商浥，鄭茗源，房玉林，鞠延侖

（西北農(nóng)林科技大學(xué)葡萄酒學(xué)院，陜西楊凌 712100/合陽(yáng)葡萄試驗(yàn)示范站，陜西合陽(yáng) 715300）

葡萄酒的香氣是評(píng)價(jià)其品質(zhì)的重要指標(biāo)，香氣成分主要由醇類、酸類、酯類、醛類、芳香族化合物等揮發(fā)性物質(zhì)構(gòu)成，已鑒定出的相關(guān)化合物超過(guò)800種[1-2]。頂空固相微萃?。℉S-SPME）是應(yīng)用較為廣泛的香氣物質(zhì)提取技術(shù)，結(jié)合氣質(zhì)聯(lián)用（GC-MS）技術(shù)可以快速準(zhǔn)確的檢測(cè)葡萄酒中的揮發(fā)性成分[3]。與傳統(tǒng)提取方式相比，HS-SPME靈敏度更高，有效減少因樣品熱不穩(wěn)定性、化學(xué)性質(zhì)造成的測(cè)量誤差[4]。近年來(lái)，研究人員廣泛使用此方法定性定量分析葡萄酒中的揮發(fā)性物質(zhì)，楊洋等[5]從3個(gè)產(chǎn)地的‘赤霞珠’葡萄酒中檢出119種香氣物質(zhì)，Jiang等[6]分析了‘赤霞珠’和‘美樂(lè)’葡萄酒中共58種香氣成分，劉濤等[7]從賀蘭山東麓‘北紅’葡萄酒中檢出75種香氣物質(zhì)。萃取預(yù)處理會(huì)影響香氣成分檢出結(jié)果，由于樣品揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的差異，所用的萃取條件需要根據(jù)樣品進(jìn)行針對(duì)性的優(yōu)化，目前已有研究證明超聲處理可增加茶中香氣檢出成分[8]；離心處理能夠影響橙汁等飲品揮發(fā)性物質(zhì)檢出種類和含量[9]；樣品檢測(cè)中添加NaCl可以降低揮發(fā)性物質(zhì)在樣品中的溶解度，增加香氣檢出含量，可用于提取葡萄酒香氣物質(zhì)[10]；萃取溫度會(huì)對(duì)不同樣品香氣檢出成分產(chǎn)生影響。并有許多研究致力于萃取頭選擇、樣品預(yù)處理、進(jìn)樣體積等萃取條件的優(yōu)化[11-13]，但是針對(duì)‘媚麗’葡萄酒香氣提取條件的優(yōu)化研究較少。

‘媚麗’葡萄是西北農(nóng)林科技大學(xué)選育的紅葡萄品種，適于釀造果香濃郁的桃紅葡萄酒，已測(cè)定‘媚麗’葡萄酒中香氣成分超過(guò)55種[14-15]。本試驗(yàn)采用的HSSPME和GC-MS技術(shù)，根據(jù)已有檢測(cè)方法改良[16]，研究超聲時(shí)間、離心轉(zhuǎn)速、NaCl添加量、萃取溫度對(duì)揮發(fā)性成分釋放的影響，旨在優(yōu)化‘媚麗’葡萄酒香氣檢測(cè)方法，為‘媚麗’葡萄酒品質(zhì)評(píng)價(jià)提供理論依據(jù)，也為葡萄酒揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)檢測(cè)條件的優(yōu)化提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

‘媚麗’葡萄種植于西北農(nóng)林科技大學(xué)曹辛莊實(shí)驗(yàn)農(nóng)場(chǎng)，經(jīng)人工采收、分選、除梗破碎，添加釀酒酵母CECA，使用10 L玻璃罐釀造。酒精發(fā)酵啟動(dòng)后，酒比重降至1.01以下皮渣分離處理。比重下降至0.992、還原糖低于4 g/L時(shí)終止酒精發(fā)酵，封罐置于冷庫(kù)。低溫澄清2個(gè)月后，收集酒樣，于4 ℃低溫存儲(chǔ)。

試劑：氯化鈉（分析純）、2-辛醇（內(nèi)標(biāo)）等。

儀器：萃取頭（50/30 μm CAR/PDMS/DVB）、超聲波清洗儀、冷凍離心機(jī)、15 mL頂空萃取瓶、電子天平等。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 超聲處理對(duì)葡萄酒揮發(fā)性成分的影響

酒樣分為5組，分別水浴超聲0、10、20、30、40 min，水浴溫度20 ℃，超聲頻率40 KHz。取5 mL酒樣和1.0 g NaCl加入樣品瓶中，準(zhǔn)確加入10 μL內(nèi)標(biāo)物（0.1 g/L）。在40 ℃條件下萃取30 min，解析8 min，進(jìn)行GC-MS，每組2個(gè)重復(fù)。

1.2.2 離心處理對(duì)葡萄酒揮發(fā)性成分的影響

酒樣分為4組，1組不進(jìn)行離心處理，其余3組分別進(jìn)行3000、5000、7000 r/min離心處理5 min。取5 mL酒樣和1.0 g NaCl加入樣品瓶中，準(zhǔn)確加入10 μL內(nèi)標(biāo)物。萃取方法同1.2.1。

1.2.3 NaCl對(duì)葡萄酒揮發(fā)性成分的影響

酒樣分為5組，用電子天平準(zhǔn)確稱量NaCl，每組添加量為0.5、1、1.5、2、2.5 g，取5 mL酒樣加入樣品瓶，準(zhǔn)確加入10 μL內(nèi)標(biāo)物。萃取方法同1.2.1。

1.2.4 萃取溫度對(duì)葡萄酒揮發(fā)性成分影響

酒樣分為4組，取5 mL酒樣和1.0 g NaCl加入樣品瓶中，準(zhǔn)確加入10 μL內(nèi)標(biāo)物，分別在30、40、50、60 ℃下萃取并進(jìn)行GC-MS分析，每組2個(gè)重復(fù)。

1.2.5 GC-MS分析條件

分析設(shè)備：氣相質(zhì)譜聯(lián)用儀（日本島津公司 GCMS-QP2010 UItra）

色譜條件：DB-WAX毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm× 0.25 μm）；升溫程序：萃取溫度下穩(wěn)定5 min，然后6 ℃/min升到240 ℃，穩(wěn)定5 min；進(jìn)樣量：1 μL；分流比：10∶1；進(jìn)樣口溫度：280 ℃；載氣：He；流速：1 mL/min。

質(zhì)譜條件：EI電離源；電子能量：70 eV；離子源溫度：230 ℃；四極桿溫度：150 ℃；質(zhì)量掃描范圍: 50～350 amu。

1.3 數(shù)據(jù)分析

質(zhì)譜結(jié)果經(jīng)NIST譜庫(kù)自動(dòng)檢索定性分析，根據(jù)內(nèi)標(biāo)法定量計(jì)算香氣成分，采用SPSS 22.0數(shù)據(jù)分析，利用Duncan法進(jìn)行差異顯著性分析（P＜0.05），試驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。Excel和Origin軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 ‘媚麗’葡萄酒揮發(fā)性成分差異分析

2.1.1 超聲處理對(duì)葡萄酒揮發(fā)性成分的影響

如表1所示，超聲處理比未處理多檢出己醇、橙花醇、癸醛、3-甲基丁酸等物質(zhì)。但長(zhǎng)時(shí)間超聲處理對(duì)物質(zhì)的檢測(cè)產(chǎn)生負(fù)面影響，超聲后酒樣的丁醇、3-甲基戊醇、庚醇、乙醛、苯乙烯等含量顯著低于未經(jīng)超聲處理組。超聲40 min處理組乙酸己酯（35.85 μg/L）、3-甲基丁酸乙酯（2005.29 μg/L）、庚酸乙酯（13.13 μg/L）、乙酸辛酯（6.79 μg/L）、2-苯基乙酸乙酯（34.52 μg/L）等酯類含量較未超聲處理分別降低37.58%、19.59%、39.49%、35.46%、15.85%。30 min和40 min超聲處理導(dǎo)致辛酸甲酯、十六酸乙酯無(wú)法被檢測(cè)出。如圖1 A所示，40 min超聲處理組酒樣酯類檢出含量（5725.70 μg/L）比未超聲處理組（8686.61 μg/L）下降34.09%，醇類含量（3907.82 μg/L）比未經(jīng)超聲處理組（10 689.45 μg/L）下降63.44%，經(jīng)超聲處理后醇類物質(zhì)和酯類物質(zhì)總含量顯著下降。

表1 不同超聲時(shí)間對(duì)部分揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的影響Table 1 Effect of different ultrasonic time on the content of volatile compoundsμg/L

2.1.2 離心處理對(duì)葡萄酒揮發(fā)性成分的影響

如表2所示，離心處理組比未離心組多檢測(cè)出癸醇、己醇、3-甲基戊酸、1,2,4,5-四甲基苯等物質(zhì)。未離心組庚醇（25.19 μg/L）、乙酸辛酯（26.59 μg/L）、3-甲基辛酸丁酯（46.81 μg/L）、壬酸乙酯（11.97 μg/L）、十五酸乙酯（6.88 μg/L）、十八酸乙酯（8.00 μg/L）等物質(zhì)檢出含量顯著低于離心組，但同時(shí)乙酸庚酯（12.70 μg/L）、辛酸甲酯（23.52 μg/L）含量顯著高于離心組。如圖1B所示，酒樣揮發(fā)性物質(zhì)檢出總含量和離心轉(zhuǎn)速無(wú)線性關(guān)系。未離心處理的醛酮類總量（140.29 μg/L）略高于其它3個(gè)處理；3000 r/min離心處理組檢出醇類（10 892.52 μg/L）、有機(jī)酸（778.71 μg/L）、酯類（10 170.79 μg/L）均高于其他處理組。

表2 不同離心轉(zhuǎn)速對(duì)部分揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)組分及濃度的影響Table 2 Effect of different centrifugal speeds on the content of volatile compoundsμg/L

2.1.3 NaCl添加量對(duì)葡萄酒揮發(fā)性成分的影響

如表3所示，隨著NaCl添加量增加，檢出的香氣物質(zhì)種類增加，低濃度下部分揮發(fā)性物質(zhì)無(wú)法檢出。同0.5 g NaCl處理相比，1.0 g NaCl另檢出3-甲基戊醇（28.54 μg/L）、苯乙烯（7.33 μg/L）、己酸異戊酯（5.21 μg/L）、癸酸甲酯（3.70 μg/L）等成分。1.5 g NaCl處理另檢出α-松油醇（13.27 μg/L）、甲酸己酯（24.72 μg/L），4-苯丁酸甲酯（12.14 μg/L）、2-甲基辛酸丁酯（6.04 μg/L）等成分。隨著NaCl添加量增多，各物質(zhì)組分檢出量減少，乙酸乙酯、乙酸異丁酯、丁酸乙酯等含量顯著降低。如圖1 C所示，0.5 g NaCl處理組酯類檢出含量（8409.65 μg/L）較2.5 g NaCl處理組（5481.58 μg/L）提高53.42%，醇類含量（11 678.98 μg/L）較2.5 g NaCl處理組（6711.86 μg/L）提高了74.01%，芳香族化合物含量（168.15 μg/L）較2.5 g NaCl處理組（86.48 μg/L）提高94.44%，其他各類成分隨著NaCl添加量增加，整體均呈減少趨勢(shì)。

表3 不同NaCl添加量對(duì)部分揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)組分及濃度的影響Table 3 Effect of different NaCl addition on the content of volatile compoundsμg/L

圖1 不同萃取方式下各類香氣物質(zhì)總量Figure 1 Total contents of various compounds in different assisted extraction methods

2.1.4 不同萃取溫度對(duì)葡萄酒揮發(fā)性成分影響

表4所示，萃取溫度30 ℃時(shí)乙酸丙酯、2-甲基丙酸乙酯、丁酸乙酯、乳酸乙酯、3-甲基丁酸乙酯、乙酸己酯、庚酸乙酯、辛酸甲酯顯著高于其他萃取溫度下檢出量。結(jié)合圖1 D，萃取溫度對(duì)酯類物質(zhì)影響最為顯著，大部分酯類含量隨萃取溫度升高而降低，萃取溫度為30 ℃時(shí)酯類檢出總量（10 495.36 μg/L）較萃取溫度40、50、60 ℃時(shí)分別提高35.11%、32.01%、60.74%。但部分物質(zhì)如癸醇、3-甲基戊酸、2-羥基-4-甲基戊酸乙酯在萃取溫度30 ℃時(shí)無(wú)法測(cè)出。

表4 不同萃取溫度對(duì)揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)組分及濃度的影響Table 4 Effect of different extraction temperature on the content of volatile compoundsμg/L

2.2 主成分分析

如圖2所示，葡萄酒第一主成分（PC1）解釋方差46.9%，第二主成分（PC2）解釋方差21.9% ，累計(jì)貢獻(xiàn)率為68.8%。決定第一主成分的香氣物質(zhì)主要包括2-苯基乙酸乙酯、苯乙醇、辛酸、癸酸、辛醇、十二酸乙酯、十四酸乙酯、癸二酸乙酯、3-甲基辛酸丁酯、癸酸甲酯等物質(zhì)，決定第二主成分的物質(zhì)有辛酸乙酯、癸酸乙酯、己酸乙酯、丁醇、3-甲基-1-乙酸丁酯、庚酸乙酯、丁酸乙酯等。酒樣的離心處理組位于第一象限第一主成分和第二主成分正向端，香氣表現(xiàn)突出，有利于揮發(fā)性香氣物質(zhì)提取。不同萃取溫度分布在第一主成分的正負(fù)兩端，表明萃取溫度對(duì)第一主成分香氣信息檢出含量影響較大，對(duì)第二主成分香氣信息影響較小。高濃度NaCl和超聲處理組集中在第三象限，香氣成分簡(jiǎn)單，香氣信息表現(xiàn)并不突出，不利于‘媚麗’葡萄酒揮發(fā)性香氣釋放。

圖2 ‘媚麗’葡萄酒香氣物質(zhì)得分圖和載荷圖Figure 2 Loading diagram and score plot of principal component analysis of 'Meili' wine aroma components 注：CK：未超聲離心，NaCl 1 g，萃取溫度40 ℃；C1-4：超聲處理10～40 min；L1-3：離心3000 、5000、7000 r/min；N1-4：NaCl添加量0.5 、1.5、2 g、2.5 g；W1-3：萃取溫度30、50、60 ℃Note: CK: no Ultrasonic and Centrifugal, NaCl 1 g, Extraction temperature 40 ℃; C1-4: Ultrasonic Time10～40 min; L1-3: Centrifugal speeds 3000,5000,7000 r/min; N1-4: NaCl 0.5, 1.5, 2.0, 2.5 g; W1-3: Extraction temperature30, 50, 60 ℃

3 討論與結(jié)論

超聲處理被廣泛應(yīng)用在食品揮發(fā)性物質(zhì)的檢測(cè)，通過(guò)空化效應(yīng)提升萃取的傳質(zhì)速率，增強(qiáng)萃取效果[17]。經(jīng)過(guò)超聲處理后‘媚麗’葡萄酒樣檢測(cè)出更多的醇、醛等物質(zhì)，但長(zhǎng)時(shí)間的超聲處理對(duì)酯類物質(zhì)的檢測(cè)產(chǎn)生負(fù)作用。這可能是因?yàn)楦吖β食暺茐牧藫]發(fā)性成分的分子結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致提取效果降低，也可能是超聲過(guò)程中產(chǎn)生熱量導(dǎo)致溶液溫度升高，增加了香氣物質(zhì)的揮發(fā)[18]。本試驗(yàn)中，測(cè)量‘媚麗’葡萄酒揮發(fā)性成分時(shí)不建議進(jìn)行超聲處理，未來(lái)可以根據(jù)超聲時(shí)間、功率、頻率通過(guò)正交試驗(yàn)進(jìn)一步優(yōu)化超聲處理?xiàng)l件。

試驗(yàn)表明，離心處理有助于‘媚麗’葡萄酒揮發(fā)性物質(zhì)的提取和檢測(cè)，酒樣檢測(cè)出更多的香氣化合物，除醛酮類略有下降，醇類、酯類、有機(jī)酸檢出含量均有所上升，3000 r/min轉(zhuǎn)速處理下提取效果最好。原因可能是原酒中基質(zhì)較為復(fù)雜，揮發(fā)性成分溶解度較大，離心處理后樣品的揮發(fā)性物質(zhì)更容易擴(kuò)散至頂空[12]。但離心過(guò)程中會(huì)降低酯類等香氣物質(zhì)成分，離心轉(zhuǎn)速不宜過(guò)高[19]。

在樣品中添加強(qiáng)電解質(zhì)產(chǎn)生鹽析效應(yīng)，可以有效降低有機(jī)物在溶液中的溶解度，檢測(cè)出更多種類的揮發(fā)性物質(zhì)，但過(guò)高的鹽離子會(huì)影響擴(kuò)散的速度，導(dǎo)致化合物測(cè)量濃度降低，本試驗(yàn)結(jié)果符合前人研究結(jié)論[20]。酒樣中酯類、醇類、芳香族化合物等各類物質(zhì)濃度隨NaCl添加量增多呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。當(dāng)NaCl添加量為1 g時(shí)，既可保證提取較多類型的揮發(fā)性物質(zhì)，各成分含量又未明顯降低，適合‘媚麗’葡萄酒香氣檢測(cè)。如果檢測(cè)目的為香氣化合物定性判斷，則可以添加較高質(zhì)量NaCl以增加香氣化合物檢出種類，當(dāng)添加量達(dá)到1.5 g時(shí)，樣品可釋放大部分香氣物質(zhì)。

升高萃取溫度可以促進(jìn)揮發(fā)性化合物到達(dá)頂空及萃取纖維表面，但SPME表面吸附過(guò)程一般為放熱反應(yīng)，高萃取溫度使揮發(fā)性物質(zhì)在涂層與基質(zhì)中的分配系數(shù)降低，低溫適合該反應(yīng)進(jìn)行[21-22]。由于各類物質(zhì)熱力學(xué)系數(shù)不同，需要根據(jù)檢測(cè)目的找到合適的萃取溫度。試驗(yàn)結(jié)果表明，萃取溫度40 ℃以上時(shí)，顯著降低酒樣乙酸丙酯、丁酸乙酯等碳原子數(shù)較少的酯類物質(zhì)檢出含量，但同時(shí)增加了香氣化合物檢出種類。因此，萃取溫度30 ℃較適合對(duì)‘媚麗’葡萄酒進(jìn)行香氣成分定量分析，萃取溫度為50 ℃較適合香氣成分定性檢測(cè)。

試驗(yàn)通過(guò)單因素差異顯著性分析和主成分分析，研究了頂空固相微萃取超聲處理、離心處理、NaCl添加量、萃取溫度4種提取因素對(duì)‘媚麗’葡萄酒揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)釋放的影響，所得最適萃取條件為：不經(jīng)超聲處理，3000 r/min離心處理5 min，添加1 g NaCl，30 ℃萃取溫度。試驗(yàn)結(jié)果有利于提高‘媚麗’葡萄酒香氣檢測(cè)的準(zhǔn)確性，為葡萄酒風(fēng)味物質(zhì)的提取條件優(yōu)化提供思路。未來(lái)有必要進(jìn)行多因素綜合分析，以確定 ‘媚麗’葡萄酒揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的最佳檢測(cè)方法。