劉 娜 徐悅利 武雅琦 彭俊旭 張 欣 林嘉欣 任從才▲

1.中山大學(xué)附屬第八醫(yī)院（深圳福田）麻醉科，廣東深圳 518000；2.深圳市婦幼保健院麻醉科，廣東深圳 518000

術(shù)后認(rèn)知功能障礙（postoperative cognitive dysfunction，POCD）指患者在手術(shù)后數(shù)天或數(shù)月學(xué)習(xí)記憶或認(rèn)知功能下降，好發(fā)于老年患者。但其發(fā)病機(jī)制仍不清楚[1-2]。環(huán)氧合酶（cyclooxygenase，COX）是催化花生四烯酸合成前列腺素（prostaglandin，PG）的關(guān)鍵酶，炎癥介質(zhì)環(huán)氧合酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）備受學(xué)者關(guān)注。研究顯示，中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病發(fā)病機(jī)制與腦內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞激活、COX-2 上調(diào)和損傷性PG 的合成增加，凋亡反應(yīng)啟動(dòng)有關(guān)[3-4]。因此，本研究運(yùn)用選擇性COX-2 抑制劑帕瑞昔布鈉（Parecoxib Sodium）干預(yù)老年大鼠POCD 模型，觀察機(jī)體創(chuàng)傷后小膠質(zhì)細(xì)胞激活狀態(tài)、中樞炎癥反應(yīng)及細(xì)胞凋亡與POCD 的關(guān)系，探討可能的病理基礎(chǔ)，旨在為臨床治療POCD 奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

本研究獲中山大學(xué)附屬第八醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)后實(shí)施。選擇40 只雄性老年SD 大鼠，體重（500±50）g，15～16 周齡，購(gòu)買于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司[許可證編號(hào)：SCXK（京）2011-0009]。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)于清潔級(jí)動(dòng)物房，光照時(shí)間為8:00～18:00，室溫為22～24℃，濕度為50%。

1.2 實(shí)驗(yàn)用藥

帕瑞昔布鈉（江蘇輝瑞有限公司，批號(hào)CR3115）；戊巴比妥（Sigma 公司，USA，產(chǎn)品CAS57-33-0）

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 動(dòng)物分組

大鼠隨機(jī)分為四組（n=10）：等時(shí)間點(diǎn)給予大鼠腹腔注射等體積0.9%NaCl 作為對(duì)照組；等時(shí)間點(diǎn)給予大鼠腹腔注射等劑量帕瑞昔布鈉作為帕瑞昔布鈉組；大鼠行左腎切除術(shù)作為模型組；大鼠行左腎切除術(shù)并于術(shù)前連續(xù)3 d 給予腹腔注射帕瑞昔布鈉10 mg/（kg·d），左腎切除術(shù)后連續(xù)3 d 給予腹腔注射帕瑞昔布鈉2 mg/（kg·d）作為治療組。

1.3.2 動(dòng)物模型制作

手術(shù)步驟參照文獻(xiàn)[5]的方法。腹腔注射0.3%戊巴比妥麻醉，手術(shù)步驟：無(wú)菌條件下左肋緣下，上腹部行切口約3 cm，游離左側(cè)腎臟，絲線結(jié)扎兩次腎動(dòng)、靜脈后切除左側(cè)腎臟。

1.3.3 Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)

術(shù)前大鼠連續(xù)5 d 進(jìn)行定位航行訓(xùn)練，即每天將大鼠從4 個(gè)不同入水點(diǎn)隨機(jī)放入池中4 次，系統(tǒng)記錄大鼠尋找到隱藏水下平臺(tái)所用時(shí)間，即逃避潛伏期（escape latency）。具體包括以下兩個(gè)方面。

1.3.3.1 空間探索實(shí)驗(yàn) 將原有訓(xùn)練平臺(tái)撤掉，讓大鼠在原平臺(tái)所在象限對(duì)側(cè)入水，測(cè)試60 s 內(nèi)大鼠在目標(biāo)象限停留時(shí)間、穿過(guò)原目標(biāo)平臺(tái)位置的次數(shù)（即穿臺(tái)次數(shù)）。

1.3.3.2 工作記憶檢測(cè) 隨機(jī)將訓(xùn)練平臺(tái)放于空間探索實(shí)驗(yàn)所在平臺(tái)以外的任一個(gè)象限，大鼠入水后如60 s內(nèi)爬上該平臺(tái)并停留15 s，如沒(méi)有找到該平臺(tái)，可將其引導(dǎo)到平臺(tái)停留15 s，間隔30 s 后從同一入水點(diǎn)入水，圖像采集系統(tǒng)記錄大鼠找到隱藏在水面下的平臺(tái)潛伏期。

1.4 免疫熒光實(shí)驗(yàn)

術(shù)后第3 天完成水迷宮檢測(cè)后，取一側(cè)海馬和前額皮層組織，另一側(cè)海馬組織，保存于-80℃冰箱。石蠟切片制作，抗原修復(fù)液修復(fù)后滴加小膠質(zhì)細(xì)胞激活狀態(tài)離子鈣接頭蛋白分子1（Iba1）（1∶100，美國(guó)Abcam 公司） 切片孵育，4℃冰箱過(guò)夜，PBS 漂洗3 次，每次5 min，二抗anti-rat FITC（1:200）室溫孵育2 h，PBS漂洗5 min，共3 次，切片經(jīng)顯色，復(fù)染，脫水，二甲苯透明，封片后采用共聚焦熒光顯像系統(tǒng)（日本Olympus）觀察并采集，每只大鼠切片隨機(jī)取3 張（取5 個(gè)視野的平均值），Image pro-plus 6.0 圖像軟件分析，200倍鏡檢計(jì)數(shù)小膠質(zhì)細(xì)胞陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量。

1.5 細(xì)胞凋亡蛋白及活化型caspase3、COX-2 蛋白表達(dá)及前列腺素E2 含量測(cè)定

蛋白濃度測(cè)定采用二喹琳甲酸法。蛋白樣本（50 μg） 在10% SDS-PAGE 膠上經(jīng)電泳分離后轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上，脫脂奶粉（5%）室溫封閉2 h，分別用兔抗鼠COX-2、細(xì)胞凋亡蛋白caspase3、活化型caspase3（cleaved-caspase3）（1∶1000 倍稀釋，美國(guó)Sigma 公司）一抗孵育，4℃搖床過(guò)夜，TBST 漂洗3 次，辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的二抗孵育（1∶3000），室溫?fù)u床孵育1 h，洗膜3 次，ECL 顯影劑顯影并用Gel-pro analyzer 4.0 版軟件分析灰度光密度值。前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）含量的測(cè)定，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作步驟。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用GraphPad Prism 5.0 軟件系統(tǒng)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用重復(fù)測(cè)量方差分析，組間比較采用2×2 ANOVA 雙因素方差分析聯(lián)合Dunnett post hoc test 檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，以P＜0.01 為差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，以P＜0.001 為有極其顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 術(shù)后第3 天各組大鼠Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果的比較

定位航行訓(xùn)練結(jié)果顯示，空間探索實(shí)驗(yàn)中，各組間大鼠的游泳速度比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（表1，圖1）；術(shù)后第3 天，治療組大鼠在目標(biāo)象限停留時(shí)間長(zhǎng)于模型組，模型組大鼠在目標(biāo)象限停留時(shí)間短于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（表1，圖2）；術(shù)后第3 天，治療組大鼠在目標(biāo)象限穿臺(tái)次數(shù)多于模型組，模型組大鼠在目標(biāo)象限穿臺(tái)次數(shù)少于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（表1，圖3）；術(shù)后第3天，工作記憶測(cè)試實(shí)驗(yàn)中，治療組大鼠在登臺(tái)的潛伏期短于模型組，模型組大鼠在登臺(tái)的潛伏期長(zhǎng)于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（表1，圖4）。

表1 術(shù)后第3 天各組大鼠Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果的比較（±s）

表1 術(shù)后第3 天各組大鼠Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果的比較（±s）

與對(duì)照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05

對(duì)照組帕瑞昔布鈉組模型組治療組10 10 10 10 183.56±20.81 178.79±22.71 170.90±22.47 178.79±22.71 19.11±1.83 18.78±1.88 17.49±1.51a 19.06±1.45b 2.45±0.92 2.50±0.87 1.70±0.73a 2.45±0.82b 20.21±2.44 20.67±2.48 22.65±2.77a 20.51±2.50b組別 數(shù)目 游泳速度（mm/s）目標(biāo)象限停留時(shí)間（s）穿臺(tái)次數(shù)（次）登臺(tái)的潛伏期（s）

圖2 各組大鼠在Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)中目標(biāo)象限停留時(shí)間的比較

圖3 各組大鼠在Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)中穿臺(tái)次數(shù)的比較

圖4 各組大鼠在Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)中登臺(tái)潛伏期的比較

2.2 術(shù)后第3 天各組大鼠免疫熒光染色I(xiàn)ba1 蛋白標(biāo)記腦內(nèi)陽(yáng)性小膠質(zhì)細(xì)胞計(jì)數(shù)的比較

術(shù)后第3 天，模型組大鼠的海馬CA1 區(qū)和前額皮層區(qū)腦內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞Iab1 蛋白標(biāo)記陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)高于對(duì)照組，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）（表2，圖5～7），與對(duì)照組比較，模型組的小膠質(zhì)細(xì)胞狀態(tài)顯著激活。

圖5 術(shù)后第3 天各組大鼠海馬CA1 區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞Iba1 蛋白免疫熒光標(biāo)記圖（見(jiàn)內(nèi)文第30 頁(yè)）

術(shù)后第3 天，治療組大鼠的海馬CA1 區(qū)和前額皮層區(qū)腦內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞Iab1 蛋白標(biāo)記陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）[表2，圖5（封三），圖6（封四），圖7～8]，與模型組比較，治療組給藥顯著減弱手術(shù)誘發(fā)的老年大鼠術(shù)后小膠質(zhì)細(xì)胞激活狀態(tài)。

表2 術(shù)后第3 天各組大鼠免疫熒光染色I(xiàn)ba1 蛋白標(biāo)記腦內(nèi)陽(yáng)性小膠質(zhì)細(xì)胞計(jì)數(shù)的比較（個(gè)，±s）

表2 術(shù)后第3 天各組大鼠免疫熒光染色I(xiàn)ba1 蛋白標(biāo)記腦內(nèi)陽(yáng)性小膠質(zhì)細(xì)胞計(jì)數(shù)的比較（個(gè)，±s）

與對(duì)照組比較，aaP＜0.01，aaaP＜0.001；與模型組比較，bP＜0.05

對(duì)照組帕瑞昔布鈉組模型組治療組10 10 10 10 186.76±23.35 188.12±18.05 209.78±13.42aa 191.38±20.54b 125.51±17.61 129.85±17.22 164.09±19.91aaa 148.37±19.62b組別 數(shù)目 海馬CA1 區(qū)細(xì)胞 前額皮層區(qū)細(xì)胞

圖7 術(shù)后第3 天各組大鼠海馬CA1 區(qū)Iba1 蛋白標(biāo)記陽(yáng)性小膠質(zhì)細(xì)胞計(jì)數(shù)免疫熒光染色的比較

圖8 術(shù)后第3 天各組大鼠前額皮層區(qū)Iba1 蛋白標(biāo)記陽(yáng)性小膠質(zhì)細(xì)胞計(jì)數(shù)免疫熒光染色的比較

2.3 術(shù)后第3 天各組大鼠海馬CA1 區(qū)COX-2/β-actin、cleaved caspase-3/caspase-3 水平及PGE2 含量的比較

術(shù)后第3 天，模型組大鼠海馬CA1 區(qū)COX-2/βactin、cleaved caspase-3/caspase-3 水平及PGE2含量高于對(duì)照組，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）（表3，圖9～13）。

表3 術(shù)后第3 天各組大鼠海馬CA1 區(qū)COX-2/β-actin、cleaved caspase-3/caspase-3 水平及PGE2 含量的比較（±s）

與對(duì)照組比較，aaP＜0.01，aaaP＜0.001；與模型組比較，bP＜0.05

對(duì)照組帕瑞昔布鈉組模型組治療組10 10 10 10 0.98±0.19 0.91±0.17 1.29±0.15aa 1.06±0.13b 0.13±0.06 0.12±0.05 0.19±0.06aaa 0.14±0.03b 228.68±51.48 233.35±55.21 297.58±64.47aa 248.17±40.60b組別 數(shù)目 COX-2/β-actin cleaved-caspase3/caspase3 PGE2（pg/ml）

術(shù)后第3 天，治療組大鼠海馬CA1 區(qū)COX-2/βactin、cleaved caspase-3/caspase-3 水平及PGE2含量低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（表2，圖9～13），與模型組比較，治療組明顯改善手術(shù)創(chuàng)傷觸發(fā)的術(shù)后第3 天大鼠海馬CA1 區(qū)COX-2 蛋白水平高表達(dá)、其產(chǎn)物PGE2含量的增加及cleaved-caspase3/caspase3蛋白表達(dá)量比值的增高。

圖9 術(shù)后第3 天各組大鼠海馬CA1 區(qū)COX-2 蛋白及相應(yīng)內(nèi)參蛋白條帶

圖10 術(shù)后第3 天各組大鼠海馬CA1 區(qū)COX-2/β-actin 比值變化的比較

圖11 術(shù)后第3 天各組大鼠海馬CA1 區(qū)PGE2 含量變化的比較

圖12 術(shù)后第3 天各組大鼠海馬CA1 區(qū)cleaved-caspase3、caspase3 蛋白條帶及相應(yīng)內(nèi)參蛋白條帶

圖13 術(shù)后第3 天各組大鼠海馬CA1 區(qū)cleaved-caspase3/caspase3 比值變化的比較

3 討論

與海馬功能密切相關(guān)的Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)是評(píng)價(jià)嚙齒類動(dòng)物空間學(xué)習(xí)記憶能力的經(jīng)典實(shí)驗(yàn)[6]，其觀察指標(biāo)是動(dòng)物發(fā)現(xiàn)隱匿平臺(tái)的時(shí)間（即潛伏期）和空間探索實(shí)驗(yàn)時(shí)的穿臺(tái)次數(shù)和目標(biāo)象限停留時(shí)間。本研究結(jié)果顯示，術(shù)后第3 天，模型組大鼠在工作記憶測(cè)試實(shí)驗(yàn)中登臺(tái)的潛伏期長(zhǎng)于對(duì)照組，在目標(biāo)象限停留時(shí)間短于對(duì)照組，在目標(biāo)象限穿臺(tái)次數(shù)少于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），提示手術(shù)創(chuàng)傷誘導(dǎo)大鼠術(shù)后學(xué)習(xí)記憶能力減弱，認(rèn)知功能下降。有研究證實(shí)，在術(shù)后3 天老年大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力下降，逐漸恢復(fù)[7]，An 等[8]也發(fā)現(xiàn)了同樣的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。本研究結(jié)果與以上研究[7-8]發(fā)現(xiàn)一致，且本研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果恰好說(shuō)明了POCD 是可逆的。本研究結(jié)果還顯示，術(shù)后第3天，治療組大鼠在目標(biāo)象限停留時(shí)間長(zhǎng)于模型組，在目標(biāo)象限穿臺(tái)次數(shù)多于模型組，在工作記憶測(cè)試實(shí)驗(yàn)中登臺(tái)的潛伏期短于模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），提示帕瑞昔布鈉可改善大鼠的學(xué)習(xí)記憶功能。本研究結(jié)果顯示，空間探索實(shí)驗(yàn)中，各組間大鼠的游泳速度比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），說(shuō)明大鼠自身活動(dòng)能力及注射藥物等非相關(guān)因素未影響上述行為學(xué)測(cè)試結(jié)果。

研究表明，POCD 的發(fā)生發(fā)展過(guò)程與中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應(yīng)關(guān)系密切，手術(shù)應(yīng)激創(chuàng)傷引起的機(jī)體炎癥反應(yīng)是圍術(shù)期重要的病理生理學(xué)改變[9]。小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)主要的巨噬細(xì)胞，呈靜息狀態(tài)，病理狀態(tài)下被激活的小膠質(zhì)細(xì)胞釋放多種炎癥因子及氧自由基，啟動(dòng)凋亡反應(yīng)導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷。臨床上，帕瑞昔布鈉是一種選擇性COX-2 抑制劑，發(fā)揮抗炎與解熱鎮(zhèn)痛雙重作用[10]。文獻(xiàn)報(bào)道，COX-2 選擇性抑制劑在中樞神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)性疾病中發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[11-13]。美洛昔康降低AD 小鼠模型的腦內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)，改善記憶與認(rèn)知功能的下降[11]。同樣，美洛昔康抑制小鼠脾切除術(shù)后腦內(nèi)星型膠質(zhì)細(xì)胞的激活，改善學(xué)習(xí)記憶功能的降低[12]。腦缺血模型大鼠中，帕瑞昔布鈉能降低大鼠腦內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)程度及神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡，改善腦缺血后的腦損傷[13]。帕瑞昔布鈉還能降低老年人POCD 的發(fā)生率[14]。因此，本研究選取帕瑞昔布鈉為研究藥物，研究中帕瑞昔布鈉的使用劑量參考文獻(xiàn)[15]。

本研究結(jié)果顯示，術(shù)后第3 天模型組腦內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞被激活，Iab1 蛋白標(biāo)記小膠質(zhì)細(xì)胞陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)高于對(duì)照組，同時(shí)COX-2/β-actin、cleaved caspase-3/caspase-3 水平及PGE2含量高于對(duì)照組，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），說(shuō)明手術(shù)創(chuàng)傷導(dǎo)致短暫的老年大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)小膠質(zhì)細(xì)胞激活，引起炎癥因子釋放，降低動(dòng)物認(rèn)知功能。Wan 等[16]證實(shí)，大鼠術(shù)后中樞神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞顯著激活，炎癥介質(zhì)及凋亡因子水平明顯增加，導(dǎo)致大鼠認(rèn)知功能障礙，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似。本研究結(jié)果顯示，術(shù)后第3 天，治療組大鼠的海馬CA1 區(qū)和前額皮層區(qū)腦內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞Iab1 蛋白標(biāo)記陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；術(shù)后第3 天，治療組大鼠海馬CA1 區(qū)COX-2/β-actin及PGE2含量低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），提示帕瑞昔布鈉抑制手術(shù)創(chuàng)傷誘發(fā)的小膠質(zhì)細(xì)胞激活及COX-2、PGE2等炎癥因子的釋放。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果與前期評(píng)價(jià)認(rèn)知功能的行為學(xué)檢測(cè)結(jié)果是一致的，即模型組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的降低伴隨著大鼠腦內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞的激活，炎癥介質(zhì)釋放與凋亡反應(yīng)啟動(dòng)，而治療組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的改善與小膠質(zhì)細(xì)胞的免疫反應(yīng)激活程度減輕、炎癥介質(zhì)釋放減少與減弱凋亡反應(yīng)有關(guān)。

認(rèn)知損傷的過(guò)程與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)[17]。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠cleaved caspase-3/caspase-3水平高于對(duì)照組，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；治療組大鼠cleaved caspase-3/caspase-3 水平低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。分析推斷帕瑞昔布鈉的神經(jīng)保護(hù)效應(yīng)與抑制中樞炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡均有關(guān)。

綜上所述，手術(shù)創(chuàng)傷引起老年大鼠短暫性認(rèn)知功能下降，伴隨著小膠質(zhì)細(xì)胞激活，炎癥因子水平升高，細(xì)胞凋亡反應(yīng)啟動(dòng)。然而，帕瑞昔布鈉通過(guò)減弱海馬神經(jīng)組織炎癥反應(yīng)、凋亡等進(jìn)程而改善認(rèn)知功能。盡管確切的機(jī)制仍需進(jìn)一步探討，帕瑞昔布鈉可能為預(yù)防POCD 提供了新的方向。