劉林林 阿薩亞 劉建芳 陳 琳 劉 丹 謝宏波 劉名義 夏春華▲

1.南昌市洪都中醫(yī)院臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)，江西南昌 330038；2.南昌大學(xué)臨床藥理研究所，江西南昌 330031；3.江西省皮膚病?？漆t(yī)院藥劑科，江西南昌 330000

氨氯地平選擇性抑制鈣離子跨膜進(jìn)入心肌細(xì)胞或平滑肌細(xì)胞，有效降低血管收縮力，臨床廣泛用于治療高血壓和缺血性心臟病[1]。但氨氯地平的治療效果常具有明顯的個體差異[2]，藥物代謝酶的基因多態(tài)性常常被認(rèn)為是其重要影響因素之一。氨氯地平主要經(jīng)細(xì)胞色素P450 3A4（cytochrome P450 3A4，CYP3A4）酶進(jìn)行代謝[3]，它在不同個體中的表達(dá)水平以及酶活性也都顯示出明顯的種族異質(zhì)性和個體差異，極大地影響了治療結(jié)果[4-5]，常常導(dǎo)致治療失敗，甚至嚴(yán)重的藥物毒副作用。其本身的遺傳多態(tài)性是藥物代謝個體間差異的主要來源[6-8]。此外，孕烷X 受體（pregnane X receptor，PXR）的基因多態(tài)性也是導(dǎo)致CYP3A4 在不同人群中差異的重要因素之一[9-11]，而白介素-10（interleukin-10，IL-10）則有研究表明，在給予健康受試者IL-10 后，CYP3A4 的活性約降低12%[12]，表明CYP3A4 的基因多態(tài)性可直接影響或通過PXR 或IL-10 基因多態(tài)性改變CYP3A 酶系的活性，從而間接影響氨氯地平的藥代動力學(xué)過程。本研究旨在探討CYP3A4、PXR 和IL-10 基因多態(tài)性對43 名中國健康受試者空腹及餐后單次口服氨氯地平藥代動力學(xué)特征的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料

本臨床研究完成于2015年，并獲得醫(yī)學(xué)倫理委員會的批準(zhǔn){[2014]倫理審第（050）號}，所有受試者均在篩選前簽署知情同意書，共有43 名中國籍健康男性受試者入組此項研究，年齡18～40 歲，平均（23.1±1.6）歲；體重指數(shù)（body mass index，BMI）19～24 kg/m2，平均（21.4±1.7）kg/m2，所有受試者試驗(yàn)前經(jīng)一般體格檢查、詢問既往用藥史、實(shí)驗(yàn)室檢查（檢查項目包括血常規(guī)、尿常規(guī)、肝腎功能等）以及心電圖檢查，未發(fā)現(xiàn)異常，身體狀況良好，均無煙酒嗜好，在試驗(yàn)前2 周內(nèi)未服用過任何其他藥物。

1.2 方法

受試者按隨機(jī)數(shù)字表法分為空腹組和餐后組，分別在空腹?fàn)顟B(tài)和高脂高熱量飲食后30 min 單劑量交叉口服給予10 mg 苯磺酸氨氯地平片（北京天然藥物研究所平衡南洋制藥廠；生產(chǎn)批號：19-131104；規(guī)格：10 mg/片），分別于給藥前和給藥后2、4、5、6、7、8、10、12、24、48、72、96、120、144、168 h 共16 個時間點(diǎn)采集4.0 ml 上肢靜脈血，分離取上層血漿樣品放置于-80℃冰箱冷凍避光保存，兩試驗(yàn)周期之間設(shè)兩周的清洗期。血樣中氨氯地平的濃度通過液相二級質(zhì)譜（liquid chromatography tandem mass spectrometry，LCMS/MS）方法進(jìn)行測定。

1.3 基因分型

使用DNA 純化試劑盒（北京全式金）提取外周血基因組DNA，然后采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片段長度多態(tài)性（polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP）方法對CYP3A4（13989A>G、15820C>G、17776Ainsertion）、PXR（24381A>C、3'UTR10719G>A、3'UTR11193T>C）和IL-10（1082G>A、819C>T、592C>A）進(jìn)行基因分型。PCR 反應(yīng)體系共25 μl，包含2×Easy Taq＠PCR SuperMix 12.5 μl，正向引物（10 μmol/L）0.5 μl，反向引物（10 μmol/L）0.5 μl，ddH2O 6.5 μl，基因組DNA 5 μl。PCR 反應(yīng)程序設(shè)置如下：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性45 s，56℃退火45 s，72℃延伸45 s，共30 個循環(huán)，72℃延伸7 min，擴(kuò)增后的產(chǎn)物37℃消化2 h，PCR 最終產(chǎn)物用2%的瓊脂糖凝膠電泳條帶分析。

1.4 血漿中氨氯地平的檢測

1.4.1 色譜條件 色譜柱：Lunna-C18柱（50 mm×2.0 mm，5 μm）；流動相：2 mmol/L 甲酸銨（PH3.0）:乙腈=65∶35（v/v）；流速：400 L/min。

1.4.2 質(zhì)譜條件 離子化方式：電噴霧離子源（electron spray ionization，ESI+）；監(jiān)測方式：多重反應(yīng)監(jiān)測（multiple reaction monitoring，MRM）；霧化器壓力（Gas1）：40 psi；離子化電壓：5500 V；檢測離子：m/z 409.1→238.0（氨氯地平）以及m/z 480.2→315.0（內(nèi)標(biāo)物尼卡地平）。

1.4.3 血漿樣品處理方法 有機(jī)溶劑液液萃取法。取200 μl 待測血漿，精密加入20 μl 內(nèi)標(biāo)（1.0 ng/ml）和20 μl 空白溶劑，再加入20 μl 氫氧化鈉溶液（1 mol/L），以及1000 μl 叔丁基甲醚，渦旋振蕩3 min，15 000 r/min離心5 min，離心半徑8.2 cm，分層，取上層清液850 μl置于濃縮揮干儀中45℃減壓干燥約20 min，殘渣用200 μl 流動相進(jìn)行復(fù)溶，渦旋振蕩3 min，20 000 r/min離心5 min，離心半徑8.2 cm，取上層清液100 μl 進(jìn)行分析測定。血漿中的氨氯地平在0.05～16.2 ng/ml 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，檢測方法無明顯的基質(zhì)效應(yīng)，低、中、高濃度的提取回收率＞85%，批間、批內(nèi)精密度與準(zhǔn)確度均符合要求[13]。

1.5 藥物代謝動力學(xué)分析

本研究中血藥濃度數(shù)據(jù)用DAS 2.1 軟件以非房室模型對氨氯地平在體內(nèi)的藥動學(xué)參數(shù)進(jìn)行估算分析，藥動學(xué)參數(shù)主要包括峰濃度（cmax），達(dá)峰時間（Tmax），半衰期（t1/2）和藥時曲線下面積（area under the curve，AUC）。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 19.0 進(jìn)行χ2檢驗(yàn)判定各基因型頻率分布是否符合Hardy-Weinberg 遺傳平衡定律，計量數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析（ANOVA），兩組間比較采用t 檢驗(yàn)，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 受試者的一般資料

空腹組最終完成試驗(yàn)的男性健康受試者22 名，年齡21～24 歲，平均（22.0±0.8）歲；身高162～178 cm，平均（169.9±4.4）cm；體重52.0～75.0 kg，平均（61.8±6.9）kg；體重指數(shù)19.0～23.9 kg/m2，平均（21.4±1.8）kg/m2。餐后組入組健康男性受試者22 名，最終完成試驗(yàn)者有21 名，年齡22～28 歲，平均（24.0±1.5）歲；身高168～180 cm，平均（171.6±4.1）cm；體重51.1～74.3 kg，平均（63.0±5.8）kg；體重指數(shù)19.2～24.0 kg/m2，平均（21.4±1.7）kg/m2。兩組受試者的年齡、身高、體重和BMI 比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。

2.2 43 名受試者的CYP3A4、PXR 和IL-10 各突變位點(diǎn)基因分型結(jié)果

本研究通過PCR 方法對CYP3A4、PXR 和IL-10進(jìn)行基因分型，結(jié)果顯示CYP3A4 在17776 A insertion、15820C>G、13989A>G 位點(diǎn)的突變頻率分別為11.6%（5/43）、20.9%（9/43）、16.5%（7/43），PXR 在24381A>C、3'UTR11193T>C、3'UTR10719G>A 位點(diǎn)的突變頻率分別為27.9%（12/43）、25.5%（11/43）、18.6%（8/43），IL-10 在592C>A、819C>T、1082G>A 位點(diǎn)的突變頻率分別為18.6%（8/43）、23.2%（10/43）、11.6%（5/43）。對上述基因型進(jìn)行Hardy-Weinberg 遺傳平衡檢驗(yàn)，結(jié)果均顯示P＞0.05，基因型符合Hardy-Weinberg 遺傳平衡定律，具有群體代表性。

2.3 43 名受試者CYP3A4、PXR 和IL-10 各突變位點(diǎn)間的關(guān)聯(lián)性分析

通過對CYP3A4、PXR、IL-10 三個基因突變的相互影響的關(guān)聯(lián)性分析，結(jié)果顯示IL-10 突變與PXR突變呈明顯相關(guān)性，其他基因之間關(guān)聯(lián)性不大（表1），IL-10 突變引起PXR 突變的概率為71.4%，不引起PXR 突變的概率為28.6%。

表1 43 名受試者CYP3A4、PXR 和IL-10 各突變位點(diǎn)間的關(guān)聯(lián)性分析[n（%）]

2.4 兩組藥物代謝動力學(xué)參數(shù)的比較

CYP3A4、PXR 和IL-10 各基因突變位點(diǎn)對空腹及餐后口服氨氯地平的受試者體內(nèi)主要藥動學(xué)參數(shù)（AUC0-∞、AUC0-t、t1/2或cmax）均無顯著影響（P＞0.05）（表2）。空腹組和餐后組的氨氯地平藥動學(xué)參數(shù)差異結(jié)果顯示，餐后組的cmax、AUC0-t和AUC0-∞高于空腹組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（表3）。

表2 CYP3A4、PXR 和IL-10 各基因突變位點(diǎn)對口服氨氯地平的43名受試者體內(nèi)主要藥動學(xué)參數(shù)（AUC0-∞、AUC0-t、t1/2 或cmax）影響的方差分析結(jié)果

表3 空腹組和餐后組口服給予10 mg 氨氯地平后藥代動力學(xué)參數(shù)的比較（s）

表3 空腹組和餐后組口服給予10 mg 氨氯地平后藥代動力學(xué)參數(shù)的比較（s）

與空腹組比較，aP＜0.05

空腹組餐后組43.40±9.32 42.75±7.57 4.18±0.73 5.17±1.83a 6.18±1.84 7.71±4.36 212.09±40.53 291.20±92.02a 228.57±52.37 313.21±103.47a組別 t1/2（h）cmax（ng/ml）Tmax（h）AUC0-t（ng·h/ml）AUC0-∞（ng·h/ml）

3 討論

氨氯地平是臨床上常用的降壓藥之一，在體內(nèi)主要經(jīng)肝臟CYP3A4 酶系代謝，其療效在個體間存在顯著差異，可能與藥物代謝酶CYP3A4 的基因多態(tài)性有關(guān)。儲小曼等[14]發(fā)現(xiàn)CYP3A4*4、*5、*6 等位基因的存在可能降低藥物代謝酶CYP3A4 的活性，從而影響環(huán)孢素A 在體內(nèi)的代謝過程，CYP3A4*4、*5、*6 分別對應(yīng)13989A>G、15820C>G、17776 A insertion 三個突變位點(diǎn)。CYP3A4 受多種轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控，其中PXR 被認(rèn)為是最關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子，其基因多態(tài)性可能間接影響CYP3A4 的表達(dá)水平[11，15]。雖然在PXR 中發(fā)現(xiàn)了許多單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNPs），并且似乎影響PXR 功能，但是其對人類受試者中CYP3A4 表達(dá)的影響還未深入研究[10]。另一方面，IL-10 是一類抗炎細(xì)胞因子，影響基因轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)合成，也能參與調(diào)節(jié)CYP3A4 的酶活性[16]。研究發(fā)現(xiàn)，IL-10 存在的3 個SNPs，即1082G>A、819C>T和592C>A 可能與IL-10 表達(dá)降低相關(guān)[17]。因此，本研究探討CYP3A4-（Exon-917776A）、CYP3A4-（Exon7-15820C>G）、CYP3A4-（Exon5-13989A>G）；PXR-（Exon1-24381A>C）、PXR-（3'-UTR11193T>C）、PXR-（3'-UTR10719G>A）；IL-10-（592C>A），IL-10-（819C>T），IL-10-（1082G>A）9 個突變位點(diǎn)對氨氯地平藥代動力學(xué)特征的影響。

本研究結(jié)果顯示，三個CYP3A4 基因型、三個PXR 基因型和三個IL-10 基因型對氨氯地平在體內(nèi)的藥動學(xué)參數(shù)無明顯影響（P＞0.05）。Guo 等[18]研究基因多態(tài)性因素對高血壓患者氨氯地平藥代動力學(xué)過程的影響時發(fā)現(xiàn)CYP3A4*1G 和CYP3A5*3 的基因多態(tài)性對氨氯地平血藥濃度無影響（P>0.05），與本研究在健康受試者中所獲得的結(jié)果相一致。在CYP3A4 所發(fā)現(xiàn)的39 個突變位點(diǎn)中，絕大多數(shù)位點(diǎn)的突變不會改變酶的活性，僅有少數(shù)位點(diǎn)上的突變能影響酶的活性[1]。本研究中未能觀察到CYP3A4、IL-10 和PXR 的基因突變體對氨氯地平藥代動力學(xué)過程有明顯的作用，可能存在以下幾方面的原因：首先，本研究中選取突變位點(diǎn)對氨氯地平的藥代動力學(xué)影響輕微，PXR 或IL-10 上可能存在著其他調(diào)控作用比較明顯的SNPs；其次，藥物代謝過程受到一些其他因素如年齡、身體生理狀況等的影響；最后，除了基因方面的影響，PXR對內(nèi)源性、外源性物質(zhì)的接觸也會影響CYP3A4 的表達(dá)。因此，需要進(jìn)一步探討更多的影響因子，為臨床指導(dǎo)CYP3A4 代謝底物合理應(yīng)用提供可靠的理論基礎(chǔ)。

另外，本研究對43 名受試者的CYP3A4、PXR 和IL-10 各突變位點(diǎn)相關(guān)性進(jìn)行比較分析，結(jié)果顯示，IL-10 和PXR 突變頻率呈明顯相關(guān)性，IL-10 的突變顯著增加PXR 突變的頻率，提示IL-10 可能通過作用于PXR 來調(diào)控CYP3A4 的表達(dá)。但是PXR 和CYP3A4 之間的突變無明顯的相關(guān)性，可能是因?yàn)樗x取PXR 和CYP3A4 的突變位點(diǎn)之間僅僅是弱相關(guān)，或者是本研究受試者數(shù)量不足導(dǎo)致的。

本研究還探討飲食因素對氨氯地平體內(nèi)藥代動力學(xué)的影響，結(jié)果顯示，餐后組的cmax、AUC0-t和AUC0-∞高于空腹組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），提示高脂高熱量飲食可明顯增加口服途徑給予的氨氯地平的體內(nèi)血藥濃度及其暴露量。一般來說，食物容積、溫度以及食物中所含營養(yǎng)成分及其熱量均有可能改變胃腸道的內(nèi)環(huán)境，從而改變藥物在胃腸道停留的時間以及藥物在胃腸道液中的溶解度和滲透性，而高脂高熱量食物更能影響胃腸道的理化功能，從而更能改變藥物或制劑的生物利用度。飲食對氨氯地平血藥濃度的影響可能產(chǎn)生一些嚴(yán)重的后果，需要在臨床實(shí)踐使用過程中加以關(guān)注。

綜上所述，CYP3A4（17776 A insertion、15820C>G、13989A>G）、PXR（24381A>C、3'UTR11193T>C、3'UTR10719G>A）和IL-10（592C>A、819C>T、1082G>A）共9 個位點(diǎn)的突變體對43 名中國健康受試者體內(nèi)氨氯地平的藥代動力學(xué)過程無顯著影響，但飲食因素可能會明顯提高氨氯地平在人體內(nèi)的吸收。