李濤 陶山 李倩 郭東艷 范妤*

(1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，陜西 咸陽(yáng) 712046；2.陜西省中藥基礎(chǔ)與新藥研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 咸陽(yáng) 712046)

七珠膠囊是由太白楤木、湖北海棠、葉下珠3味中藥組成，具有解毒祛濕、疏肝止痛的功效，方中太白楤木驅(qū)風(fēng)除濕、利水消腫、止痛、健脾，常用于治療急慢性肝炎、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、淋巴結(jié)腫大、糖尿病等[1]；湖北海棠養(yǎng)肝和胃、消積化滯，常用于急慢性肝損傷，慢性肝炎，脂肪肝治療[2-3]；葉下珠平肝清熱、利水解毒，用于治療傳染性肝炎、腎炎水腫、尿路感染、無(wú)名腫痛等[4]。三藥配伍，共奏解毒祛濕、疏肝止痛的功效。課題組前期對(duì)其有效部位的提取及純化工藝進(jìn)行了篩選[5-10]，本實(shí)驗(yàn)是在前期研究的基礎(chǔ)上，以太白楤木總皂苷、湖北海棠總黃酮、葉下珠總多酚三個(gè)有效部位為原料進(jìn)行配伍組方，通過(guò)腹腔注射40%CCl4橄欖油溶液復(fù)制慢性肝損傷大鼠模型，確定七珠膠囊的抗肝損傷作用，從氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)兩方面探究其保肝作用靶點(diǎn)及其作用機(jī)制，為七珠膠囊的保肝作用研究提供理論依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD大鼠60只，雄性，體質(zhì)量180～220 g，SPF級(jí)，由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：SCXK(陜)2012-003。在室溫(25±2)℃下飼養(yǎng)，所有大鼠均自由攝食且不限飲水。

1.2實(shí)驗(yàn)藥物 太白楤木藥材購(gòu)于陜西眉縣藥材公司，經(jīng)陜西中醫(yī)藥大學(xué)王繼濤高級(jí)實(shí)驗(yàn)師鑒定為五加科(Araliaceae)植物太白楤木(Aralia taibaiensis)的根皮；湖北海棠藥材購(gòu)自湖北神農(nóng)架藥材公司，經(jīng)陜西中醫(yī)藥大學(xué)王繼濤老師鑒定為蘋果屬(MalusMill.)湖北海棠(Malushupehensis(Pamp.)Rehd)的干燥葉；葉下珠藥材購(gòu)自陜西昊源中藥飲片有限公司，經(jīng)陜西中醫(yī)藥大學(xué)王繼濤高級(jí)實(shí)驗(yàn)師鑒定為大戟科葉下珠屬植物葉下珠(Phyllanthusurinaria)的干燥全草；聯(lián)苯雙酯滴丸(浙江醫(yī)藥股份有限公司新昌制藥廠，批號(hào)：20140818)；四氯化碳(天津天士力化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20140228)；橄欖油(廣州花之王化工有限公司,批號(hào)：20140528)，其它試劑均為分析純。

1.3試劑與儀器 ALT試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號(hào)：20150723)，AST試劑盒(南京建成生物工程研究所,批號(hào)：20150519)，BAC蛋白定量試劑盒(南京建成生物工程研究所,批號(hào)：20150514)，超氧化物歧化酶(SOD)測(cè)定試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號(hào)：20150518)，丙二醛(MDA) 測(cè)定試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號(hào)：20150404)，谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)測(cè)定試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號(hào)：20150908)，兔抗TNF-α(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)：60291-1-lg)、NF-κB多克隆抗體(美國(guó)Cell Signaling公司，貨號(hào)：#4764)，免疫組化染色試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司，批號(hào)：20150618)。

Centrifuge 5417R臺(tái)式冷凍高速離心機(jī)(Germany Eppendorf)，JJ-2組織搗碎勻漿機(jī)(金壇市富華儀器有限公司)，HHS-4A電熱恒溫水浴鍋(滬越實(shí)驗(yàn)儀器廠)，JA2003型電子分析天平(上海梅特勒-托利多儀器有限公司)，BIO-RAD Model680酶標(biāo)儀(北京伯樂生命科學(xué)發(fā)展有限公司)，JJQ-P2016J生物組織切片機(jī)(武漢俊杰電子有限公司)，ZEISS顯微鏡(德國(guó)蔡司公司，型號(hào)ImagerA1)，BIO-RAD電泳儀(北京伯樂生命科學(xué)發(fā)展有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1方法

2.1.1分組及給藥 取SD大鼠60只，隨機(jī)分為6組，即空白對(duì)照組、模型組、陽(yáng)性對(duì)照組、七珠膠囊高、中、低劑量治療組，每組10只，置于溫度(25±1)℃，相對(duì)濕度(40%～65%)的實(shí)驗(yàn)室，適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后試驗(yàn)。將楤木總皂苷0.08 g·kg-1：海棠總黃酮0.30 g·kg-1：葉下珠總多酚0.22 g·kg-1組合分別為為給藥高劑量(1.2 g·kg-1)組，中劑量(0.6 g·kg-1)組，低劑量(0.3 g·kg-1)組。除空白對(duì)照組外，其余各組大鼠給予腹腔注射40%CCl4橄欖油溶液(容積為3 mL·kg-1，2次/w，周一、周五各1次，連續(xù)8周。從造模第1日起，空白對(duì)照組和模型組給予等體積生理鹽水；陽(yáng)性對(duì)照組在造模同時(shí)給予聯(lián)苯雙酯滴丸水溶液(0.5 g·kg-1)治療；治療組在造模同時(shí)給予七珠膠囊水溶液治療，1次/d，連續(xù)8 w。

2.1.2取材 末次注射CCl416 h后，戊巴比妥5 mg/100g 腹腔注射麻醉大鼠，蛙板固定大鼠，腹主動(dòng)脈取血，收集血液，3000 r·min-1離心10 min取上清，分離血清，-20 ℃保存；同時(shí)立即剖取肝臟，取0.5 g肝組織，剪碎，放于玻璃勻漿器中，加預(yù)冷的9倍體積的0.9%生理鹽水，2500 rmp離心10 min，上清液-20 ℃保存?zhèn)溆肹11]；最大葉肝組織浸泡于10%甲醛溶液中固定；其余肝組織-80 ℃保存，用于提取總蛋白。

2.1.3肝臟指數(shù)的檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，稱量體質(zhì)量后麻醉取肝臟并稱重肝質(zhì)量，計(jì)算肝臟系數(shù)=(肝質(zhì)量/體質(zhì)量)。

2.1.4血清中 ALT、AST含量檢測(cè) 腹主動(dòng)脈取血，分離血清，置-20 ℃保存，酶標(biāo)儀檢測(cè)血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)含量。

2.1.5肝臟組織HE染色染色 取肝組織置于10% 福爾馬林溶液中固定24 h，乙醇梯度脫水，石蠟包埋，切片，進(jìn)行蘇木素-伊紅HE染色，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書步驟操作。光鏡下觀察肝組織病理學(xué)變化。

2.1.6肝組織抗氧化指標(biāo)的檢測(cè) 按照試劑盒說(shuō)明書操作說(shuō)明，檢測(cè)肝組織勻漿中SOD、GSH-Px、 MDA活性的變化。

2.1.7Western-blot檢測(cè)肝組織TNF-α、NF-κB表達(dá)及含量變化 提肝組織取總蛋白，蛋白定量后，按照制膠、上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗二抗孵育、顯色、顯影、定影、照相、分析的步驟操作，檢測(cè)肝組織中TNF-α、NF-κB的表達(dá)。結(jié)果使用Adobe Photoshop 7.0軟件測(cè)定平均灰度值，計(jì)算TNF-α、NF-κB蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

2.1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS11.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，組間比較采用方差分析。P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2結(jié)果

2.2.1七珠膠囊對(duì)CCl4致慢性肝損傷大鼠肝臟指數(shù)的影響 與模型組比較，七珠膠囊各治療組均不同程度降低肝臟指數(shù)，與模型組相比均有顯著差異(P<0.01)，結(jié)果見圖1。

注：與空白對(duì)照組相比1)P<0.01；與模型組相比2)P<0.01

肝臟指數(shù)的影響(n=10)

2.2.2七珠膠囊對(duì)CCl4致大慢性肝損傷大鼠血清轉(zhuǎn)氨酶活性的影響 與空白對(duì)照組比較，模型組大鼠血清中ALT、AST活性明顯升高，有顯著性差異(P<0.01)。與模型組比較，陽(yáng)性組和七珠膠囊高、中、低治療組血清ALT、AST活性均能降低，統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著(P<0.05)。結(jié)果見圖2。

2.2.3七珠膠囊對(duì)CCl4致大慢性肝損傷大鼠肝組織形態(tài)影響 HE染色顯示，空白對(duì)照組大鼠肝臟小葉結(jié)構(gòu)完整，肝細(xì)胞繞中央靜脈放射狀排列，未發(fā)生纖維增生及炎細(xì)胞浸潤(rùn)；模型對(duì)照組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)破壞，中央靜脈粗大，肝臟膠原纖維條索分割、圍繞肝小葉排列，形成假小葉，肝細(xì)胞壞死嚴(yán)重、脂肪變性，大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)；與模型組進(jìn)行比較，七珠膠囊治療組均不同程度改善大鼠肝組織損傷，變性、壞死肝細(xì)胞減少，炎細(xì)胞浸潤(rùn)減少。結(jié)果見圖3。

2.2.4七珠膠囊對(duì)CCl4致慢性肝損傷大鼠肝組織SOD、GSH-Px活性和MDA水平的影響 與空白對(duì)照組相比，模型組肝組織勻漿中SOD和GSH-Px活性降低顯著(P<0.01)， MDA含量顯著升高(P<0.01)；與模型組相比，七珠膠囊低、中、高劑量組及陽(yáng)性組均可不同程度地提高肝組織中SOD和GSH-Px活性，降低MDA含量(P<0.01)，結(jié)果見表1。

注：與空白對(duì)照組相比1) P<0.01；與模型組相比2)P<0.01，3)P<0.05

圖3 七珠膠囊對(duì)CCl4致大鼠慢性肝損傷肝組織形態(tài)學(xué)變化的影響(HE染色，×200)

2.2.5七珠膠囊對(duì)CCl4致慢性肝損傷大鼠肝組織TNF-α、NF-κB蛋白表達(dá)的影響 Western-blot結(jié)果顯示：空白對(duì)照組大鼠肝組織中TNF-α、NF-κB表達(dá)較少，模型組TNF-α、NF-κB蛋白表達(dá)增多。與模型組比較，七珠膠囊各治療組肝組織TNF-α、NF-κB表達(dá)減少，統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著(P<0.01)。結(jié)果見圖4。

注：與空白對(duì)照組相比1) P<0.01；與模型組相比2)P<0.01，3)P<0.05

3 討論

CCl4誘導(dǎo)復(fù)制慢性肝損傷動(dòng)物模型是一種經(jīng)典的造模方法[12-14]，CCl4造模途徑多樣，病理特征穩(wěn)定，已廣泛用于研究慢性肝損傷、肝纖維化發(fā)生的細(xì)胞及分子機(jī)制、血清學(xué)標(biāo)志物與組織病理的相關(guān)性及抗慢性肝損傷的藥效評(píng)價(jià)[15-17]。肝細(xì)胞受損時(shí)胞質(zhì)內(nèi)合成的AST、ALT大量釋放入血，血液AST、ALT活性變化與肝損傷程度呈正相關(guān)，是目前公認(rèn)的判斷肝損傷程度最敏感的血清學(xué)指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，七珠膠囊高、中、低劑量治療組均能夠顯著降低慢性肝損傷大鼠血清中AST、ALT活性，降低肝臟臟器指數(shù)；肝組織HE染色和Masson染色觀察，與模型組比較七珠膠囊治療組大鼠肝組織炎細(xì)胞浸潤(rùn)減少，肝細(xì)胞壞死及肝小葉結(jié)構(gòu)有不同程度改善，肝組織纖維沉積顯著減少。表明七珠膠囊能夠有效緩解CCl4所致的慢性肝損傷及其早期肝纖維化，具有較好的保肝作用。

CCl4被肝細(xì)胞內(nèi)微粒體酶活化為三氯甲基自由基(·CCl3)，后者與氧結(jié)合生成的CCl3OO-·引發(fā)脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，CCl3OO-·可破壞肝細(xì)胞膜磷脂層結(jié)構(gòu)，膜通透性增高，同時(shí)促使細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的終產(chǎn)物MDA增多，與自由基一起協(xié)同加重肝損傷程度[18]。CCl4還能夠抑制“內(nèi)源性”抗氧化劑SOD和GSH-Px活性，破壞機(jī)體自由基生成與清除的動(dòng)態(tài)平衡，過(guò)量的自由基在體內(nèi)蓄積，上調(diào)體內(nèi)氧化應(yīng)激水平，進(jìn)一步損傷肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能，引發(fā)肝組織局部炎癥反應(yīng)，改變肝組織結(jié)構(gòu)及功能[19]。本研究結(jié)果表明，七珠膠囊各治療組能夠顯著提高大鼠血清SOD、GSH-Px活力，減低MDA含量，促進(jìn)體內(nèi)自由基清除，減輕肝細(xì)胞損傷，抑制MDA生成，提示七珠膠囊防治肝損傷作用與抑制體內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)密切相關(guān)。

TNF-α是由單核細(xì)胞及巨噬細(xì)胞分泌的17 KD非糖蛋白，是重要的促炎因子[18]。TNF-α參與CCL4致化學(xué)性肝損傷作用主要原因是激活了中性粒細(xì)胞，進(jìn)而促進(jìn)其吞噬、氧爆發(fā)等效應(yīng)，活化NF-κB。一般情況下，NF-κB P65/P50-IκB三聚體位于胞質(zhì)處于未活化狀態(tài)，NF-κB是能夠被氧化應(yīng)激激活的重要炎癥轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子[20]，當(dāng)細(xì)胞受到自由基、內(nèi)毒素、細(xì)胞因子(TNF-α、IL-1β、IL-1等)等刺激因素作用時(shí)，激活蛋白激酶(IKKs)使IκB磷酸化，三聚體解離，NF-κB P65/P50轉(zhuǎn)位入核，與核內(nèi)ARE組件結(jié)合，κB位點(diǎn)結(jié)合可增強(qiáng)TNF-α基因轉(zhuǎn)錄，使TNF-α產(chǎn)生及釋放增多并且炎性細(xì)胞被激活，進(jìn)一步激活了NF-κB，形成了一個(gè)正反饋調(diào)節(jié)，炎癥反應(yīng)不斷放大[21]。在實(shí)驗(yàn)中我們采用Western-blot法檢測(cè)大鼠肝組織中NF-κB P65及TNF-α的表達(dá)，結(jié)果顯示，CCl4可導(dǎo)致NF-κB P65在肝組織中TNF-α表達(dá)增多，提示肝纖維化發(fā)生發(fā)展過(guò)程中伴隨著肝組織炎癥反應(yīng)，七珠膠囊能夠有效抑制肝細(xì)胞NF-κB的核轉(zhuǎn)位，減少TNF-α合成，通過(guò)調(diào)控TNF-α/NF-κB信號(hào)通路，抑制肝纖維進(jìn)程中炎癥反應(yīng)。

綜上所述，七珠膠囊對(duì)CCl4誘導(dǎo)的大鼠慢性肝損傷具有明顯保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能與減輕氧化應(yīng)激損傷、調(diào)控TNF-α/NF-κB通路抑制炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，本研究將為七珠膠囊制劑的臨床開發(fā)應(yīng)用提供研究基礎(chǔ)和理論依據(jù)。