秦翱翔 沈 力

湖北省荊州市松滋市中醫(yī)院腫瘤科，湖北荊州 434200

卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)中常見的惡性腫瘤，具有高度侵襲性，因其隱匿性，確診時多為晚期，患者5年存活率較低，其已成為嚴重威脅婦女生命的惡性疾病[1-2]。因此，積極尋找能夠有效預測患者預后的分子標記物具有重要的意義。多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶1（poly adenosine diphosphate ribose polymerase 1，PARP1）是DNA 損傷修復的關鍵酶，主要存在于細胞核，少量存在于細胞質中，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。過度的DNA 損傷及PARP1 表達，會造成細胞內(nèi)煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NAD）和腺苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）耗竭，進而使得凋亡誘導因子（apoptosisinducing factor，AIF）及核酸內(nèi)切酶G 從線粒體中釋放，進入細胞核，誘發(fā)非caspase3 途徑，最終導致細胞凋亡的發(fā)生[3-4]。細胞凋亡對于維持生物體正常發(fā)育起重要的作用，一旦凋亡調控機制發(fā)生紊亂，細胞惡變的潛能增高，最終可能轉化為腫瘤。AIF 是新發(fā)現(xiàn)的一種凋亡效應分子，既具有細胞凋亡活性又具有氧化還原酶活性，可以不依賴于caspase 途徑而行使細胞凋亡功能，在腫瘤細胞中呈現(xiàn)高表達，對細胞凋亡起促進作用[5-6]。目前，關于PARP1、AIF 在卵巢癌的研究未有報道，故本研究運用免疫組織化學方法檢測腫瘤組織中PARP1、AIF 表達情況，并分析其與卵巢癌患者各項病理參數(shù)及預后的關系，以期為卵巢癌診療及預后提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2015年6月至2017年6月于湖北省荊州市松滋市中醫(yī)院手術切除且經(jīng)病理證實的70 例卵巢癌組織標本及相應癌旁組織標本（距癌組織＞5 cm，經(jīng)HE 染色顯示無癌細胞浸潤），所有癌組織標本均經(jīng)病理證實為卵巢癌?；颊咂骄挲g（56.63±7.42）歲，＜60 歲28 例，≥60 歲42 例；臨床分期：Ⅰ期17 例，Ⅱ期22 例，Ⅲ期18 例，Ⅳ期13 例；腫瘤直徑：≤5 cm 27例，＞5 cm 43 例；組織學類型：漿液性37 例，其他33 例；分化程度：高分化14 例，中分化15 例，低分化41 例；有淋巴結轉移43 例，無淋巴結轉移27 例。

納入標準： ①患者在術前均未經(jīng)放化療或其他治療，且無手術禁忌；②患者經(jīng)病理診斷證實為卵巢癌[7]；③患者及其家屬對本研究知情同意，并簽訂協(xié)議書。排除標準：①患有肝病、高血壓、心臟病等疾病者；②資料不完整，無法進行術后隨訪者。另收集患者腫瘤直徑、組織學類型、臨床分期、分化程度及有無淋巴結轉移等臨床病理資料。本研究經(jīng)湖北省荊州市松滋市中醫(yī)院道德倫理委員會批準通過，符合《赫爾辛基宣言》。

1.2 主要試劑

SP 免疫組化試劑盒及DAB 顯色試劑盒，購自武漢博士德公司；山羊抗人AIF 多克隆抗體，購自Santa Cruz 公司；兔抗人PARP1 多克隆抗體，購自美國CST公司。

1.3 方法

1.3.1 免疫組織化學法檢測組織標本中PARP1、AIF蛋白表達 采用免疫組織化學法檢測各組織標本中PARP1、AIF 蛋白表達，具體操作如下。

①各組織標本經(jīng)固定、石蠟包埋后，石蠟切片機切片，厚度約4 μm。②展片，60℃烘烤1 h。③常規(guī)二甲苯脫蠟，無水乙醇、95%乙醇、85%乙醇、70%乙醇水化。④枸櫞酸鈉緩沖液煮沸18 min 進行抗原熱修復。⑤滴加3%過氧化氫于室溫孵育10 min，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶。⑥磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer，PBS）沖洗3 min×3 次，滴加1%牛血清白蛋白，孵育30 min 封閉非特異性結合位點。⑦而后吸棄封閉液（陰性對照除外），分別滴加山羊抗人AIF 多克隆抗體、兔抗人PARP1 多克隆抗體，置于4℃冰箱過夜。⑧取出切片，PBS 沖洗5 min×3 次，加入生物素標記的二抗，室溫孵育40 min。⑨PBS 沖洗切片5 min×3次，DAB 顯色，10%蘇木精復染。⑩70%乙醇、85%乙醇、95%乙醇、無水乙醇梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，于光學顯微鏡下觀察染色情況并拍照。

1.3.2 結果判定 由三名病理醫(yī)生對每張染色片進行評分取均值，以細胞漿或細胞膜呈棕黃色顆粒為陽性顯色。根據(jù)染色強度和陽性細胞百分比來進行評分。

①細胞染色強度評分標準：0 分（無染色），1 分（淺黃色），2 分（棕黃色），3 分（棕褐色）。②陽性細胞百分比評分標準： 陽性細胞數(shù)＜10%，記0 分；10%～25%，記1 分；26%～50%，記2 分；51%～80%，記3 分；＞80%，記4 分。染色指數(shù)（staining index，SI），即染色強度與陽性細胞百分比評分乘積。SI＜3 分，陰性（-）；SI=3 分，弱陽性（+）；3 分＜SI＜6 分，中等陽性（++）；SI≥6 分，強陽性（+++）。其中陰性和弱陽性表示低表達，中等陽性和強陽性表示高表達。

1.3.3 隨訪 所有患者均有完整的隨訪資料，隨訪時間36 個月，死亡患者以死亡時間作為隨訪截止日期，無病生存期（disease-free survival，DFS）的計算為從手術日期至疾病復發(fā)或因疾病進展導致患者死亡的時間。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 19.0 統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，采用t 檢驗；計數(shù)資料以[n（%）]表示，采用χ2檢驗；采用Spearman 分析卵巢癌組織中PARP1 與AIF 表達相關性采用Kaplan-Meier 法繪制生存曲線，行Log-rank 檢驗； 采用Cox比例風險模型分析影響卵巢癌患者預后的危險因素，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 卵巢癌組織和癌旁組織中PARP1、AIF 表達情況的比較

卵巢癌組織中PARP1、AIF 陽性表達率分別為72.86%（51/70）和70.00%（49/70），均高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（表1）。

表1 卵巢癌組織和癌旁組織中PARP1、AIF 表達情況的比較[n（%）]

2.2 卵巢癌組織中PARP1、AIF 表達與患者臨床病理指標的關系

PARP1、AIF 在卵巢癌組織中的表達與患者年齡、腫瘤直徑、組織學類型無相關性（P＞0.05）。PARP1、AIF 高表達患者臨床分期Ⅲ～Ⅳ期、 低分化及有淋巴結轉移比例均高于低表達患者，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（表2）。

表2 卵巢癌組織中PARP1、AIF 表達與患者臨床病理指標的關系[n（%）]

2.3 卵巢癌組織中PARP1 與AIF 表達的相關性

卵巢癌組織中PARP1 與AIF 表達呈正相關（r=0.791，P＜0.05）（表3）。

表3 卵巢癌組織中PARP1 與AIF 表達的相關性（n）

2.4 卵巢癌組織中PARP1、AIF 表達與患者術后DFS 的關系

PARP1 高表達卵巢癌患者中位DFS 為6.78 個月，短于PARP1 低表達患者的23.32 個月，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（圖1）。AIF 高表達卵巢癌患者中位DFS 為7.80 個月，短于AIF 低表達患者的28.00 個月，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（圖2）。

圖1 卵巢癌組織中PARP1 表達與患者術后DFS 的關系

圖2 卵巢癌組織中AIF 表達與患者術后DFS 的關系

2.5 影響卵巢癌患者預后的危險因素

單因素分析顯示，PARP1、AIF、臨床分期、分化程度及有無淋巴結轉移均是影響卵巢癌患者預后的危險因素（P＜0.05）。多因素Cox 分析顯示，臨床分期、分化程度、有無淋巴結轉移、PARP1 及AIF 均是影響卵巢癌患者預后的獨立危險因素（P＜0.05）（表4）。

表4 影響卵巢癌患者預后的危險因素

3 討論

手術切除病灶是目前卵巢癌的主要治療手段，輔以放化療或放療，但治療效果有限[8-9]。因此尋找具有診斷、 預后預測潛力的標志物及新治療靶點成為現(xiàn)階段的研究熱點。PARP1 是具有多聚二磷腺苷酸核糖基催化活性的蛋白酶，存在于多數(shù)真核細胞內(nèi)，在DNA 損傷修復、細胞周期、基因組穩(wěn)定和細胞死亡等方面均發(fā)揮重要作用[10-12]。PARP1 在卵巢癌中的呈現(xiàn)高表達，能促進卵巢癌的生長及淋巴結轉移[13-14]。本研究結果顯示，卵巢癌組織中PARP1 陽性表達率高于癌旁組織，PARP1 高表達患者臨床分期Ⅲ～Ⅳ期、低分化及有淋巴結轉移比例均高于低表達患者（P＜0.05），與張燦燦等[14]研究相似，提示PARP1 在卵巢癌組織中存在異常高表達，可能參與卵巢癌的發(fā)生及發(fā)展。

細胞凋亡是一系列酶參與的生化反應，在維持正常細胞更新和異常細胞清除平衡中起著重要作用，受許多凋亡相關因子的影響[6，15]。AIF 是具有促凋亡活性的蛋白，又具有氧化還原酶活性，在腫瘤細胞中呈現(xiàn)高表達，對細胞凋亡起促進作用[5，16]。陳吉等[17]研究報道，胃黏膜組織中AIF mRNA 高表達與胃癌形成有一定關聯(lián)，可作為早期評估胃癌的臨床指標。本研究結果顯示，卵巢癌組織中AIF 陽性表達率高于癌旁組織，AIF 高表達患者臨床分期Ⅲ～Ⅳ期、 低分化及有淋巴結轉移比例均高于低表達患者（P＜0.05），與陳吉等[17]研究結果相似，提示AIF 能夠為腫瘤細胞生長活動提供能量，促進腫瘤細胞增殖、生長，提示AIF 在卵巢癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮一定作用。

DFS 是在根治性手術后作為輔助化療時最常用的終點指標，本研究Kapalan-Meier 生存曲線分析結果顯示，PARP1 和AIF 高表達卵巢癌患者中位DFS均短于低表達患者（P＜0.05），表明PARP1 和AIF 可能作為卵巢癌的預后指標，其高表達提示患者預后較差。進一步采用Cox 模型分析結果顯示，臨床分期、分化程度、有無淋巴結轉移、PARP1 及AIF 均是影響卵巢癌患者預后的危險因素（P＜0.05），而PARP1、AIF、臨床分期及分化程度是影響卵巢癌患者預后的獨立危險因素（P＜0.05），提示PARP1 和AIF 可能作為判斷卵巢癌患者預后的參照指標。同時需關注卵巢癌的臨床分期、分化程度對患者預后的影響。此外，本研究結果顯示卵巢癌組織中PARP1 與AIF 表達呈正相關（P＜0.05），由此也提示PARP1、AIF 在卵巢癌發(fā)生發(fā)展中可能協(xié)同發(fā)揮作用進而影響腫瘤細胞生物學過程，但具體機制尚需深入探究[15-16]。

綜上所述，PARP1、AIF 在卵巢癌組織中陽性表達率高于癌旁組織，其與卵巢癌患者臨床分期、分化程度、有無淋巴結轉移及DFS 相關，可能作為評定卵巢癌患者預后的臨床參考指標。但由于目前研究的局限性，PARP1、AIF 參與卵巢癌發(fā)生發(fā)展的具體作用機制有待進一步研究。