莎 娜，康博洋，張欣昕，杜 琳，馮小慧，劉廣華，狄彩霞，高天云

（1.內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010031；2.呼和浩特市科學(xué)技術(shù)創(chuàng)新服務(wù)中心，內(nèi)蒙古 呼和浩特

010090）

多黏菌素是一種發(fā)現(xiàn)于多黏桿菌培養(yǎng)液中的具有抗菌活性的多肽， 主要包括A、B、C、D、E等類型［1］。 其通過與革蘭陰性菌細(xì)胞膜磷脂中帶負(fù)電荷的磷酸根結(jié)合， 破壞脂多糖的穩(wěn)定性，從而發(fā)揮抗菌作用［2-3］。細(xì)菌對該類抗菌藥物不易產(chǎn)生耐藥性，所以多黏菌素類抗菌藥物常在動物的飼養(yǎng)過程中使用，并在動物體內(nèi)殘留，通過動物源性食品傳遞給人類，對人的腎和神經(jīng)系統(tǒng)有一定的毒性［4-6］。 中國、美國、日本和歐盟等許多國家和地區(qū)批準(zhǔn)其作為飼料添加劑或獸藥使用， 但超量使用，不嚴(yán)格遵守休藥期，可以使動物性食品中多黏菌素超過殘留限量。 隨著其在養(yǎng)殖業(yè)中廣泛不合理應(yīng)用、 缺乏科學(xué)指導(dǎo)以及法律監(jiān)督等問題的出現(xiàn)， 動物性食品中多黏菌素的殘留問題逐步受到各國的重視［7-9］。 針對其致毒性，我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部發(fā)布第235 號公告《動物性食品中獸藥殘留限量》對多黏菌素殘留量做出了嚴(yán)格規(guī)定，要求其殘留量在動物肌肉、 脂肪和肝臟中為150 μg/kg，腎臟中為200 μg/kg，第278 號公告同時禁止其在產(chǎn)蛋期和產(chǎn)奶期應(yīng)用［10-12］。 羊肉作為人們的主要肉食品，其獸藥殘留必然是人們擔(dān)憂的問題，為了保障羊肉食用安全， 需要建立一種同時檢測羊肉中多黏菌素A 和多黏菌素B 殘留量的準(zhǔn)確、高效定量檢測方法， 對該類藥物在羊肉中的殘留進(jìn)行監(jiān)測。

目前， 國內(nèi)外對動物源性食品中多黏菌素類藥物的檢測方法有酶聯(lián)免疫分析法（ELISA）［13］、微生物法［14］、高效液相色譜法等［15］。酶聯(lián)免疫分析法抗體制備比較困難， 方法選擇性差， 易出現(xiàn)假陰性、假陽性，定性難以保證，在實(shí)際檢測中，一般采用進(jìn)口試劑盒居多，價格昂貴，大批量使用受限。高效液相色譜法因?yàn)樽贤馕蛰^弱且本身不具備產(chǎn)生熒光的基團(tuán)，需經(jīng)過衍生化再檢測，檢測過程繁瑣、用時較長，無法作為常規(guī)定量檢測方法。 微生物法靈敏度不高，選擇性差，且耗時長，費(fèi)時費(fèi)力。近年來液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）技術(shù)由于靈敏度高、 定量準(zhǔn)確和便于驗(yàn)證等優(yōu)點(diǎn)應(yīng)用于動物源性食品中β-內(nèi)酰胺類和多肽類抗生素的多殘留檢測［16-18］。 該研究建立了一種快速高效的液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜方法， 通過對儀器分析條件、凈化方式和提取溶劑進(jìn)行優(yōu)化，使所建方法能夠滿足現(xiàn)行檢測要求。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

LC-MS/MS 液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜儀（Waters-TQ-S Micro）； 色譜柱Acquity UPLC BECH-C18（1.7 μm，2.1 mm×100 mm）；高速冷凍離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；Milli-Q 超純水儀（Millipore公司）；NAI-DCY-12Z 氮吹儀 （上海那艾精密儀器有限公司）；固相萃取裝置（北京優(yōu)昇聯(lián)合科技有限公司）；微孔濾膜（0.22 μm）；VORTEX-GENIE 渦旋振蕩器 （上海蘭儀實(shí)業(yè)有限公司）；AE270 電 子 天 平 （Mettler Toledo 公 司）；pH 計（METTLER TOLEDO 公 司）；Oasis WCX 固 相 萃取凈化柱（60 mg/3 mL）；均質(zhì)器（IKA，德國）；MCX 固相萃取凈化柱 （60 mg/3 mL）；HLB 固相萃取凈化柱（60 mg/3 mL）；乙腈、甲醇（色譜級，DIKMA，德國）；甲酸（ACROS ORGANICS，賽默飛世爾科技公司）；三氯乙酸、氨水（分析純）；多黏菌素A 和多黏菌素B 標(biāo)準(zhǔn)樣品購于Dr 公司，純度為99.7%；實(shí)驗(yàn)用水為Milli-Q 超純水儀制造。

1.2 樣品制備

取有代表性樣品約0.5 kg，用組織搗碎機(jī)充分搗碎混勻分裝，裝入潔凈容器作為試樣，密封，標(biāo)明標(biāo)記，將試樣置于-18 ℃冷凍保存。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

分別稱取適量的多黏菌素A 和多黏菌素B標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇分別配制成濃度為10 mg/L 的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，于2 ℃保存。

1.4 提取液配制

1.4.1 10%三氯乙酸溶液稱取10.00 g 三氯乙酸，用水溶解，定容至100 mL。

1.4.2 10%三氯乙酸水溶液—乙腈溶液取30 mL 10%三氯乙酸溶液和70 mL 乙腈，混勻，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.5 試驗(yàn)方法

1.5.1 樣品前處理提?。悍Q取試樣2.00 g（精確到0.01 g），置于100 mL 聚丙烯離心管中，準(zhǔn)確加入10 mL“1.4.2”項下提取溶液，渦旋2 min后，5 000 r/min 離心5 min， 轉(zhuǎn)移上清液至另一潔凈離心管中， 樣品殘渣中加入10 mL 提取液重復(fù)以上提取操作，合并2 次提取液后，用氨水調(diào)pH值至9.0，5 000 r/min 離心5 min，上清液備用。

凈化：依次用甲醇3mL、水3mL 活化平衡WCX固相萃取柱，取全部備用液上樣，以小于2 mL/min的流速通過，備用液全部通過后，依次用5 mL 水、3 mL 甲醇洗滌固相萃取柱， 棄去全部流出液，在65 kpa 的負(fù)壓下，減壓抽至近干。 用5 mL 甲醇洗脫，收集洗脫液至10 mL 試管中，在45 ℃下氮?dú)獯抵良s1.0 mL，用水定容至2.0 mL，渦旋混勻，過0.22 μm 濾膜，供液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜儀測定。

1.5.2 儀器條件

1.5.2.1 色譜條件色譜柱BEH-C18（1.7 μm，2.1 mm×100 mm）；流動相如表1 所示；流速為0.3 mL/min；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：1.0 μL。

表1 梯度洗脫條件

1.5.2.2 質(zhì)譜條件離子源：電噴霧離子源，溫度為150 ℃。 掃描方式：正離子掃描（ESI＋）。 檢測方式：多反應(yīng)離子監(jiān)測模式（MRM）。 待測化合物定性離子、定量離子對及對應(yīng)的錐孔電壓、碰撞能量見表2。

表2 質(zhì)譜分析參數(shù)

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品前處理條件優(yōu)化

2.1.1 提取試劑的選擇多黏菌素A 和多黏菌素B 屬于多肽類抗生素，酸性條件下易溶解，且性質(zhì)穩(wěn)定。文獻(xiàn)報道均采用強(qiáng)酸性水溶液和酸性有機(jī)溶劑提取動物肌肉中的多黏菌素殘留［19］。 由于多肽類抗生素含有多個氨基，屬于極性化合物，宜采用極性有機(jī)溶劑提取，該研究采用乙腈、丙酮和甲醇3 種有機(jī)溶劑，通過添加回收實(shí)驗(yàn)，考查3 種有機(jī)溶劑對提取效率的影響，結(jié)果見圖1。

從圖1 看出，乙腈提取回收率較高，甲醇溶解度好，但在提取動物組織時雜質(zhì)較多，提取液較混濁，對多黏菌素B 的回收率有影響，丙酮提取回收率偏低，不予選擇。根據(jù)目標(biāo)化合物易溶于水的特性，選擇乙腈作為有機(jī)提取溶液，分別比較了不同體積比（3∶7、5∶5、7∶3）的10%三氯乙酸水溶液—乙腈提取液的效果。結(jié)果顯示，三氯乙酸水溶液占比多，提取樣品時較混濁，難以過柱，有機(jī)相比例高凈化時易過柱，提取效率高且基質(zhì)干擾少，實(shí)驗(yàn)最終選擇10%三氯乙酸水溶液—乙腈 （3∶7，V/V）作為測定目標(biāo)化合物的提取溶液。

圖1 不同提取有機(jī)溶劑的回收率

2.1.2 色譜條件的選擇由于多肽類抗生素含有多個氨基，化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定，極性強(qiáng)，試驗(yàn)選擇了不同類型的色譜柱、流動相比例和梯度洗脫程序，通過對目標(biāo)化合物標(biāo)準(zhǔn)品測試，最終選擇保留能力強(qiáng)、柱效佳的BEH-C18（1.7 μm，2.1 mm×100 mm）色譜柱， 確定了用0.1%甲酸水溶液做流動相，采用梯度洗脫程序，多黏菌素A 和多黏菌素B 均得到較好保留，峰型良好且無干擾峰存在。

2.1.3 質(zhì)譜條件的選擇由于多黏菌素是由氨基酸縮合而成的肽類物質(zhì)，分子量較大，在SCAN 模式下，易與1 個或多個H+結(jié)合產(chǎn)生帶正電的單電荷或多電荷離子， 對待測物多黏菌素A 和多黏菌素B 進(jìn)行一級質(zhì)譜掃描， 獲得母離子確定碎片離子，然后對碎片離子對應(yīng)的碰撞能量CE 值等參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化。 多黏菌素A，在SCAN 模式下掃描得到母離子為390，其碎片離子為123 和199，對碎片離子123 對應(yīng)的碰撞能量CE 值進(jìn)行優(yōu)化，通過比對發(fā)現(xiàn)， 碰撞能量CE 值為15、20、30、35 eV 時對應(yīng)的豐度分別為5 000、5 100、5 300、5 600，依據(jù)產(chǎn)生最高豐度值，選擇碎片離子199 對應(yīng)的CE值為35 eV。 多黏菌素B，在SCAN 模式下掃描得到母離子為337，其碎片離子為111 和119，對碎片離子111 對應(yīng)的碰撞能量CE 值進(jìn)行優(yōu)化，通過比對發(fā)現(xiàn)， 碰撞能量CE 值為15、25、35、40 eV 時對應(yīng)的豐度分別為5 000、5 300、5 100、5 600，故選擇碎片離子111 對應(yīng)的CE 值為40 eV，經(jīng)過優(yōu)化得到目標(biāo)物的離子圖（見圖2、圖3）。 根據(jù)目標(biāo)物出峰時間在1.5 min 附近， 運(yùn)用質(zhì)譜設(shè)置時間，在0～0.5 min 和3～10 min 切換至廢液， 只有0.5～3.0 min 進(jìn)樣檢測， 可以較好地維護(hù)儀器， 保護(hù)質(zhì)譜端，延長使用時間。

圖2 多黏菌素A 離子色譜圖

圖3 多黏菌素B 離子色譜圖

2.1.4 凈化條件的選擇實(shí)驗(yàn)考查了MCX、HLB、WCX、C18 4 種不同填料的固相萃取柱對樣品凈化效果的影響，并對凈化步驟進(jìn)行了優(yōu)化，提取液調(diào)至堿性后直接過柱，從圖4 可以看出，各固相萃取柱對待測物質(zhì)都有一定的選擇性，凈化時C18、MCX 柱回收率低于50%，HLB 柱對樣品的酸堿性要求較高，樣品弱酸條件下易混濁，易堵，難以過柱。 pH 值范圍更廣的WCX 固相萃取柱凈化回收率較高，實(shí)驗(yàn)最終選擇WCX 固相萃取柱凈化。

圖4 不同固相萃取柱凈化樣品的回收率

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線及相關(guān)系數(shù)

準(zhǔn)確吸取 “1.3” 項下標(biāo)準(zhǔn)儲備液0.10、0.20、0.30、0.40、0.50 mL 于6 份空白試樣中， 按上述實(shí)驗(yàn)操作步驟進(jìn)行提取，得到基質(zhì)加標(biāo)系列工作液，上機(jī)測試，用MRM 模式掃描，以基質(zhì)加標(biāo)系列工作液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)， 以目標(biāo)化合物峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，回歸方程及相關(guān)系數(shù)見表3。 結(jié)果發(fā)現(xiàn)， 多黏菌素A 和多黏菌素B 在5.0～110 μg/L 濃度范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。

表3 回歸方程及相關(guān)系數(shù) 單位：μg/L

2.3 回收率及精密度實(shí)驗(yàn)

取空白羊肉樣品，分別添加高、中、低3 個濃度水平的標(biāo)準(zhǔn)溶液，獲得5、10、15 μg/kg 添加水平樣品，每個加標(biāo)水平進(jìn)行3 次平行實(shí)驗(yàn)，按照上述實(shí)驗(yàn)過程提取、凈化樣品，上機(jī)測試，計算各添加水平下的回收率及精密度。結(jié)果表明，測試樣品的平均回收率為70%～120%，RSD 小于10%，加標(biāo)回收率、相對標(biāo)準(zhǔn)偏差見表4，以3 倍信噪比（S/N）計算檢出限，以10 倍檢出限計算定量限，最終確定方法的檢出限為0.05 μg/kg，定量限為0.50 μg/kg。

表4 回收率及精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n=6）

2.4 羊肉樣品基質(zhì)效應(yīng)影響

由于實(shí)際樣品中存在較多待測物之外的干擾物，在測定時會對待測物產(chǎn)生增強(qiáng)或者抑制作用。實(shí)驗(yàn)采用蘇萌等［20］建立的基質(zhì)效應(yīng)確認(rèn)方法，即對比樣品提取凈化后的基質(zhì)添加溶液和標(biāo)準(zhǔn)品溶液的響應(yīng)值考查方法的基質(zhì)效應(yīng)。 當(dāng)比值等于或者接近1 時，表明不存在基質(zhì)效應(yīng)影響，比值大于1 時，說明被測化合物有離子增強(qiáng)作用，比值小于1 時，表明被測化合物有離子抑制作用。 由表5 可知， 兩種多黏菌素類藥物在羊肉基質(zhì)中均存在強(qiáng)基質(zhì)抑制效應(yīng)，在實(shí)際檢測過程中，為校正基質(zhì)效應(yīng)對結(jié)果的影響， 在定量分析中使用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線。

表5 兩種待測物的基質(zhì)效應(yīng)

2.5 實(shí)際樣品的測定

應(yīng)用該研究建立的方法， 對內(nèi)蒙古巴彥淖爾地區(qū)的羊肉樣品進(jìn)行檢測， 采用基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量分析，結(jié)果良好，樣品均未檢出多黏菌素A和多黏菌素B，檢測結(jié)果見表6。

表6 實(shí)際樣品中多黏菌素A 和多黏菌素B 的檢測結(jié)果 單位：份

3 討論

該研究建立的羊肉中多黏菌素A 和多黏菌素B 的液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法， 考查多個提取液的提取效率， 樣品最終采用三氯乙酸水溶液—乙腈直接提??；通過添加回收實(shí)驗(yàn)，考查不同固相萃取柱的凈化效果，采用WCX 固相萃取柱直接凈化， 凈化液離心氮吹后經(jīng)0.22 μm 有機(jī)濾膜過濾，上HPLC-MS/MS 分析測試，通過優(yōu)化色譜、質(zhì)譜條件使目標(biāo)物均得到較好的分離； 經(jīng)過基質(zhì)效應(yīng)研究， 選用羊肉基質(zhì)添加標(biāo)準(zhǔn)溶液外標(biāo)法定量，多黏菌素A 和多黏菌素B 檢出限（LOD）和定量下限（LOQ）分別為0.05 μg/kg 和0.50 μg/kg，選擇低、中、高3 個水平在羊肉中加標(biāo)回收，計算多黏菌素A 和多黏菌素B 的平均回收率為70%～120%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于10%。 結(jié)果表明，兩種待測組分在5.0～110.0 μg/L 濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，R 大于0.996。

4 結(jié)論

該方法快速準(zhǔn)確，前處理簡單，重現(xiàn)性良好，可以為日常分析檢測羊肉中多黏菌素A 和多黏菌素B 提供技術(shù)支撐。