楊瑩，葉冬青,3，黃羽，黃竟，管敬喜,

（1. 廣西果蔬貯藏與加工新技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西南寧 53007；2. 廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院葡萄與葡萄酒研究所，廣西南寧 53007；3. 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部葡萄酒加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100083）

毛葡萄（Vitis quinquangularisRehd.）屬真葡萄亞屬（Euvitis）東亞種群，原產(chǎn)于我國(guó)，廣泛分布于黃河以南的各省區(qū)[1]。在廣西，毛葡萄較集中分布在桂中、桂北、桂西的喀斯特地貌地區(qū)，野生資源蘊(yùn)藏量十分豐富。毛葡萄果實(shí)富含多種氨基酸、維生素、白藜蘆醇、花色素和雙糖苷等，用其釀制的葡萄酒風(fēng)味獨(dú)特，深受消費(fèi)者的親睞[2]?！搬?號(hào)’是由廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院選育的兩性花野生毛葡萄品種，該品種耐旱、耐瘠、抗病力強(qiáng)，同時(shí)對(duì)南方高溫高濕氣候適應(yīng)性較好[3]，已在廣西大面積種植，并已成為釀造毛葡萄酒的主要原料。

葡萄酒是酵母發(fā)酵葡萄的產(chǎn)物，不同的酵母可以賦予葡萄酒不同的感官風(fēng)味。香氣是評(píng)判葡萄酒品質(zhì)的一個(gè)重要感官指標(biāo)，決定著葡萄酒的風(fēng)味和典型性。本土酵母由于對(duì)當(dāng)?shù)丨h(huán)境的適應(yīng)和自然的選擇而具有某些獨(dú)特的代謝特性，可以賦予當(dāng)?shù)仄咸丫铺赜械娘L(fēng)味特征[4]。近些年的研究也表明，一些非釀酒酵母對(duì)葡萄酒的風(fēng)味形成具有積極作用[5-6]，它們通過(guò)水解香氣前體物質(zhì)，調(diào)節(jié)酯類生成，從而增強(qiáng)香氣特征[7-8]。目前釀造毛葡萄酒多采用商業(yè)活性干酵母發(fā)酵，導(dǎo)致毛葡萄酒原有的典型風(fēng)格缺失，且同質(zhì)化現(xiàn)象明顯。為此本課題組以廣西本土選育的4種野生酵母（釀酒酵母屬的Saccharomyas cerevisiaeMSF8-1、漢遜酵母屬的Hanseniaspora opuntiaeMG6、漢遜酵母屬的Hanseniaspora ocdidentalisMSF6-2、畢赤酵母屬的Pichia pastorisMG1）發(fā)酵‘野釀2號(hào)’毛葡萄酒，通過(guò)研究不同野生酵母對(duì)毛葡萄酒揮發(fā)性香氣成分的影響，探索本土酵母的應(yīng)用潛力和生產(chǎn)具有地域特點(diǎn)毛葡萄酒的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 葡萄原料

‘野釀2號(hào)’毛葡萄：2020年8月采自廣西都安縣安陽(yáng)鎮(zhèn)。采收時(shí)果實(shí)的平均含糖量110 g/L（葡萄糖計(jì)），含酸量16.25 g/L（酒石酸計(jì)）。

1.1.2 試驗(yàn)菌株

從廣西河池市都安縣篩選得到的4株野生酵母：MG1、MG6、MSF8-1、MSF6-2，純化后的單菌株在YPD液體培養(yǎng)基中活化1 d，將活化的菌液與30%無(wú)菌甘油以1∶1混合于1.5 mL離心管中，-80 ℃下保存。CECA活性干酵母：安琪酵母股份有限公司。

1.2 培養(yǎng)基

YPD液體培養(yǎng)基：1 L培養(yǎng)基中含有10 g酵母浸粉、20 g蛋白胨和20 g葡萄糖。

YPDA固體培養(yǎng)基：1 L培養(yǎng)基中含有10 g酵母浸粉、20 g蛋白胨、20 g葡萄糖和20 g瓊脂。

1.3 化學(xué)試劑

2-辛醇（色譜純）：美國(guó)Sigma-Aldrich公司；硫酸銅、酒石酸鉀鈉、偏重亞硫酸鉀、氫氧化鈉、葡萄糖、磷鉬酸、鎢酸鈉、磷酸、鹽酸、沒(méi)食子酸、單寧酸等均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.4 儀器與設(shè)備

頂空-固相微萃?。╤ead space solid-phase microextractions，HS-SPME）系統(tǒng)包括手柄、75 μm Car/PDMS萃取頭：美國(guó)Sigma公司；LRH-250-MS 霉菌培養(yǎng)箱：韶關(guān)市泰宏醫(yī)療器械有限公司；SW-CJ-IFD潔凈工作臺(tái)：蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；DW-86L388：青島海爾特種電器有限公司；Eppendorf 5810R、臺(tái)式高速大容量冷凍離心機(jī)：德國(guó) Eppendorf 公司；UV-2700紫外可見分光光度計(jì)：日本島津公司；Hirayama HV-110：高壓滅菌鍋；Trace MS 2000氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）聯(lián)用儀：美國(guó)Thermo Finnigan公司；DB-WAX色譜柱：美國(guó)Agilent公司。

1.5 方法

1.5.1 菌種活化

將-80 ℃冷凍保藏的4株酵母于常溫解凍后，28 ℃下YPDA固體培養(yǎng)基劃線培養(yǎng)24 h后重復(fù)活化一次。將菌落特征明顯的酵母菌株接種于YPD液體培養(yǎng)基中，28 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)物6000 r/min離心10 min[9]，加無(wú)菌水混合后離心洗滌2次，收集菌體，4 ℃冷藏備用。CECA酵母參照使用說(shuō)明進(jìn)行活化。

1.5.2 葡萄酒釀造工藝

將除梗破碎后的‘野釀2號(hào)’葡萄醪裝入2.5 L發(fā)酵容器中，裝載量為2 L，在葡萄醪中加入亞硫酸至SO2含量達(dá)到60 mg/L，混合均勻。然后將每種酵母按照106cfu/mL接入葡萄醪中，25～28 ℃發(fā)酵，每組3個(gè)重復(fù)。發(fā)酵結(jié)束后收集葡萄酒，于4 ℃下冷藏[10]。

1.5.3 葡萄酒理化指標(biāo)檢測(cè)

殘?zhí)牵红沉衷噭┑味ǚǎㄆ咸烟怯?jì)）；酒精度：酒精計(jì)法；總酸：NaOH滴定法（酒石酸計(jì)）；揮發(fā)酸：水蒸汽蒸餾法（醋酸計(jì)）；總酚：福林-肖卡試劑法（以沒(méi)食子酸計(jì)）；單寧：福林-丹尼斯試劑法（以單寧酸計(jì)）；干浸出物：密度瓶法。以上理化指標(biāo)檢測(cè)方法參考自《葡萄酒分析檢驗(yàn)》[11]?？偦ㄉ諜z測(cè)采用pH示差法[12]。

1.5.4 HS-SPME

HS-SPME條件：取8 mL樣品置于20 mL頂空瓶中，并加入磁力轉(zhuǎn)子，加入10 μL的100 μg/mL的2-辛醇作為內(nèi)標(biāo)。將老化后的75 μm Car/PDMS萃取頭插入樣品瓶頂空部分，在45 ℃吸附30 min，吸附后的萃取頭取出后插入氣相色譜進(jìn)樣口，于250 ℃解吸3 min，同時(shí)啟動(dòng)儀器采集數(shù)據(jù)。

1.5.5 GC-MS分析

GC條件：色譜柱DB-Wax（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；初始溫度為40 ℃，保持3 min，以5.0 ℃/min升至90 ℃，再以10.0 ℃/min升至230 ℃，保持7 min；進(jìn)樣溫度250 ℃，載氣為He，流速0.8 mL/min，不分流。

MS條件：電子電離（EI）源，電子能量為70 eV，離子源溫度200 ℃，掃描范圍30～500 u。

1.5.6 揮發(fā)性香氣成分的定性與定量

揮發(fā)性成分的定性：由GC-MS分析得到的質(zhì)譜數(shù)據(jù)在NIST、Wiley及香精香料標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)的檢索比對(duì)進(jìn)行定性，比對(duì)時(shí)要求匹配度大于800（最大值為1000）。

揮發(fā)性成分的定量：采用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行半定量分析，內(nèi)標(biāo)選用2-辛醇。

計(jì)算公式：檢測(cè)物質(zhì)濃度＝(V1/V2)×C，式中V1：檢測(cè)物質(zhì)峰面積；V2：2-辛醇峰面積；C：2-辛醇的濃度。

1.5.7 數(shù)據(jù)處理和作圖

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，采用Origin 9.0軟件進(jìn)行制圖。試驗(yàn)重復(fù)3次，其中葡萄酒基本理化指標(biāo)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，采用ANOVA法進(jìn)行顯著性方差分析。香氣物質(zhì)含量采用平均值表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同酵母對(duì)毛葡萄酒理化指標(biāo)的影響

從表1可知，5種毛葡萄酒中，4株本土酵母發(fā)酵的毛葡萄酒中殘?zhí)窃?.45～5.19 g/L，均大于4 g/L，未達(dá)到干型酒的要求；CECA酵母發(fā)酵的毛葡萄酒殘?zhí)菫?.72 g/L，發(fā)酵較為徹底。4株本土酵母發(fā)酵的毛葡萄酒酒精度在4.83%～5.63%，均低于CECA酵母的5.91%。上述兩項(xiàng)指標(biāo)說(shuō)明4株本土酵母的酒精發(fā)酵能力與CECA酵母存在一定差距。5種毛葡萄酒的總酸含量在12.44～15.67 g/L，pH值2.90～3.08，其中CECA中的總酸最低，pH最高。4株本土酵母釀制的毛葡萄酒揮發(fā)酸含量在0.50～0.63 g/L，CECA的為0.34 g/L，符合國(guó)標(biāo)GB/T 15037—2006的要求。5種毛葡萄酒中單寧、總花色苷含量差別不明顯，其中單寧最低的是MSF8-1，為1012.18 mg/L；花色苷最低的是MSF6-2，為590.52 mg/L?？偡雍吭?種毛葡萄酒中差別較大，最低的是MSF8-1，為1739.89 mg/L；CECA的總酚含量最高，為2659.06 mg/L。在干浸出物的指標(biāo)中，MSF6-2最高，為24.70 g/L。

表1 不同酵母釀造的‘野釀2號(hào)’毛葡萄酒基本理化指標(biāo)Table 1 Effect of indigenous yeast strains on the basic physical and chemical indicators of 'Yeniang No. 2' wine

2.2 不同酵母發(fā)酵毛葡萄酒的揮發(fā)性香氣成分比較

由表2可知，5種酵母發(fā)酵的毛葡萄酒在香氣成分的種類與含量上均存在一定差異，說(shuō)明酵母菌株對(duì)香氣成分有顯著的影響。5種酒樣共鑒定出68種香氣成分，醇類13種、酯類32種、醛酮類7種、酸類5種、萜烯類3種以及其它8種，其中有33種是5種酒樣共有的。5種毛葡萄酒中MSF8-1、MG1、CECA中的香氣種類較多，分別為53、54、55種；MSF6-2和 MG6的種類較少，分別為44和46種。從表3看出，5種酒樣中香氣含量差異顯著，4種本土酵母發(fā)酵的毛葡萄酒香氣含量均高于CK發(fā)酵的毛葡萄酒9998.39 mg/L，其中最高的是MSF8-1，達(dá)17 112.08 mg/L，其次是MSF6-2、MG6、MG1。同時(shí)也可以看出各酒樣中醇類和酯類物質(zhì)含量均較高，是毛葡萄酒的主要香氣物質(zhì)。

2.2.1 醇類

醇類物質(zhì)是構(gòu)成葡萄酒風(fēng)味的重要物質(zhì)之一，是酵母在酒精發(fā)酵過(guò)程中進(jìn)行糖代謝或氨基酸代謝的產(chǎn)物[13]。從表2中可以看出，5種毛葡萄酒中共檢測(cè)出13種醇類物質(zhì)，其中異戊醇的含量最高，其次是己醇、苯乙醇、異丁醇、葉醇等。適量的醇類物質(zhì)可使葡萄酒的香氣更為復(fù)雜、濃郁，如異戊醇具有蘋果、白蘭地香氣；苯乙醇可賦予葡萄酒愉快的玫瑰香、紫蘿蘭香、茉莉花香等多種風(fēng)味[14-16]，這些醇類物質(zhì)對(duì)葡萄酒整體感官質(zhì)量有一定的優(yōu)化作用[17]。由表3可知，MSF8-1發(fā)酵的毛葡萄酒中醇類物質(zhì)含量最高，為6272.28 mg/L，其次分別為CECA、MSF6-2、MG6、MG1，其中MG1醇類物質(zhì)含量?jī)H為2409 mg/L，不同酵母發(fā)酵的毛葡萄酒醇類物質(zhì)含量差異顯著。

2.2.2 酯類

大多數(shù)酯類具有花或果香氣，有益于葡萄酒的香氣質(zhì)量[18]，是葡萄酒中重要的風(fēng)味物質(zhì)。如表2所示，在5種酒樣中共檢出32種酯類化合物，19種酯類為5種毛葡萄酒所共有，這些酯類主要以乙酸酯類和乙醇酯類為主，含量最高的為乙酸乙酯，其次是乙酸異戊酯、辛酸乙酯、乙酸異丁酯、乳酸乙酯、癸酸乙酯等，這些物質(zhì)具有明顯的果香、花香氣味。從表3可知，各酒樣中酯類物質(zhì)的含量存在顯著差異，其中CECA發(fā)酵的毛葡萄酒中酯類物質(zhì)含量?jī)H為5139.87 mg/L，而4種本土酵母發(fā)酵的毛葡萄酒酯類物質(zhì)含量則顯著高于對(duì)照，其中MSF6-2最高，為11 860.39 mg/L，是CECA的2.31倍。其次從單個(gè)酯類來(lái)看，乙酸乙酯、乙酸異戊酯、辛酸乙酯、乙酸異丁酯、乳酸乙酯等主要酯類物質(zhì)含量也明顯高于對(duì)照，酯類物質(zhì)含量高意味著能夠賦予毛葡萄酒更多的花果香氣特征。

表2 不同酵母發(fā)酵‘野釀2號(hào)’毛葡萄酒的揮發(fā)性香氣成分Table 2 Volatile aroma components of 'Yeniang No. 2' wine fermented by indigenous yeast strains

2.2.3 醛、酮類

由表2、表3可知，5種酒樣中共檢測(cè)到7種醛、酮類化合物且含量不高，占各自酒樣香氣含量的0.003%～0.013%，各酒樣之間醛、酮類化合物的種類和含量上差異較大。醛類物質(zhì)中苯乙醛在5種酒樣中均被檢測(cè)到，該物質(zhì)通常呈現(xiàn)出橘皮香和花蜜香。酮類物質(zhì)僅有3-羥基-2-丁酮，只在MSF6-2、MG1和MG6發(fā)酵酒中檢出，該物質(zhì)可使葡萄酒具有奶香味。

續(xù)表2

2.2.4 酸類

酸類是構(gòu)成毛葡萄酒香氣特征的重要組成部分，當(dāng)含量小于閾值時(shí)，可為酒帶來(lái)新鮮感并平衡果香，反之則會(huì)帶來(lái)負(fù)面影響[19-20]。由表2中可知，在5個(gè)酒樣中共檢測(cè)出5種酸類香氣物質(zhì)，其中異丁酸、戊酸和己酸為5個(gè)酒樣所共有，辛酸僅在CECA發(fā)酵的酒中被檢測(cè)到。表3則顯示，從含量上來(lái)看，MSF6-2和MSF8-1發(fā)酵的毛葡萄酒中酸類物質(zhì)含量分別是259.7、260.38 mg /L，顯著高于其他3個(gè)樣酒。

2.2.5 萜烯類

萜烯類化合物主要來(lái)源于葡萄果實(shí)本身，具有愉悅的芳香氣味和極低的閾值。由表2、表3可知，在5種酒樣中萜烯類化合物含量差異顯著且僅檢測(cè)到3種萜烯類化合物，分別是Vitispirane、α-松油醇和β-大馬士酮。Vitispirane在5個(gè)酒樣中均含有，具有樟腦氣味。β-大馬士酮是葡萄酒中常見的萜烯類化合物，具有花香、蘋果香等氣味，本試驗(yàn)中僅在MSF8-1、MG1、CECA發(fā)酵的酒樣中被檢測(cè)到。

由表2、表3可知，5個(gè)酒樣中還檢測(cè)到一些揮發(fā)酚和醚等8種香氣物質(zhì)，在組成和含量上差異較大，僅有鄰二甲苯和苯乙烯是共有的。這些物質(zhì)通常含量都不高，但對(duì)葡萄酒的整體風(fēng)味也起到一定貢獻(xiàn)。

表3 不同酵母發(fā)酵‘野釀2號(hào)’毛葡萄酒的揮發(fā)性香氣種類及總量Table 3 Total Volatile aroma volumes of 'Yeniang No. 2' wine fermented by indigenous yeast strainsmg/L

2.3 香氣活度值分析

香氣活度值（OVA）是表征葡萄酒中各香氣成分對(duì)實(shí)際香氣貢獻(xiàn)大小的一種普遍方法，通常認(rèn)定OVA＞1的香氣物質(zhì)為活性香氣物質(zhì)[21-22]，但0.1≤OAV≤1的物質(zhì)對(duì)酒樣總體香氣也具有一定貢獻(xiàn)[23-24]。根據(jù)OAV值，共確定22種關(guān)鍵呈香成分（見表4），包括5種醇類、12種酯類，其他分別是苯乙醛、異丁酸、己酸、Vitispirane和α-松油醇。

表4 五個(gè)毛葡萄酒香氣物質(zhì)活性值（OAV）及特征描述Table 4 Odor activity values and odor description of five wines

由圖1可知，22種關(guān)鍵呈香香氣成分的聚類熱圖顯示不同菌株發(fā)酵的‘野釀2號(hào)’毛葡萄酒中揮發(fā)性香氣物質(zhì)含量的差異。由圖1可知，與商業(yè)酵母CECA相比較，MG1和MG6與其相似性較高，聚為一類，表明2株本土酵母對(duì)‘野釀2號(hào)’葡萄酒特征香氣的影響與CECA較為接近；MSF6-2和MSF8-1聚為另一類，與CECA距離較遠(yuǎn)，表明MSF6-2和MSF8-1對(duì)‘野釀2號(hào)’葡萄酒特征香氣的影響較為一致，與CECA的差異較大。相較于其他酵母，MSF6-2和MSF8-1的關(guān)鍵呈香物質(zhì)含量更高，如乙酸異戊酯、癸酸乙酯、辛酸乙酯、乙酸苯乙酯、苯乙酸乙酯等，這些酯類通常都表現(xiàn)出花香、果香和蜂蜜味。

圖1 毛葡萄酒樣中22種香氣成分活性值（OAV）的聚類分析Figure 1 Results of cluster analysis using the OAV of 22 components from wines

為了能更進(jìn)一步分析不同酵母對(duì)‘野釀2號(hào)’毛葡萄酒香氣特征的影響，根據(jù)葡萄酒香氣物質(zhì)的組成對(duì)其香氣輪廓進(jìn)行模擬，參照Simonetta、蔡建等[25-26]的方法將各關(guān)鍵香氣成分進(jìn)行分類，并計(jì)算每個(gè)分類的OAV總和，具體類別及分類方式見圖2。

由圖2可知，果香、花香是5個(gè)毛葡萄酒主要的香氣特征，其次為脂肪味（奶油味）和刺鼻味（酒精味）以及少量的脂肪味、微生物味和植物味等。5個(gè)毛葡萄酒的總體香氣輪廓較為相近，但也有所差別。與CECA發(fā)酵的毛葡萄酒相比，4株本土酵母發(fā)酵的毛葡萄酒具有更強(qiáng)的花香味，果香味則以MSF6-2與MG6發(fā)酵的毛葡萄酒與對(duì)照接近，而MSF8-1和MG1發(fā)酵的毛葡萄酒的果香味則偏弱。

圖2 5種毛葡萄酒的香氣輪廓圖Figure 2 Aroma profile of wines from five yeasts

3 討論與結(jié)論

酵母菌種對(duì)葡萄酒品質(zhì)的形成有很大影響，直接決定了葡萄酒的口感和風(fēng)味[27-28]。由于商業(yè)活性干酵母具有使用方便、發(fā)酵特性穩(wěn)定等優(yōu)勢(shì)逐漸成為葡萄酒釀造的首選，但這也造成各地區(qū)葡萄酒口感和品質(zhì)的趨同，產(chǎn)地風(fēng)格不能很好地體現(xiàn)出來(lái)，一定程度上阻礙了我國(guó)葡萄酒產(chǎn)業(yè)的正常發(fā)展，同時(shí)也難以滿足當(dāng)前消費(fèi)者對(duì)葡萄酒風(fēng)格多樣化的需求。本研究以廣西選育的本土酵母發(fā)酵‘野釀2號(hào)’毛葡萄酒，與對(duì)照商業(yè)酵母CECA相比，本土酵母發(fā)酵的毛葡萄酒在香氣種類上少于或接近CECA發(fā)酵的毛葡萄酒，但香氣含量上明顯高于對(duì)照，特別是MSF6-2和MSF8-1酵母，二者香氣含量分別為16 007.12、17 112.08 mg/L，CECA僅為9998.39 mg/L。進(jìn)一步通過(guò)對(duì)毛葡萄酒香氣輪廓圖的分析發(fā)現(xiàn)，有本土酵母發(fā)酵的毛葡萄酒具有更多的花香香氣特征，這有助于改善現(xiàn)有毛葡萄酒以青草味、泥土味等為主的感官特征。隨著對(duì)葡萄酒風(fēng)土及地域特點(diǎn)的追求，篩選本土酵母發(fā)酵葡萄酒越來(lái)越受到重視，甚至包括選用非釀酒酵母或與釀酒酵母混合發(fā)酵來(lái)增加葡萄酒香氣的復(fù)雜性和多樣化[29-34]。廣西是毛葡萄重要的原產(chǎn)地之一，利用本研究篩選的發(fā)酵特性優(yōu)良的本土酵母與商業(yè)酵母組合可生產(chǎn)出獨(dú)具特色的毛葡萄酒，對(duì)廣西產(chǎn)地葡萄酒典型特征的形成具有重要意義。