孫鈺婧 霍志鵬 王 玉 李瑞明 秦民堅 何 毅▲

1.天士力控股集團有限公司 天士力研究院/創(chuàng)新中藥關(guān)鍵技術(shù)國家級重點實驗室，天津 300410；2.中國藥科大學中藥學院，江蘇南京 210009

潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）是一種結(jié)腸和直腸慢性非特異性炎性腸病，以結(jié)腸黏膜連續(xù)性、彌漫性炎癥為主要特點，病程漫長，以血性腹瀉、腹痛等為主要臨床表現(xiàn)，長期嚴重可并發(fā)消化道穿孔和結(jié)腸癌[1]，嚴重影響了患者的生活質(zhì)量和心理狀況，目前認為UC 的發(fā)生以遺傳因素為基礎(chǔ)，在心理及環(huán)境因素的持續(xù)誘發(fā)下，腸道黏膜屏障受損，腸內(nèi)菌群失調(diào)，導(dǎo)致免疫功能紊亂[2]，但具體病因尚不十分明確。臨床上，西醫(yī)治療以口服氨基水楊酸類藥物、糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑等為主，配合全身支持治療，重癥患者考慮手術(shù)治療[3-4]；中醫(yī)治療?？诜?fù)方中藥或有效成分，采用中藥灌腸、針灸等不同形式的療法[3]，多層次綜合作用于患者及患處。結(jié)腸炎奇效顆粒是課題組開發(fā)的中藥六類新藥，由骨碎補、生車前子等6 味中藥組成，具有溫腎暖脾、化瘀導(dǎo)滯之功效，用于慢性非特異性UC 的治療[5]，目前處于Ⅱ期臨床階段。前期研究表明，結(jié)腸炎奇效顆粒能夠明顯減輕冰醋酸、葡聚糖硫酸鈉和三硝基苯磺酸所致的UC 小鼠、大鼠結(jié)腸炎癥和潰瘍病變程度[6]，但結(jié)腸炎奇效顆粒的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機制尚不明確。

研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學和生物信息學方法，通過構(gòu)建“藥物-疾病-靶點”網(wǎng)絡(luò)從整體角度分析結(jié)腸炎奇效顆粒治療UC 的作用機制，預(yù)測該方治療UC 的關(guān)鍵靶基因，并對其進行生物功能和代謝通路分析，旨在初步認識該方治療UC 的作用機制，為進一步的實驗驗證提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 活性成分的篩選

在中藥系統(tǒng)藥理學分析平臺（pharmacology analysis platform of traditional Chinese medicine system，TCMSP）數(shù)據(jù)庫、化學專業(yè)數(shù)據(jù)庫及參考文獻中搜集各藥材化學成分，結(jié)合前期質(zhì)譜鑒定結(jié)果，初步獲取化學成分，并在TCMSP 和SwissADME 數(shù)據(jù)庫中篩選出口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%且類藥性（drug-like，DL）≥0.18 的化學成分作為潛在活性成分。

1.2 活性成分靶點預(yù)測

將活性成分導(dǎo)入TCMSP 和化學專業(yè)數(shù)據(jù)庫中查詢作用靶點，利用Uniprot 數(shù)據(jù)庫將靶點名稱校正為官方名稱（Official Symbol），校正后導(dǎo)入STRING 進行蛋白相互作用（protein-protein interaction，PPI）分析，去除無相互作用靶點，借助Cytoscape（version 3.7.1）構(gòu)建結(jié)腸炎奇效顆粒活性成分-靶點PPI 網(wǎng)絡(luò)。

1.3 UC 疾病靶點預(yù)測

將關(guān)鍵詞“Ulcerative Colitis”輸入DiGSeE 和Gene Cards 收集疾病靶點，使用Draw Venn Diagram 在線工具繪制韋恩圖篩選共有靶點作為疾病靶點。將活性成分靶點信息和疾病靶點導(dǎo)入在線工具中預(yù)測“藥物-疾病”交集靶標，利用STRING 數(shù)據(jù)庫繪制交集靶標PPI圖。

1.4“藥物-疾病-靶點”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

依據(jù)活性成分靶點和“藥物-疾病”交集靶標，使用Cytoscape 分別構(gòu)建“中藥-藥材-活性成分”網(wǎng)絡(luò)和“活性成分-交集靶標-疾病”網(wǎng)絡(luò)，使用merge 功能合并兩個網(wǎng)絡(luò)以構(gòu)建“藥物-疾病-靶點”PPI 網(wǎng)絡(luò)。

1.5 核心靶點的篩選

將“藥物-疾病” 交集靶標導(dǎo)入STRING 中進行PPI 分析，再利用Cytoscape 以大于Degree 中位數(shù)為標準篩選核心靶點。

1.6 GO 生物功能和KEGG 代謝通路富集分析

通過DAVID 數(shù)據(jù)庫對核心靶點進行GO 功能富集分析和KEGG 代謝通路富集分析，以FDR＜0.01 作為顯著富集標準，篩選得富集結(jié)果，再通過R 軟件（R×64 3.6.3）對富集結(jié)果進行可視化處理。

2 結(jié)果

2.1 活性成分及作用靶點的篩選

結(jié)合TCMSP 數(shù)據(jù)庫、參考文獻及前期質(zhì)譜鑒定結(jié)果，共獲得化學成分102 個。TCMSP 和SwissADME數(shù)據(jù)庫中活性成分篩選結(jié)果顯示，同時滿足OB≥30%和DL≥0.18 或符合Lipinski 規(guī)則的化學成分共12個，見表1，包括骨碎補成分3 個，車前子成分3 個，山楂成分8 個以及訶子肉成分6 個。

表1 結(jié)腸炎奇效顆粒的12 個活性成分

利用Uniprot 數(shù)據(jù)庫進行靶點校正、 去重后，共獲得靶點269 個，將其導(dǎo)入STRING 進行PPI 分析，結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape 軟件中構(gòu)建化合物-靶點PPI 網(wǎng)絡(luò)見圖1（封三），藍色節(jié)點代表靶點，綠色節(jié)點代表活性成分。

圖1 結(jié)腸炎奇效顆粒的活性成分-靶點PPI 圖

2.2 疾病靶點及“藥物-疾病”交集靶標預(yù)測

在DiGSeE 數(shù)據(jù)庫和GeneCards 數(shù)據(jù)庫中分別得到“Ulcerative Colitis”相關(guān)靶點1322 和4356 個，通過繪制韋恩圖篩選疾病靶點413 個?！八幬?疾病”交集靶標預(yù)測過程中，共篩選交集靶標64 個，見圖2。

圖2 藥物-疾病交集靶標預(yù)測

圖3（封三）為STRING 數(shù)據(jù)庫繪制的交集靶標PPI 圖，該網(wǎng)絡(luò)由64 個節(jié)點、893 條邊組成，網(wǎng)絡(luò)密度為0.744，平均節(jié)點度為27.9。

圖3 藥物-疾病交集靶標PPI 圖

2.3“藥物-疾病-靶點”PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將交集靶標和活性成分導(dǎo)入Cytoscape 軟件中構(gòu)建“藥物-疾病-靶點”PPI 網(wǎng)絡(luò)，由12 個活性成分，64個交集靶標，82 個節(jié)點，252 條邊組成的“藥物-疾病-靶點”PPI 網(wǎng)絡(luò)，見圖4（封四）。

2.4 核心靶點篩選

64 個“藥物-疾病”交集靶標導(dǎo)入STRING 數(shù)據(jù)庫后，PPI 分析結(jié)果顯示，交集靶點均具有相互作用，將結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape 軟件中，以Degree 值的中位數(shù)27.5 為標準，篩選核心靶點共32 個，見圖5（封四）。Degree 值越大，圖中靶點的直徑越大。

2.5 GO 功能富集分析

通過DAVID 數(shù)據(jù)庫對核心靶點進行GO 功能富集分析，從生物過程（biological process，BP）、分子功能（molecular function，MF）和細胞組成（cellular component，CC）3 個方面闡述核心靶點的生物學作用，共獲得32 個功能富集（FDR＜0.01），包含25 個顯著富集的生物過程，主要涉及一氧化氮生物合成過程的正調(diào)控（positive regulation of nitric oxide biosynthetic process）、蛋白質(zhì)磷酸化的正調(diào)控（positive regulation of protein phosphorylation）等；3 個顯著富集的分子功能：細胞因子活性（cytokine activity）、酶結(jié)合（enzyme binding） 以及相同的蛋白質(zhì)結(jié)合 （identical protein binding）過程；4 個顯著富集的細胞組成，包括胞外區(qū)空間（extracellular space）、細胞外區(qū)域（extracellular region）、陷窩（caveola）以及質(zhì)膜的外側(cè)（external side of plasma membrane）。GO 富集功能分析結(jié)果見圖6（封四）。

2.6 KEGG 通路富集分析

將核心靶點導(dǎo)入DAVID 數(shù)據(jù)庫中進行KEGG 通路富集分析，發(fā)現(xiàn)核心靶點主要富集于癌癥途徑（pathways in cancer）、HIF-1 信號通路（HIF-1 signaling pathway）、腫瘤壞死因子信號通路（TNF signaling pathway）等32 條通路中（FDR＜0.01），提示這些通路可能是結(jié)腸炎奇效顆粒治療UC 的重要機制。利用R軟件繪制KEGG 富集通路氣泡圖，見圖7（封四）。氣泡大小代表基因數(shù)目，顏色越深，F(xiàn)DR 值越小。

3 討論

“藥物-疾病-靶點”網(wǎng)絡(luò)中槲皮素（Degree 值=53）、柚皮苷（Degree 值=14）和沒食子酸（Degree 值=10）與疾病靶標相關(guān)度最高，提示其可能是全方治療UC 的主要活性成分。據(jù)文獻報道，車前子和山楂成分槲皮素具有良好的抗炎、抗氧化、抗菌、抗癌效果[7]；沒食子酸可以調(diào)節(jié)葡聚糖硫酸鈉所致UC 小鼠的白細胞介素-21、白細胞介素-23 等炎癥細胞因子的表達[8]；柚皮苷作為骨碎補總黃酮的主要成分，能夠減輕炎癥反應(yīng)，改善微循環(huán)，加速細胞增殖[9]，同時還能促進一些藥物在人體內(nèi)的代謝吸收[10]，提示結(jié)腸炎奇效顆粒對UC 的治療作用是多種成分共同作用的結(jié)果，體現(xiàn)了中藥配伍優(yōu)勢。

核心靶點篩選結(jié)果發(fā)現(xiàn)，白細胞介素-6（Degree值=59）和腫瘤壞死因子（Degree 值=54）是核心靶點網(wǎng)絡(luò)的樞紐，由二者表達的細胞因子白細胞介素-6 和腫瘤壞死因子-α 在炎癥反應(yīng)、細胞免疫、腫瘤免疫等多種生理病理過程中發(fā)揮十分關(guān)鍵的作用[11-12]，提示結(jié)腸炎奇效顆?？赡芡ㄟ^調(diào)節(jié)二者介導(dǎo)的多種炎癥和免疫途徑發(fā)揮治療作用。

GO 功能富集分析結(jié)果顯示，結(jié)腸炎奇效顆粒參與炎癥反應(yīng)、血管生成、平滑肌細胞增殖的正調(diào)控、寄主共生體生長的負調(diào)控、趨化因子生物合成過程的正調(diào)控、NO 生物合成過程的正調(diào)控等生物過程，可能通過上調(diào)NO 水平，激活鳥苷酸環(huán)化酶（guanylate cyclase，GC）使環(huán)鳥苷酸（cyclic guanosine monophosphate，c-GMP）增加，抑制表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）信號通路[13]，正調(diào)控平滑肌細胞的增殖和新血管的生成以修復(fù)結(jié)腸受損部位；促進趨化因子合成，招募并活化T、B 細胞以清除病原體[14]；同時調(diào)節(jié)腸道菌群，來達到減輕腸道炎癥和潰瘍程度的目的，且其調(diào)控過程多發(fā)生在extracellular space中。

KEGG 通路富集分析結(jié)果顯示，結(jié)腸炎奇效顆?？赡芡ㄟ^調(diào)節(jié)腫瘤壞死因子通路、NOD 樣受體通路、Toll 樣受體通路、FoxO 通路、PI3K-Akt 通路、HIF-1通路、NF-κB 通路、T 細胞受體通路等信號通路來發(fā)揮藥效。其中腫瘤壞死因子信號通路通過腫瘤壞死因子-α 和腫瘤壞死因子-β 兩細胞因子作用于腫瘤壞死因子R1 和腫瘤壞死因子R2 受體來激活NF-κB 和MAPK 通路[15]；NOD 樣受體（NOD-like receptors，Nods）作為先天免疫系統(tǒng)受體，識別胞內(nèi)的病原體相關(guān)分子模式（pathogen-associated molecular patterns，PAMPs），驅(qū)動NF-κB 和MAPK 通路的激活[16]；Toll 樣受體（Tolllike receptors，TLRs）作為另一種重要的先天免疫反應(yīng)受體，同樣識別PAMPs 以激活NF-κB 和MAPK 通路，但與Nods 不同的是，TLRs 通過髓樣分化蛋白抗原（myeloid differential protein-88，MyD88）依賴性和MyD88 非依賴性兩條信號通路將其激活[17-18]；PI3KAkt 通路也可激活NF-κB 通路和MAPK 通路等炎癥通路[19]。可見，NF-κB 和MAPK 兩條通路是各通路的潛在中心。NF-κB 在炎癥反應(yīng)過程中起到關(guān)鍵的調(diào)控作用，能促進白細胞介素-1β、白細胞介素-6 等炎癥因子的表達[20]；活化p38 MAPK 信號通路可以上調(diào)細胞因子Gro-α、白細胞介素-8 的表達，促進克羅恩病（Crohn′s disease，CD）腸道炎癥的形成[21]；藥理實驗也顯示，結(jié)腸炎奇效顆粒三個劑量組均能顯著降低葡聚糖硫酸鈉（dextran sulfate sodium，DSS）誘導(dǎo)的UC 大鼠血漿中的腫瘤壞死因子-α、白細胞介素-6、白細胞介素-8、NF-κB p65 和細胞黏附分子-1 的含量（P＜0.01）[6，22]。因此推測，結(jié)腸炎奇效顆?？赡芡ㄟ^直接或間接地阻斷NF-κB 和MAPK 兩條通路，調(diào)控下游白細胞介素-6、腫瘤壞死因子等細胞因子的合成，起到抗炎、促進腸道蠕動、平衡腸道內(nèi)環(huán)境，修復(fù)粘膜損傷等作用。另外，KEGG 富集結(jié)果中存在多條與腸道炎癥和癌癥相關(guān)的通路，如炎癥性腸?。╥nflammatory bowel disease，IBD）、 阿米巴病、FoxO 通路、HIF-1 通路、 癌癥途徑等。據(jù)報道，UC 是結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CAC）的一個重要病因，由UC 引起的CAC 占所有結(jié)直腸癌的1%～2%[23]，UC 癌變總體發(fā)生率為3.7%，且其炎-癌轉(zhuǎn)化率隨著UC 病程的延長逐年增加，UC 發(fā)病30年后，CAC 的發(fā)生率高達18.4%[24]。已有研究表明，激活FoxO 通路可降低FoxO3a 抑癌基因的表達[25]，激活HIF-1 通路可導(dǎo)致致癌因子的擴散[26]，從而加速癌細胞的轉(zhuǎn)移和侵襲，提示結(jié)腸炎奇效顆?？赡苡蓄A(yù)防UC 癌變的活性，其作用機制可能與阻斷FoxO、HIF-1 等通路，提高FoxO3a 抑癌基因的表達，減緩致癌因子的擴散有關(guān)，該活性和機制有待進一步驗證。