (porcine circovirus,PCV)、 豬細小病毒(porcine parvovirus,PPV)等混合感染[5-8],給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大危害。

        近年來, 我國多個地區(qū)對TGEV 進行了流行病學(xué)調(diào)查,報道的TGEV 檢測率存在差異。孫秋艷等[6]對2014—2016 年山東省部分地區(qū)TGE 流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn),TGEV 檢測率為9.3%;徐麗華等[7]對2011—2017 年浙江省豬病毒性腹瀉的流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn),TGEV 的陽性率為3.05%; 杜雅楠等[8]對內(nèi)蒙古地區(qū)采集的病料進行了TGEV 檢測,顯示陽性率為11.76%,赤峰市TGEV 陽性率為20.83%;祖立闖等[9]在2007—2016 年的39 篇流行病學(xué)監(jiān)測文獻中發(fā)現(xiàn)TGEV 整體陽性感染率在0~31.86%, 還發(fā)現(xiàn)外觀健康豬群仍可檢測出TGEV 病原或抗體,健康豬群中普遍存在TGEV 隱性感染。 因此,對豬場進行TGEV 檢測很有必要。

        TGEV 為RNA 病毒, 存在遺傳變異的可能。在TGEV 基因組中,S 基因編碼的氨基酸是中和抗體的主要靶點[4-5,10]。因此,該研究選擇了國內(nèi)常用的3 個廠家的豬傳染性胃腸炎病毒疫苗進行TGEV RNA 提取和S 基因序列的擴增, 并與已公布流行毒株基因序列進行比對, 建立檢測豬傳染性胃腸炎病毒的RT-PCR 診斷方法, 初步判斷豬傳染性胃腸炎病毒疫苗與流行菌株S 基因的遺傳性,為臨床疫苗的應(yīng)用提供參考。

        1 材料和方法

        1.1 疫苗

        購買國內(nèi)目前廣泛使用的豬傳染性胃腸炎的3 個廠家的凍干疫苗,分別記作疫苗A、疫苗B 和疫苗C。

        1.2 主要試劑

        病毒檢測用RNA 提取試劑盒(離心柱型)和Fastking cDNA 第一鏈合成試劑盒購自TaKaRa 公司;2×Taq mix、DNA 凝膠回收試劑盒和DL 2 500 Marker 等均購自天根生化科技(北京)有限公司;瓊脂糖購自美國Sigma 公司。

        1.3 RNA 提取

        將疫苗A、疫苗B、疫苗C 按1 頭份加入1 mL DEPC 水進行溶解,-80 ℃反復(fù)凍融3 次后,取200 μL 按病毒檢測用RNA 提取試劑盒說明書提供的方法提取疫苗中的TGEV RNA,-80 ℃保存。

        1.4 cDNA 鏈合成

        將“1.3”項下保存的疫苗A、疫苗B、疫苗C 的RNA 取出溶解, 按FastKing cDNA 第一鏈合成試劑盒說明書的方法進行反轉(zhuǎn)錄,獲得cDNA。

        1.5 RT-PCR 檢測

        引物參照樊雅婷等[11]報道的,參照GenBank上TGEV 毒株的S 基因cDNA 序列設(shè)計1 對引物, 上游引物序列為5′-CCACTTCGTTAACACACC-3′;下游引物序列為5′-GATAGCCCCAACTATGGTA-3′。 該引物預(yù)期擴增片段大小為2 279 bp,為上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。對“1.4”項下提取的cDNA 進行PCR 擴增,反應(yīng)體系為:上、下游引物各1 μL(20 μmol/L)、cDNA 模板2 μL、2×Taq mix 12.5 μL、ddH2O 8.5 μL, 總體系25 μL。 反應(yīng)條件為:95 ℃預(yù)變性4 min;94 ℃變性30 s,55 ℃退火45 s,72 ℃延伸2 min,35 個循環(huán);72 ℃終延伸10 min,4 ℃結(jié)束反應(yīng)。 得到的RTPCR 產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳。

        1.6 目的基因克隆與測序

        參照DNA 凝膠回收試劑盒說明書進行目的基因凝膠回收與純化, 純化的目的基因片段送至通用生物(安徽)有限公司測序。

        1.7 序列分析

        將疫苗A、 疫苗B、 疫苗C 的S 基因序列在NCBI 網(wǎng)站的Blast 上與近年公開發(fā)表的來自不同地區(qū)的基因序列進行遺傳分析, 得到與已知序列的同源性。 再選取登錄號為AF104420.1-Britain、AY587882.1 -Nanjing、DQ811786.2 -America、EU074218.2 -Harbin、FJ755618.2 -Harbin、JQ700304 -fuzhou、KC609371.1 -Shanghai、KX900411.1 -United States、M94099.1 -Spain 和MK272773.1-Fushun 的S 基因序列,與疫苗A、疫苗B、疫苗C 的S 基因序列一起,用MegAlign 軟件進行比對分析。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 目的基因RT-PCR 檢測結(jié)果

        對疫苗A、疫苗B、疫苗C 的S 基因片段進行RT-PCR 擴增, 均得到預(yù)期大小約為2 279 bp 的DNA 片段(見圖1),并將純化后的產(chǎn)物送至通用生物(安徽)有限公司測序。

        圖1 TGEV 疫苗A、疫苗B、疫苗C的S 基因RT-PCR 擴增結(jié)果

        2.2 序列分析

        將疫苗A、 疫苗B、 疫苗C 的S 基因序列在NCBI 網(wǎng)站的Blast 上進行序列比對, 利用MegAlign 軟件進行核苷酸同源性比對分析(見圖2),并繪制S 基因克隆序列的系統(tǒng)發(fā)生樹 (見圖3)。結(jié)果表明,疫苗A、疫苗B、疫苗C 的S 基因序列兩兩間的同源性在96.7%以上;疫苗A 與NCBI 已知序列的同源性在94.43%~99.82%, 疫苗B 與NCBI 已知序列的同源性在95.30%~99.64%,疫苗C 與NCBI 已知序列的同源性在93.48%~98.38%。

        圖2 TGEV 疫苗A、疫苗B、疫苗C 的S 基因核苷酸同源性比對分析結(jié)果

        圖3 TGEV 疫苗A、疫苗B、疫苗C 的S 基因克隆序列的系統(tǒng)發(fā)生樹

        選取10 個來自國內(nèi)外的S 基因序列,與疫苗A、疫苗B、疫苗C 的S 基因序列一起,用MegAlign軟件進行比對分析。從系統(tǒng)發(fā)生樹可以看出,疫苗A 和疫苗C 在一個分支上, 且與國外M94099.1-Spain 株在同一分支上, 而疫苗B 在另一個分支上,與國內(nèi)JQ700304-fuzhou 株在同一分支上。

        3 討論與結(jié)論

        豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)是一種包膜病毒,屬于冠狀病毒科(coronaviridae,CoV),該病毒有一個28.5 kbp 的單鏈陽性RNA 基因組,S 蛋白位于病毒表面, 主要形成病毒纖突。 在功能上,TGEV 的S 糖蛋白是中和抗體的主要靶點,還與宿主細胞的嗜性有關(guān), 能夠與宿主細胞受體相互作用, 讓病毒侵入細胞;S 蛋白還決定TGEV 的血凝活性。 有學(xué)者認為TGEV 的S 基因為易變基因,對TGEV 的S 基因進行克隆和分析值得深入研究[4]。

        該研究購買了市場上常用的TGEV 疫苗A、疫苗B 和疫苗C,提取疫苗中TGEV 的RNA,對S基因片段進行RT-PCR 擴增, 均得到了預(yù)期大小的基因片段。 將獲得的S 基因序列在Blast 上進行比對后發(fā)現(xiàn),疫苗A、疫苗B、疫苗C 的S 基因序列兩兩間的同源性在96.7%以上,且3 種疫苗的S 基因與NCBI 已知序列的同源性超過96%的占比在80%以上,說明目前TGEV 流行株的S 基因變異較低,市場上所用疫苗能有效防控TGEV,與孫秋艷等[6]對山東省部分地區(qū)的TGEV 檢測的檢出率為9.3%, 檢出率相對其他常發(fā)?。≒EDV、PRRS、PCV等)要低的結(jié)論相符,與樊雅婷等[11]研究分離的T04 株S 基因變異較低且相對穩(wěn)定一致。

        在對TGEV 的研究中, 朱蘊暖等[12]建立了TGEV 的間接免疫熒光(IFA)檢測方法,王賽[13]用抗TGEV 重組N 蛋白的單克隆抗體和多克隆抗體建立了一種雙抗體夾心ELISA 檢測方法。 在開發(fā)有效的抗TGEV 療法中,單玲玲等[14]認為IFN-y可作為一種有效的治療制劑。 但在實際生產(chǎn)中,TGEV 仍然以疫苗預(yù)防為主, 病原檢測多采用RT-PCR 方法,如李嘉琛等[15]對內(nèi)蒙古某豬場的糞便樣品進行RT-PCR 鑒定,郭容利等[16]設(shè)計32對PCR 引物分片段擴增TGEV 江蘇分離株JS2012 全基因組并進行分析。 在該研究中建立的TGEV 的S 基因RT-PCR 方法,成功獲得了TGEV疫苗中的S 基因, 所以該方法可以用來檢測腹瀉病豬是否感染了TGEV,對監(jiān)測TGEV 的S 基因變異情況和對TGEV 的防控都有生產(chǎn)意義。

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