賈瑞康 劉會(huì)云 睢建亮 王夢蕾 王珍

(1.河北省(邯鄲)中藥產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院，河北 邯鄲 056000；2.河北工程大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，河北 邯鄲 056000；3.復(fù)旦大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究院，上海 200030；4.邯鄲制藥股份有限公司，河北 邯鄲 056000)

新型冠狀病毒(COVID-19)傳染性強(qiáng)，感染早期會(huì)出現(xiàn)發(fā)熱、乏力和肌肉酸痛等癥狀，嚴(yán)重者可能發(fā)展為敗血性休克和腎功能衰竭等癥狀[1-2]。為了積極應(yīng)對突來的疫情，科研工作者們積極的開展了各方面研究，但在短時(shí)間內(nèi)仍未發(fā)現(xiàn)針對性強(qiáng)且有效的治療藥物[3-5]。目前，我國臨床上采用中西醫(yī)結(jié)合方式治療新型冠狀病毒肺炎，以抗病毒西藥為主，輔助使用中藥進(jìn)行治療，康復(fù)后繼續(xù)使用中藥進(jìn)行恢復(fù)治療[6]。自古以來，中藥對于治療疫病具有很好的效果，在近代的傳染病治療中也發(fā)揮了巨大的作用[7]。新發(fā)布的《新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案》試行第八版中指出，各地可根據(jù)病情、當(dāng)?shù)貧夂蚝筒煌w質(zhì)等情況，進(jìn)行中藥辨證論治[8]。

小兒風(fēng)熱清是以銀翹散為基礎(chǔ)方辨證加減研制而成，具有退熱、鎮(zhèn)痛和止咳的功效。具有抗病毒、抗炎的作用，對于小兒上呼吸道感染，尤其是病毒性感冒，具有較好的治療效果。有研究顯示，小兒風(fēng)熱清對手足口病和甲型流行性感冒具有良好的有效性和安全性[9-11]。藥方含有的抗病毒、抗菌的有效成分可能對COVID-19也有抵抗作用。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)由系統(tǒng)生物學(xué)發(fā)展而來，從系統(tǒng)的角度分析藥物發(fā)揮的作用，十分符合中藥多成分、多途徑、多靶點(diǎn)的作用特點(diǎn)[12-13]。通過構(gòu)建疾病-基因-靶點(diǎn)-藥物的相互作用網(wǎng)絡(luò)，模擬中藥發(fā)揮藥效的方式，能夠預(yù)測出關(guān)鍵的有效成分和潛在靶點(diǎn)，目前已被廣泛用于研究中藥作用的機(jī)制[14-16]。分子對接技術(shù)采用多種分子建模方法，考慮氫鍵和范德華力等多種分子間相互作用的影響，計(jì)算并估計(jì)配體和受體之間的結(jié)合能，來尋找潛在穩(wěn)定的藥物分子和作用靶點(diǎn)，已經(jīng)成為藥物發(fā)現(xiàn)中一種重要的工具[17-18]。本研究通過使用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，對小兒風(fēng)熱清的有效成分進(jìn)行分析，尋找其中可能抗新冠狀病毒肺炎的途徑，并通過分子對接技術(shù)分析關(guān)鍵有效成分與已知新冠狀病毒肺炎相位點(diǎn)的親和度，為相關(guān)研究提供參考和幫助。

1 方法

1.1有效成分的篩選 在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(tái)(TCMSP)[19]和BATMEN-TCM數(shù)據(jù)庫[20]中檢索小兒風(fēng)熱清中的20味中藥，獲取每味中藥的成分，根據(jù)口服生物利用度(OB)和成藥相似性(DL)篩選小兒風(fēng)熱清的有效成分?？诜锢枚?OB)描述口服藥物由腸胃吸收，經(jīng)過肝臟達(dá)到體循環(huán)血液中藥量的百分比，成藥相似性(DL)指化合物與已知藥物的相似性。篩選OB≥30%和DL≥0.18的化學(xué)成分作為小兒風(fēng)熱清有效成分。

1.2潛在靶點(diǎn)的篩選 在TCMSP中獲得小兒風(fēng)熱清有效成分對應(yīng)的預(yù)測靶點(diǎn)，作為小兒風(fēng)熱清發(fā)揮作用的可能靶點(diǎn)。同時(shí)使用關(guān)鍵字“pneumonia”在數(shù)據(jù)庫GeneCards[21]中檢索，獲得肺炎相關(guān)的靶點(diǎn)。取兩部分靶點(diǎn)的交集，作為小兒風(fēng)熱清抗新型冠狀病毒肺炎的潛在靶點(diǎn)，用于后續(xù)分析。

1.3GO和KEGG富集分析 GO(Gene Ontology)數(shù)據(jù)庫主要由生物過程(Biological Process，BP)、分子功能(Molecular Function，MF)和細(xì)胞組分(Cellular Component，CC)三個(gè)獨(dú)立的部分組成[22]。BP指基因或者基因產(chǎn)物參與的生物過程，一個(gè)過程由一個(gè)或多個(gè)有序的分子功能組成，例如細(xì)胞生長和分裂、細(xì)胞循環(huán)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等。MF就是指基因產(chǎn)物的生化活動(dòng)，例如酶、受體、配體和轉(zhuǎn)運(yùn)等。CC指基因的產(chǎn)物在細(xì)胞中展現(xiàn)活性的具體位置，例如核糖體、蛋白酶體、細(xì)胞核和細(xì)胞膜等。

KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)是一個(gè)用于基因功能系統(tǒng)分析的數(shù)據(jù)庫，其中的PATHWAY包含了分子相互作用網(wǎng)絡(luò)(通路)在基因?qū)用娴拿枋?，例如?xì)胞凋亡，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，細(xì)胞循環(huán)等過程，為目前整理最好且使用最多的數(shù)據(jù)庫[23]。

對潛在靶點(diǎn)進(jìn)行GO和KEGG富集分析，可以揭示其涉及的主要功能和通路，了解其可能發(fā)揮的作用。本文使用R語言(https://www.r-project.org/)中的clusterProfiler包[24]進(jìn)行潛在靶點(diǎn)的富集分析，并進(jìn)行結(jié)果的可視化。

1.4藥物-有效成分-潛在靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 使用R語言整理導(dǎo)入Cytoscape軟件[25]中，使用merge功能構(gòu)建藥物-有效成分-潛在靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，對網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析，根據(jù)節(jié)點(diǎn)的度(degree)篩選前20個(gè)有效成分。

1.5蛋白互作網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 在STRING數(shù)據(jù)庫[26]中檢索潛在靶點(diǎn)，構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，并將蛋白間相互作用的數(shù)據(jù)導(dǎo)出。在Cytoscape軟件中，使用蛋白互作數(shù)據(jù)重新進(jìn)行蛋白互作網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建，使用MCC算法篩選網(wǎng)絡(luò)中較為核心的20個(gè)蛋白，并使用MCODE工具獲得較為致密的蛋白互作模塊。

1.6分子對接 3CLpro控制著冠狀病毒復(fù)制復(fù)合物的活性[27]，ACE2是SARS-CoV-2進(jìn)入宿主細(xì)胞的關(guān)鍵受體[28]，在RCSB數(shù)據(jù)庫[29]種檢索上述兩種蛋白，獲得其3D結(jié)構(gòu)。同時(shí)在Pubchem數(shù)據(jù)庫[30]中檢索20種有效成分，獲得對應(yīng)的3D結(jié)構(gòu)。使用PyMol軟件[31]處理受體蛋白分子，去除其中的水分子和配體。使用Autodock軟件[32]處理有效成分和受體蛋白，進(jìn)行加氫、計(jì)算電荷和對接操作。結(jié)合能≤-5 kJ/mol時(shí)認(rèn)為有效成分與受體蛋白的結(jié)合較為穩(wěn)定，并使用PyMol軟件對結(jié)果進(jìn)行可視化。

1.7實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

1.7.1藥品和試劑 小兒風(fēng)熱清合劑(邯鄲制藥股份有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：S03520003，規(guī)格：60 mL)；拜耳阿司匹林腸溶片(拜耳醫(yī)藥保健有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：BJ51469，規(guī)格：100 mg)；二甲苯(天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：20190103)。

1.7.2動(dòng)物 SPF級(jí)雄性BALB/c小鼠，體質(zhì)量(20±2) g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(京)2019-0008。

1.7.3小鼠抗炎試驗(yàn) 對18只小鼠編號(hào)，隨機(jī)分為3組：小兒風(fēng)熱清組、陽性對照組、空白模型組，每組6只。小兒風(fēng)熱清組給予小兒風(fēng)熱清合劑7.8 mL·kg-1·d-1(由說明書上人的日服劑量換算得來)；陽性對照組給予阿司匹林0.2 g-1·kg-1·d-1；空白模型組給予等量蒸餾水，均采取灌胃給藥方式，每天給藥1次，連續(xù)給藥3 d。最后一天給藥1 h后，將二甲苯均勻涂于小鼠左耳前、后兩面，30 μL/只，制備耳腫脹模型。致炎40 min后，小鼠脫頸處死，用8 mm直徑的打孔器分別在左耳和右耳的同一部位取得耳片組織，用分析天平進(jìn)行稱重。腫脹度=致炎后左耳片質(zhì)量-未致炎右耳片質(zhì)量；腫脹率(%)=(致炎后左耳片質(zhì)量-未致炎右耳片質(zhì)量)/未致炎右耳片質(zhì)量×100%；腫脹抑制率(%)=[(空白組平均耳腫脹度-實(shí)驗(yàn)組平均耳腫脹度)/空白組平均耳腫脹度]×100%。

1.7.4小鼠鎮(zhèn)痛實(shí)驗(yàn) 調(diào)節(jié)水浴鍋，控制溫度在55±0.5 ℃，在水浴鍋上放置鋁板。用秒表記錄每只小鼠的痛閾值(即小鼠自放入熱板后第一次出現(xiàn)舔后足的時(shí)間)，測量2次，挑選痛閾值均值在5～30 s之間且反應(yīng)穩(wěn)定、不跳躍的小鼠18只。將18只小鼠進(jìn)行編號(hào)，隨機(jī)分成3組，每組6只，分別為小兒風(fēng)熱清組、陽性對照組、空白模型組。小兒風(fēng)熱清組給予小兒風(fēng)熱清合劑7.8 mL·kg-1·d-1；陽性對照組給予阿司匹林0.2 g·kg-1·d-1；空白模型組給予等量蒸餾水，均采取灌胃給藥方式，每天灌胃1次，連續(xù)給藥3 d。最后一天給藥后 30、60、90和120 min，以同樣的方法測定各小鼠的痛閾值并記錄，痛閾值若超過60 s則以60 s計(jì)。

2 結(jié)果

2.1有效成分篩選 經(jīng)過OB≥30%和DL≥0.18的標(biāo)準(zhǔn)篩選后，共獲得282種無重復(fù)的有效成分。其中甘草有效成分92種，板藍(lán)根有效成分39種，黃芩有效成分36種，赤芍有效成分29種，連翹有效成分23種，金銀花有效成分23種，苦杏仁有效成分19種，防風(fēng)有效成分18種，柴胡有效成分17種，梔子有效成分15種，薄荷有效成分10種，牛蒡子有效成分8種，荊芥穗有效成分8種，石膏有效成分7種，桔梗有效成分7種，積殼有效成分5種，蘆根有效成分1種，淡竹葉有效成分1種，炒六神曲有效成分1種，僵蠶并沒有篩選出有效成分，表1為各種藥材的部分有效成分。

2.2潛在靶點(diǎn)獲取 潛在靶點(diǎn)的獲取結(jié)果如圖1所示，將TCMSP中預(yù)測得到的靶點(diǎn)去重后，共得到284個(gè)無重復(fù)的靶點(diǎn)。同時(shí)在GeneCards中檢索得到5014個(gè)肺炎相關(guān)靶點(diǎn)蛋白，與TCMSP中的預(yù)測靶點(diǎn)取交集后得到210個(gè)小兒風(fēng)熱清抗新型冠狀病毒肺炎的潛在靶點(diǎn)。

圖1 潛在靶點(diǎn)的篩選

2.3GO和KEGG富集分析 潛在靶點(diǎn)的GO富集分析見圖2。結(jié)果顯示潛在靶點(diǎn)涉及的主要生物過程有對抗生素的反應(yīng)、對化學(xué)應(yīng)激的反應(yīng)、對氧化應(yīng)激的反應(yīng)、對脂多糖的反應(yīng)、對活性氧的反應(yīng)和對藥物的反應(yīng)等；主要位于膜筏、膜微區(qū)、囊泡腔、小窩和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)復(fù)合物中；主要具有核受體活性、配體激活的轉(zhuǎn)錄因子活性、磷酸酶結(jié)合、DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合和細(xì)胞因子活性等分子功能。KEGG富集分析見圖3，結(jié)果顯示潛在靶點(diǎn)涉及的主要通路有糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號(hào)通路、流體剪切應(yīng)力與動(dòng)脈粥樣硬化、IL-17信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路和乙型肝炎等。

AGE-RAGE信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)會(huì)激活多個(gè)信號(hào)通路，使NF-κB激活，從而促進(jìn)多種促炎性細(xì)胞因子以及多種與動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)的基因表達(dá)。白細(xì)胞介素17(IL-17)家族是由IL-17A-F組成的細(xì)胞因子的一個(gè)子集，在急性和慢性炎癥反應(yīng)中都起著至關(guān)重要的作用。結(jié)果顯示這些潛在靶點(diǎn)主要存在于膜上，行使類似受體的功能，參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，涉及與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)的通路，因此從功能的角度考慮，這些潛在靶點(diǎn)十分具有研究價(jià)值。

表1 小兒風(fēng)熱清中部分活性化合物的基本信息

圖3 潛在靶點(diǎn)KEGG富集分析

2.4藥物-有效成分-潛在靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò) 將藥物、有效成分和潛在靶點(diǎn)的信息導(dǎo)入Cytoscape軟件中，構(gòu)建藥物-有效成分-潛在靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)。結(jié)果如圖4所示，其中粉色菱形節(jié)點(diǎn)代表小兒風(fēng)熱清的藥材(19種)，紫色三角形節(jié)點(diǎn)代表有效成分(207種)，綠色圓形節(jié)點(diǎn)代表潛在靶點(diǎn)(210個(gè))。去除藥材信息后，對有效成分和潛在靶點(diǎn)之間的連接情況進(jìn)行總結(jié)分析。發(fā)現(xiàn)每個(gè)有效成分平均與10.17個(gè)潛在靶點(diǎn)連接，每個(gè)潛在靶點(diǎn)平均與10.02個(gè)有效成分連接。表明小兒風(fēng)熱清中的每種有效成分可能作用于多個(gè)不同的靶點(diǎn)，同時(shí)每個(gè)靶點(diǎn)也可能接受多個(gè)不同有效成分的作用，這些結(jié)果與中藥多成分、多位點(diǎn)的治療特點(diǎn)相符。

圖5為連接度(degree)最高的20個(gè)有效分子和潛在靶點(diǎn)。連接度越高表明該有效成分或潛在靶點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中核心地位越高，其變化對整個(gè)網(wǎng)絡(luò)的影響也就越大。有效成分中quercetin (槲皮素)、luteolin(木犀草素)、kaempferol(山奈酚)、 wogonin(漢黃芩素)、baicalein(黃芩素)等連接度最高，可能小兒風(fēng)熱清中的主要有效成分。潛在靶點(diǎn)中PTGS2、HSP90AA1、PTGS1、AR、ESR1等連接度最高，有效成分可能主要通過調(diào)控這些靶點(diǎn)發(fā)揮作用。

2.5蛋白互作網(wǎng)絡(luò) 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建結(jié)果如圖6所示，該網(wǎng)絡(luò)中共209個(gè)節(jié)點(diǎn)，4736條邊，平均連接度為45.1。每個(gè)節(jié)點(diǎn)代表一個(gè)蛋白(潛在靶點(diǎn))，每條邊代表兩個(gè)蛋白之間的相互作用，因?yàn)锳PBA與網(wǎng)絡(luò)中的其它蛋白暫無相互作用關(guān)系，所以該網(wǎng)絡(luò)由209個(gè)節(jié)點(diǎn)組成。

將STRING中的蛋白質(zhì)相互作用數(shù)據(jù)導(dǎo)出，使用Cytoscape軟件中的MCC算法進(jìn)行計(jì)算，得到20個(gè)處于蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)中心的蛋白，這些蛋白連接度也最高，可能是治療過程中中藥的調(diào)控位點(diǎn)，具有較高的研究價(jià)值，具體蛋白名稱如圖7所示，其中排名前五的分別為VEGFA、MAPK3、JUN、AKT1和IL6。隨后使用Cytoscape軟件中的MCODE功能對蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行模塊劃分。結(jié)果如圖8所示，得到3個(gè)k值大于4的模塊，模塊1、模塊2和模塊3分別由67、29和7個(gè)蛋白質(zhì)組成。模塊內(nèi)的蛋白質(zhì)之間關(guān)系比較緊密，可能具有相近的生物學(xué)功能，有利于分析特定基因或蛋白之間聯(lián)系。

圖4 藥材-有效成分-潛在靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

圖5 有效成分和潛在靶點(diǎn)連接度TOP20

圖6 潛在靶點(diǎn)對應(yīng)的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖

圖7 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中Top20核心蛋白

圖8 蛋白相互作用模塊

2.6分子對接 20種關(guān)鍵有效成分與3CLpro和ACE2的對接結(jié)果如表2所示，其中kaempferol、baicalein、formononetin、beta-sitosterol、vestitol、2-[(3r)-8,8-dimethyl-3,4-dihydro-2h-pyrano[6,5-f]chromen-3-yl]-5-methoxyphenol、shinpterocarpin、hmo和beta-carotene與3CLpro的結(jié)合能小于-5 kJ/mol，表明這些化合物很可能與3CLpro直接作用；shinpterocarpin(紫檀素)和acacetin(刺槐黃素)與ACE2的結(jié)合能小于-5 kJ/mol，表明這兩個(gè)化合物很可能與ACE2直接作用。其中shinpterocarpin與這兩種蛋白的結(jié)合能皆小于-5 kJ/mol。圖9分別展示了2個(gè)與4CLpro或ACE2結(jié)合能最小的有效成分。

圖9 有效成分與3CLpro和ACE2分子對接模式

2.7小兒風(fēng)熱清對二甲苯致小鼠耳腫脹的影響 平均腫脹率反映了二甲苯致炎后小鼠耳腫脹程度。二甲苯致炎40 min后，空白模型組小鼠平均耳腫脹率為(34.31±15.13)%，與空白模型組相比，小兒風(fēng)熱清給藥組平均耳腫脹率為(21.48±5.89)%，表明小兒風(fēng)熱清可抑制小鼠耳片的腫脹程度，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.05)。腫脹抑制率則反映了藥物作用下小鼠耳腫脹的消退程度，具體結(jié)果見表3和圖10。

表3 小兒風(fēng)熱清對二甲苯致小鼠耳腫脹

2.8小兒風(fēng)熱清對熱刺激致小鼠疼痛的影響 如表 4 所示，在給藥120 min 后，空白模型組痛閾值為(28.17±14.82)s，小兒風(fēng)熱清組痛閾值為(14.01±6.99)s，與空白模型組相比，小兒風(fēng)熱清組顯著緩解了熱刺激所致小鼠疼痛，舔足潛伏期明顯延長，表明小兒風(fēng)熱清具有一定的鎮(zhèn)痛作用。

圖10 各組小鼠耳腫脹程度比較(n=6，*P<0.05)。

表4 各組小鼠不同時(shí)間點(diǎn)痛閾值的比較

3 討論

至今對于COVID-19的治療仍然缺乏有效的特效藥，現(xiàn)有的化學(xué)藥物和抗生素等也僅是針對癥狀進(jìn)行治療，目前最熱門有潛力的特效藥物有瑞德西韋、利托那韋、阿比朵兒、達(dá)蘆那韋、磷酸氯喹等。但是，所有這些都還是探索，并沒有定論。哪怕是最有希望的瑞德西韋也只是進(jìn)入了中國的臨床3期試驗(yàn)，短時(shí)間內(nèi)并不能用于臨床治療。而中醫(yī)藥在多次疫情中都發(fā)揮了很好的防治作用，從疫情發(fā)生至今，國家衛(wèi)生健康委聯(lián)合國家中醫(yī)藥管理局已經(jīng)頒布了5版《關(guān)于新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案》，從中醫(yī)治療推薦的處方分析，明顯看出現(xiàn)階段臨床治療 COVID-19 初期癥狀的處方是在小兒風(fēng)熱清的基礎(chǔ)方上加減用藥。

文獻(xiàn)報(bào)道[27]，3CLPro是冠狀病毒復(fù)制所必須的酶，可作為有效的抗病毒藥物靶點(diǎn)，2003年SARS以來已經(jīng)有大量的研究基礎(chǔ)。Lopinavir與Ritonavir等抗HIV藥物也是作用于類似的蛋白酶靶點(diǎn)，并在臨床上得到很好的驗(yàn)證。由于人體內(nèi)沒有與3CLPro類似切割位點(diǎn)的蛋白酶，可篩選出高特異性的抑制劑，具有更好的安全性。3CLPro在beta冠狀病毒中保守性高，篩選出的3CLPro抑制劑具有廣譜抗冠狀病毒能力，甚至可能用于豬冠狀病毒等其他動(dòng)物的疾病治療中。同時(shí)，SARS-CoV-1與 SARS-CoV-2兩種病毒感染的途徑均通過其表達(dá)的S蛋白與宿主細(xì)胞表面ACE2 受體結(jié)合，進(jìn)而介導(dǎo)病毒入侵宿主細(xì)胞，由此可見，ACE2是冠狀病毒抗體研發(fā)的重要靶點(diǎn)。綜合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析結(jié)果得知，20個(gè)關(guān)鍵的有效成分。通過構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)篩選20個(gè)關(guān)鍵的潛在靶點(diǎn)和3個(gè)較為致密的蛋白作用模塊。將篩選得到的20種關(guān)鍵有效成分與新型冠狀病毒肺炎密切相關(guān)的3CLpro和ACE2進(jìn)行分子對接，發(fā)現(xiàn)其種9種有效成分與3CLpro具有較高親和力，shinpterocarpin(紫檀素)和acacetin(刺槐黃素)與ACE2的結(jié)合能小于-5 kJ/mol，說明這兩種有效成分與ACE2具有較高親和力，其中shinpterocarpin(紫檀素)與這兩種蛋白的結(jié)合能皆小于-5 kJ/mol，具有非常高的研究潛力，但仍需進(jìn)一步研究。

小兒風(fēng)熱清KEGG富集分析顯示潛在靶點(diǎn)涉及的通路主要有糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號(hào)通路、流體剪切應(yīng)力與動(dòng)脈粥樣硬化、IL-17信號(hào)通路和TNF信號(hào)通路等。其中，IL-17信號(hào)通路和TNF信號(hào)通路是重要的促炎癥細(xì)胞因子通路，由輔助性T細(xì)胞(Th17)、先天性免疫細(xì)胞及癌相關(guān)成纖維細(xì)胞CAFs等分泌，在多種炎性反應(yīng)及自身免疫性疾病病理過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。IL-17受體(IL-17R)通過信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)復(fù)合體IL-17R-Act1-TRAF6激活下游NF-kB、JNK等信號(hào)通路。TNF信號(hào)通路可以激活Caspase蛋白酶，JNK和轉(zhuǎn)錄因子NF-kB三條信號(hào)通路，實(shí)現(xiàn)其細(xì)胞毒性、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)和細(xì)胞凋亡等生物學(xué)功能。然而，小兒風(fēng)熱清通過該信號(hào)通路的調(diào)控COVID-19引起的相關(guān)癥狀，從而起到抗 COVID-19 的作用需要進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接的方法對小兒風(fēng)熱清中化學(xué)成分、作用靶點(diǎn)和其核心活性化合物以及與 3CLpro和 ACE2結(jié)合能進(jìn)行了探索性研究，從中可以看出小兒風(fēng)熱清治療疾病是通過多成分、多靶點(diǎn)、多通路的協(xié)同作用來發(fā)揮療效的。鑒于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接的局限性，后期有條件的科研團(tuán)隊(duì)可以圍繞物質(zhì)基礎(chǔ)-藥效學(xué)評價(jià)-代謝組學(xué)-通路驗(yàn)證等開展實(shí)驗(yàn)研究，為小兒風(fēng)熱清治療 COVID-19 以及后期的藥物開發(fā)提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。