楊桂蘭，陳迎春，昝林生，亓桂梅，王珊

（1. 山東省葡萄研究院，濟南 250100；2. 德州學院，德州 253001）

葡萄作為漿果類水果，生產栽培中使用農藥在所難免。近年來，隨著社會進步和生活水平的提高，人們對食品安全的要求愈發(fā)強烈。因此，尋求天然的抗菌物質作為農藥的替代品成為重要研究方向。殼聚糖（Chitosan）作為真菌、細菌和病毒的殺菌劑和植物防御機制的誘導子[1-2]，逐漸成為人們關注和研究的熱點。

殼聚糖是由昆蟲、甲殼類動物的外骨骼和真菌細胞壁中的幾丁質（Chitin）通過去乙?；a生，其化學名稱為(1,4)-2-乙酰氨基-2-脫氧-β-D-葡聚糖。在自然界中，殼聚糖的原料非常豐富，僅次于纖維素。因此，殼聚糖在農業(yè)生產中的應用經濟可行。1979年，Allan等[3]發(fā)現，真菌細胞壁成分能夠激活植物內在免疫系統(tǒng)，有利于減緩病害的蔓延。這項工作被認為是一項開拓性的研究，為真菌細胞壁成分的衍生物——殼聚糖在農業(yè)上的應用開辟了新領域。殼聚糖具有安全無毒、可降解等特性，已經成為最受歡迎的生物高分子物質和主要的植物誘導子。殼聚糖也是第一個被歐盟批準用于植物保護、有機農業(yè)和病蟲害綜合治理的基本物質（歐盟2014/563）。

殼聚糖在許多園藝作物中的應用潛力多有研究，包括誘導防御反應、改善農藝性狀、果蔬采后管理、促進植物生長和增強生理活性等。近年來，有關殼聚糖在葡萄中應用的研究也越來越多，主要集中在病害防治、品質改善以及采后保鮮等方面。本文從葡萄病害防治和品質改善兩個方面對殼聚糖在國內外研究和應用現狀進行綜述，旨在為殼聚糖和其他誘導子在葡萄中的深入研究提供參考。

1 殼聚糖在葡萄病害防治中的應用研究

殼聚糖活性可以歸納為兩點，一是其聚陽離子結構[4]；二是其受體是一個78 kDa結合蛋白[5]。它能夠在植物組織周圍形成半透膜，抑制病原體生長，還能有效誘導植物的各種防御反應，如胼胝質和木質素的形成，合成病程相關蛋白以及幾種防御酶（如苯丙氨酸解氨酶和過氧化物酶等）[6-8]。此外，殼聚糖還能促進植物抗毒素如二苯乙烯類[6,9]、白藜蘆醇、ε-葡萄素和云杉新甙的產生，以及多酚類和萜烯類化合物的產生[2,7,10]。

1.1 殼聚糖與枝干?。═runk Diseases，GTDs）

葡萄枝干病在世界上大部分葡萄產區(qū)均有發(fā)生，造成葡萄嚴重減產。據國際葡萄和葡萄酒組織（OIV）報道[11]，西班牙GTDs的發(fā)病率為10%，法國為13%，意大利為8%～19%，而加州每年因為GTDs的危害至少損失2.6億美元。目前尚無有效的防治措施，GTDs在葡萄栽培上仍然是一大難題。

殼聚糖可以抑制GTDs相關真菌菌絲的生長，如葡萄座腔菌屬（Botryosphaeria sp.）、擬莖點霉屬（Phomopsis sp.）、側彎孢殼屬（Eutypa lata）、黑根病致病菌（Neonectria liriodendri）、厚孢小褐球殼菌（Phaeomoniella chlamydospora）和嗜藍孢孔菌屬（Fomitiporia sp.）真菌[12]。低聚殼聚糖以及與ε-聚賴氨酸、婁徹氏鏈霉菌、淺紫灰葉鏈霉菌次生代謝物形成的聚合物都可以抑制葡萄枝干病的致病菌如小新殼梭孢菌（Neofusicoccum parvum）、色二孢屬真菌（Diplodia seriata）、葡萄座腔菌（Botryosphaeria dothidea）的生長[13]。Cobos等[14]研究發(fā)現，1 mg/mL的低聚殼聚糖處理對葡萄枝干病相關的葡萄座腔菌菌株CBS 113190、色二孢屬真菌菌株CBS 112555、側彎孢殼菌株CBS 101932、大雙孢土赤殼（Ilyonectria macrodidyma）菌株CBS 120170、褐枝頂孢霉（Phaeoacremonium aleophilum）菌株CBS 631.94、厚孢小褐球殼菌菌株CBS 239.74和擬莖點霉菌株CBS 267.80的抑制率達到100%。

綜上，殼聚糖抑制菌絲生長的效果與商業(yè)殺菌劑相當或者更好，所以它是一種有效防治葡萄枝干病的非常有潛力的候選物質[12-13]。

1.2 殼聚糖與灰霉?。℅ray Mold)

灰霉病是葡萄的一種常見病害。葡萄從開花到采收，如遇雨水較多、空氣潮濕、氣候涼爽時極易引發(fā)灰霉病，給葡萄帶來嚴重損失。人們通常使用化學殺菌劑來防治灰霉病的發(fā)生和蔓延。但長期反復使用化學殺菌劑，會使病菌產生抗藥性。在葡萄貯藏期間也常有灰霉病發(fā)生，此時的防治更加困難。近年來，科學家們研究發(fā)現，殼聚糖能夠有效抑制灰霉孢的生長，誘導葡萄對灰霉病的抗性，降低灰霉病的發(fā)病率。

Romanazzi等[15]研究發(fā)現，用不同濃度（0.1%、0.5%、1.0%）的殼聚糖溶液對鮮食葡萄進行處理，對灰霉病的防治效果顯著。用殼聚糖溶液在采前21 d噴施鮮食葡萄果穗一次或采前21 d和5 d噴施兩次，發(fā)現3種濃度的殼聚糖溶液均能降低葡萄采后灰霉病的發(fā)病率。用3種濃度的殼聚糖溶液分別浸泡成熟葡萄果實，并接種灰霉孢，處理后葡萄灰霉病的發(fā)病率、嚴重程度均有所降低。將單粒果實人為損傷，經殼聚糖處理并接種灰霉孢后，染病率和病斑直徑均有所降低，且殼聚糖的濃度越高，防治效果越好。并且發(fā)現，1.0%殼聚糖處理可顯著提高葡萄苯丙氨酸解氨酶（PAL）的活性，因此認為殼聚糖能誘導葡萄對灰霉病的抗性。Mu?oz等[16]用1.0～2.5 mg/L的殼聚糖溶液浸泡成熟葡萄果實，再接種灰葡萄孢，隨后分別放在4 ℃和24 ℃下培養(yǎng)。結果發(fā)現，所有濃度的殼聚糖處理均能抑制灰霉孢的生長，其中2.5 mg/L的殼聚糖對菌絲生長的抑制率最高，達71.02%。Aziz等[17]采用不同分子量和乙?；潭鹊臍ぞ厶菍Α级帑悺咸讶~片進行處理，引發(fā)葉片中植物抗毒素、反式和順式白藜蘆醇及其衍生物ε-葡萄素和云杉新甙的積累。葉片在200 g/mL的殼聚糖溶液中浸泡48 h時，植物抗毒素的產量最高。高濃度的殼聚糖處理也能誘導葡萄葉片幾丁質酶和β-1,3-葡聚糖酶活性。因此，不同濃度的殼聚糖處理均能顯著誘導葡萄對灰霉病的抗性。在50 g/mL殼聚糖處理的葉片中，病變部分的直徑比對照平均減少約50%；當殼聚糖濃度為100 g/mL及以上時，葉片病變部分的直徑平均減少60%，這與Daphnée等的研究結果一致[18]。

1.3 殼聚糖與霜霉?。―owny Mildew）

葡萄霜霉病是由葡萄生單軸霉屬（Plasmopara viticola）真菌引起的，是葡萄最嚴重的病害之一。在過去20年里，控制該病菌最廣泛使用的方法是應用銅類殺菌劑，特別是在有機葡萄園中，銅類殺菌劑使用更多。銅類殺菌劑的大量使用導致銅在土壤表層迅速積累[19]。由于銅不能被土壤微生物代謝，只能通過淋洗逐步清除，導致土壤中步行蟲和蚯蚓數量減少，引起土壤微生物數量和種群結構的改變以及酶活性的下降，降低土壤pH值，影響葡萄生長。因此，殼聚糖可以作為銅類殺菌劑的良好替代品。

Aziz等[17]采用200 mg/mL的殼聚糖溶液對‘霞多麗’葡萄進行處理，使霜霉病菌感染葉片比例從對照的42%降低到12%，感染率降低71%。Romanazzi[20]等研究發(fā)現，在低病壓條件下，0.5%和0.8%殼聚糖處理的葡萄霜霉病發(fā)病率分別比對照降低56%和81%；在高病壓條件下，0.5%和0.8%殼聚糖處理的葡萄霜霉病發(fā)病率分別比對照降低66%和75%。在所選擇的幾種銅類殺菌劑的替代品中，殼聚糖對霜霉病的防治效果最好。Daphnée等[18]用殼聚糖處理葡萄葉片，也發(fā)現殼聚糖能顯著降低葡萄生單軸霉屬真菌的產孢量。由此可見，殼聚糖對葡萄霜霉病有很好的防治效果，實際生產中可以替代銅類殺菌劑。

1.4 殼聚糖與白粉?。≒owdery Mildew）

葡萄白粉病是由子囊菌亞門葡萄鉤絲殼屬真菌（Uncinula necator Schwein.）引起的，被公認為是影響葡萄產量和品質的一種主要疾病。當春季環(huán)境條件適宜時，在葡萄樹體中越冬的閉囊殼產生子囊孢子，在葡萄園內傳播，由分生孢子繼發(fā)感染。病原菌寄生在植株綠色組織（葉子和漿果）的表皮層，對葡萄園造成嚴重損害，使葡萄產量和葡萄酒品質下降。

Gorbatenko等[21]在葡萄開花后用0.01%～0.1%的殼聚糖溶液進行第一次處理，14 d后第二次處理，發(fā)現殼聚糖降低白粉病的發(fā)病率。Iriti等[22]采用不同濃度的殼聚糖處理大田葡萄，發(fā)現0.1%的殼聚糖對白粉病的防治效果最好，病害嚴重度為2.39%，僅次于常規(guī)化學殺菌劑處理的0.92%，遠好于未處理的87.5%。由此可見，殼聚糖對白粉病的防治效果與常規(guī)殺菌劑相當，但殼聚糖有安全無毒、可生物降解等優(yōu)勢，比常規(guī)殺菌劑具有更加廣泛的應用前景。

1.5 殼聚糖與黑木?。˙ois Noir）

葡萄黑木病是一種植原體病害，在大多數葡萄種植區(qū)廣泛存在。在歐洲和地中海地區(qū)頻繁爆發(fā)，并且已經傳播到南非、西亞、澳大利亞、美州，可導致葡萄產量和品質大幅下降。目前還無有效措施來降低葡萄黑木病的發(fā)病率。Romanazzi等[23]從5月初到7月末，每周在感染黑木病的‘霞多麗’葡萄樹冠上噴灑殼聚糖溶液，發(fā)現殼聚糖處理有利于染病植株的恢復，而且恢復后植株的定性和定量參數與健康植株沒有區(qū)別。

1.6 殼聚糖與其他病害

殼聚糖除了能防治以上常見病害外，對葡萄的炭疽病和黑痘病也有一定的防治效果。Munoz等[24]研究發(fā)現，殼聚糖處理能顯著降低常溫下（24 ℃）葡萄漿果的炭疽菌（Colletotrichum spp.）菌斑的大小，但是對冷藏（4 ℃）條件下漿果的炭疽菌無顯著影響。Prakongkha等[25]發(fā)現，殼聚糖可以使葡萄中水楊酸含量大幅度增加，誘導葡萄對痂圓孢屬真菌（Sphaceloma ampelinum）的抗性，使葡萄黑痘病嚴重度降低75%。

此外，殼聚糖還能抑制葡萄采后其他病菌的生長。如Oliveira[26]等對采后葡萄應用殼聚糖涂層，發(fā)現能夠有效抑制青霉菌菌絲生長和孢子萌發(fā)，使孢子發(fā)生形態(tài)學變化，并能有效保持葡萄物理、化學和感官等品質指標。Santos等[27]研究表明，聯(lián)合應用殼聚糖和牛至精油涂層，可以抑制貯藏期間葡萄中黑根霉URM 3728和黑曲霉URM 5842孢子萌發(fā)，使孢子和菌絲發(fā)生形態(tài)學變化。

綜上所述，殼聚糖在葡萄枝干病、灰霉病、霜霉病和白粉病以及黑木病等病害防治中都具有很好的效果。不但可以用于葡萄采前的病害防治中，而且對采后的病害防治也非常有效。

2 殼聚糖對葡萄品質影響

葡萄品質直接影響到葡萄酒的品質。有關葡萄品質的研究一直是國內外研究的熱點。栽培方法，如整形、修剪和虧灌等都對改善葡萄品質有一定作用[28-31]。此外，人們也嘗試使用誘導子，特別是殼聚糖，來改善葡萄漿果的品質。

2.1 總酚

酚類化合物是植物的次生代謝產物，能夠保護植物免受紫外線、昆蟲、病毒和病菌的侵害。酚類化合物存在于葡萄籽、果皮和果汁中，決定葡萄的色澤和風味，并具有很強的抗氧化能力，對人們健康有益，能夠防止維生素流失和氧化損傷，還能抗癌、抗炎、抗過敏、抗高血壓等[32]。近年來，科學家們就殼聚糖處理對葡萄酚類物質的影響展開研究。

Iriti等[22]采用殼聚糖處理‘蒙特布查諾’（Montepulciano）葡萄，發(fā)現處理后葡萄中的總酚含量顯著提高。其中，0.1%殼聚糖處理的果皮中總酚含量提高19%，種子中提高22.5%。相反，常規(guī)殺菌劑處理的果皮中總酚含量降低19%，種子中降低10%。葡萄果肉也呈現類似的趨勢。由此可見，與常規(guī)殺菌劑相比，殼聚糖在提高葡萄總酚方面具有顯著優(yōu)勢。Singh等[8]用0.1%殼聚糖溶液在葡萄轉色期和轉色期后兩次處理‘多瑞弗蘭卡’（Touriga Franca）和‘獵狗’（Tinto C?o）葡萄，發(fā)現處理后兩個品種果皮和種子的總酚含量均顯著增加，其中，以處理后的‘多瑞弗蘭卡’轉色期果皮中增加幅度最大，達到29.51%。Silva等[33]用0.01%殼聚糖溶液處理‘索沙鷗’（Sous?o）葡萄，處理后果皮中的總酚也有所增加。

但也有少數研究認為，殼聚糖對葡萄總酚的影響不顯著。如Duxbury等[34]用殼聚糖處理‘赤霞珠’葡萄，結果發(fā)現殼聚糖對葡萄總酚沒有影響。Portu等[35]發(fā)現，葉面施用0.03%殼聚糖溶液對‘丹魄’葡萄漿果的總酚幾乎沒有影響。由此可見，殼聚糖對總酚的影響因品種而異。

2.2 花色苷

花色苷是一種特殊的多酚類物質，影響漿果和葡萄酒的顏色。Singh等[8]對‘多瑞弗蘭卡’和‘獵狗’葡萄的研究中發(fā)現，0.1%殼聚糖能使兩品種果皮中總花色苷含量明顯增加，在轉色期分別增加35.27%和56.02%，轉色期后分別增加17.42%和10.51%；完全成熟的‘獵狗’果皮中總花色苷也增加22.33%。Silva等[33]用0.01%殼聚糖溶液處理‘索沙鷗’葡萄，發(fā)現處理后葡萄果皮中總花色苷有所增加。Singh等[36]用0.01%的殼聚糖溶液處理‘獵狗’葡萄后發(fā)現，果皮中幾種單體花色苷含量均顯著增加，其中錦葵色素-3-乙酰葡萄糖苷、矢車菊素-3-葡萄糖苷、飛燕草素葡萄糖苷、錦葵色素-3-香豆酰葡萄糖苷增加較多，分別為82.45%、80.02%、75%和71.74%， 而芍藥素-3-葡萄糖苷、矢車菊素-3-香豆酰葡萄糖苷、錦葵色素3-葡萄糖苷、芍藥素-3-香豆酰葡萄糖苷則分別增加56.72%、51.92%、50.87%和47%。此外，殼聚糖處理后的果皮中兒茶素、蘆丁和槲皮素-3-O-半乳糖含量也顯著增加，分別增加133.33%、105.85%和59.09%。而Romanazzi等[37]的研究結果與之相反，認為殼聚糖處理沒有增加葡萄中兒茶素的濃度，而且降低芍藥素-3-O-葡萄糖苷的濃度。Silva等[33]用0.01%殼聚糖溶液處理‘索沙鷗’葡萄，也發(fā)現芍藥素-3-葡萄糖苷的濃度有所降低。

綜上所述，殼聚糖處理對不同葡萄品種的總花色苷含量具有一定的影響。但是也有一些研究發(fā)現殼聚糖對葡萄總花色苷沒有影響[34-36]，甚至在一些品種中應用殼聚糖對總花色苷有負作用，如殼聚糖處理的‘桑嬌維賽’和‘赤霞珠’葡萄中總花色苷含量有所降低[38]。此外，Singh等[36]、Romanazzi等[37]和Silva等[33]的研究也表明，殼聚糖對各單體花色苷的影響不同。

2.3 單寧

單寧與葡萄的收斂性有關，和花色苷共同決定葡萄酒顏色的穩(wěn)定性。Singh等[8]用0.1%殼聚糖溶液處理‘多瑞弗蘭卡’和‘獵狗’兩個葡萄品種，發(fā)現處理后的葡萄果皮和種子單寧含量均顯著增加，其中轉色期‘多瑞弗蘭卡’的果皮和種子中總單寧含量分別增加14.18%和325.15%，‘獵狗’分別增加9.61%和9.23%；轉色期后‘多瑞弗蘭卡’分別增加37.48%和159.02%，‘獵狗’分別增加52.62%和21.32%；完全成熟時，‘多瑞弗蘭卡’分別增加20.46%和32.12%，‘獵狗’分別增加48.46%和6.01%。與Singh等的結果相反，Silva等[33]用0.01%殼聚糖溶液處理‘索沙鷗’葡萄，結果顯示，殼聚糖對總單寧含量有負面影響，導致葡萄果皮和種子中總單寧含量有所降低。

2.4 氨基酸

氨基酸是蛋白質的基本組成單位，是生命活動的物質基礎。氨基酸含量及其組成特征是影響葡萄品質的重要指標。殼聚糖處理對于葡萄氨基酸含量具有一定的影響。

Tessarin等[38]用殼聚糖處理‘赤霞珠’葡萄，發(fā)現處理后葡萄總氨基酸含量有所升高，其中丙氨酸、精氨酸、半胱氨酸、γ-氨基丁酸、亮氨酸、異亮氨酸和絲氨酸含量較對照顯著升高，其他氨基酸含量均有升高，但差異不顯著。處理后的‘桑喬維賽’葡萄與對照相比，各種氨基酸和總氨基酸含量均升高，但差異不顯著。而Gutierrez-Gamboa等[39]的研究結果與之相反，他們發(fā)現，‘丹魄’葡萄經殼聚糖處理后，許多氨基酸濃度有所降低，如谷氨酰胺降低24%，谷氨酸下降16%，γ-氨基丁酸下降27%，丙氨酸下降19%，絲氨酸下降19%，蘇氨酸下降16%，賴氨酸下降39%，精氨酸下降25%，總氨基酸降低17%。Garde-Cerdan等[40]研究發(fā)現，殼聚糖處理使‘蒙特布查諾’葡萄中賴氨酸含量顯著升高，其他氨基酸含量和總氨基酸含量顯著降低。

綜上所述，殼聚糖處理對葡萄總酚、花色苷、單寧以及氨基酸具有一定影響，但影響程度因品種而異。

3 應用前景及未來研究方向探討

探索殼聚糖在可持續(xù)農業(yè)中的應用是世界范圍內的一種趨勢。目前關于殼聚糖的研究發(fā)展非常迅速，正處在從實驗研究向實際應用逐漸轉變的階段。

殼聚糖處理對許多葡萄病害防治非常有效，這是一個不可否認的事實。而且因其使用技術簡單，安全無毒，對環(huán)境友好，有著許多化學殺菌劑無可比擬的優(yōu)點，未來極具發(fā)展?jié)摿?。但是不同葡萄品種施用殼聚糖的最適濃度、施用量、部位、時間和頻率等都有待探索。殼聚糖雖然安全無毒，但是如果施用濃度過高，也會使植物產生中毒癥狀。如Crisp等[41]采用2.5 g/L的殼聚糖溶液處理溫室中‘維歐尼’（Viognier）和‘赤霞珠’葡萄植株，使75%的葉片表現出嚴重的中毒癥狀，導致50%以上的葉片脫落。雖然殼聚糖對很多病害有效，但是如何提高殼聚糖對病害的防治效果還需要繼續(xù)探索。Youssef等[42]用殼聚糖納米顆粒、二氧化硅納米顆粒和殼聚糖-二氧化硅納米復合材料處理‘意大利亞’（Italia）和‘紅高’（Benitaka）葡萄。結果表明，3種材料在1%的濃度下均可減緩真菌生長，其中殼聚糖納米顆?？蓽p少72%，二氧化硅納米顆?？蓽p少7%，而殼聚糖-二氧化硅納米復合材料可減少100%，并且未觀察到3種納米材料對葡萄品質的負作用。這說明殼聚糖和二氧化硅的納米復合材料比殼聚糖單獨處理更加有效。所以，殼聚糖與其他殺菌劑或者植物誘導子一起使用，可能會提高防治效果，這是一個非常值得研究的方向。

殼聚糖對葡萄中總酚、花色苷、單寧以及氨基酸具有一定影響，其影響程度因品種而異，所以殼聚糖對不同葡萄品種品質改善方面的作用還需要進一步地系統(tǒng)研究。有關殼聚糖改善葡萄品質的機理的研究比較少，Singh等[36]研究發(fā)現，殼聚糖處理能夠使編碼苯丙氨酸解氨酶（PAL）、查爾酮合成酶（CHS）、黃烷酮3-羥化酶（F3H）、花青素還原酶（ANR）、尿苷二磷酸葡糖:黃酮醇3-O-葡糖基轉移酶（UFGT）、花青素轉運蛋白（ABCC1和MATE1）和參與花色苷攝取到液泡的谷胱甘肽s-轉移酶（GST）的靶基因表達增加，從而得出殼聚糖對酚類物質的影響可能通過改變編碼次生代謝途徑中許多關鍵酶和轉運蛋白靶基因的表達而實現。殼聚糖對氨基酸含量影響的機理目前鮮有報道，還有待研究。

殼聚糖在葡萄病害防治和品質改善方面的作用不容小覷，在葡萄保鮮方面的應用研究也很多[43-45]。另外，殼聚糖還能促進葡萄植株生長，提高葡萄產量[46-47]。除此之外，殼聚糖在農業(yè)中的作用還有很多，比如，殼聚糖對黃瓜根結線蟲具有良好的防效作用[48]，可保護多種植物免受苜?；ㄈ~病毒（ALMV）、煙草壞死病毒（TNV）、煙草花葉病毒（TMV）、花生矮化病毒（PSV）、黃瓜花葉病毒（CMV）和馬鈴薯病毒X （PVX）的感染[49]，能夠提高植物的抗旱性[50-51]。殼聚糖作為一種土壤改良劑對多種植物的枯萎病均有防治作用，它能夠使疾病發(fā)展延遲，減少枯萎[52-53]，還能改善和活化土壤養(yǎng)分，增強多種土壤酶和根系酶活性，促進蘋果幼樹根系對土壤養(yǎng)分的吸收[54]。這些方面的研究在葡萄中還非常少，還有待進一步地探索。