李東奎，許一博，王躍進(jìn)

（西北農(nóng)林科技大學(xué)園藝學(xué)院/旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部西北地區(qū)園藝作物生物與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西楊凌 712100）

葡萄是一種廣泛栽培的果樹，在世界和我國園藝作物中都有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值[1-2]。據(jù)世界糧農(nóng)組織（FAO）數(shù)據(jù)顯示，2019年全球葡萄栽培面積達(dá)到692.6萬 hm2，總產(chǎn)量達(dá)到7713.9萬 t。其中，我國葡萄面積74.6萬 hm2，居世界第二位；葡萄產(chǎn)量達(dá)1437.2萬 t，居世界第一位。葡萄生產(chǎn)中的主栽品種以歐洲葡萄為主，品質(zhì)好，風(fēng)味佳，用途廣泛，但易感霜霉菌、白粉菌等真菌病害[3]。病害發(fā)生時(shí)，以化學(xué)方法噴藥為主，這不僅增加生產(chǎn)成本、造成環(huán)境污染，還會導(dǎo)致殺菌劑殘留，降低葡萄品質(zhì)，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[4]。從長遠(yuǎn)看，進(jìn)行抗性育種是解決歐洲葡萄品種抗病性差的有效途徑。葡萄抗病育種的前提是擁有抗病的種質(zhì)資源，中國作為葡萄屬植物的重要起源中心之一，擁有豐富的野生葡萄種質(zhì)資源，對霜霉病表現(xiàn)出極好的抗性[2]。因此，對包括中國野生葡萄在內(nèi)的種質(zhì)資源進(jìn)行抗霜霉病的田間自然鑒定，篩選抗病種質(zhì)資源，對于抗霜霉病育種具有重要的科學(xué)意義。

霜霉病是葡萄最具破壞性的真菌病害之一，是由一種來自北美野生葡萄上的霜霉菌（Plasmopara viticola）引起[5]，后來通過砧木、接穗等途徑在歐洲各主產(chǎn)區(qū)傳播爆發(fā)，對歐洲葡萄與葡萄酒產(chǎn)業(yè)造成巨大的損失[4]。我國由于早期缺乏相應(yīng)的檢驗(yàn)檢疫措施導(dǎo)致霜霉病進(jìn)入并大規(guī)模發(fā)病。葡萄霜霉菌主要侵染葉片，在環(huán)境條件適宜時(shí)，病菌在一個(gè)生長季內(nèi)連續(xù)繁殖多代，導(dǎo)致病情呈暴發(fā)式發(fā)展，使樹體光合性能降低，光合產(chǎn)物合成受阻，從而影響葡萄產(chǎn)量和果實(shí)品質(zhì)[6-7]。

在田間自然條件下，根據(jù)發(fā)病率調(diào)查葡萄種質(zhì)資源發(fā)病情況。按照感病指數(shù)統(tǒng)計(jì)，將葡萄種質(zhì)與株系的抗病性分成5級[8]。對中國野生葡萄10個(gè)種29個(gè)株系以及17個(gè)歐洲品種、9個(gè)歐美雜種進(jìn)行霜霉病抗病性鑒定，篩選抗霜霉病的種質(zhì)資源。同時(shí)，采用苯胺藍(lán)染色法，結(jié)合熒光顯微鏡技術(shù)對霜霉菌在抗病株系和感病品種中的侵染過程進(jìn)行觀察，并利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測技術(shù)對葡萄霜霉菌抗病相關(guān)基因的表達(dá)進(jìn)行分析，進(jìn)一步證實(shí)葡萄種質(zhì)資源的抗病表現(xiàn)，以期為葡萄抗霜霉病育種提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

2019—2020年在霜霉病流行后期的9月進(jìn)行調(diào)查。田間自然抗病鑒定材料為中國野生葡萄10個(gè)種29個(gè)株系以及17個(gè)歐洲品種、9個(gè)美洲品種共計(jì)55份。田間試驗(yàn)于西北農(nóng)林科技大學(xué)葡萄種質(zhì)資源圃進(jìn)行，室內(nèi)分析研究在國家旱區(qū)作物逆境生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室與農(nóng)業(yè)部西北地區(qū)園藝作物生物與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.2 葡萄霜霉病田間抗病性鑒定

按照葉片感病面積占整個(gè)葉片面積的百分比，將葡萄抗霜霉病分為0～7共8個(gè)級別進(jìn)行調(diào)查統(tǒng)計(jì)，然后用加權(quán)的方法統(tǒng)計(jì)出植株發(fā)病的感病指數(shù)[18]。計(jì)算公式如下：

感病指數(shù)＝Σ(病極值×該級發(fā)病葉數(shù))/(調(diào)查總?cè)~數(shù)×最高病極值)×100%

根據(jù)感病的嚴(yán)重程度把材料分成5級[8]。具體是：0為免疫或未發(fā)?。?.1～5.0為高抗；5.1～25.0為抗?。?5.1～50.0為感??；50.1～100為高感。

1.3 葡萄葉片苯胺藍(lán)染色過程

苯胺藍(lán)染色液制備方法參考李卓[9]方法。取0.05 g苯胺藍(lán)溶于100 mL磷酸二氫鉀（0.067 Mol）中制備0.05%苯胺藍(lán)染色液。將霜霉菌孢子囊懸浮液（2 ×104cfu/mL）均勻噴灑在葡萄葉背并套袋。分別于接種后0、12、36、60、84 h取樣浸泡于0.05%苯胺藍(lán)染色液中過夜。將葉背面朝上放在載玻片上，用藍(lán)紫光觀察菌絲生長情況。

1.4 熒光定量PCR分析抗病基因的表達(dá)

實(shí)時(shí)熒光定量PCR的引物設(shè)計(jì)參照Cheng等[10-11]列于（表1），對‘丹鳳-2’‘塘尾’‘白玉霓’‘黑比諾’人工接種霜霉菌處理，于接種后0、12、24、48、72、96 h分別采樣提取RNA。提取方法參照Hipure Plant RNA Mini Kit試劑盒（Magen R4151-02）的說明書。反轉(zhuǎn)錄合成cDNA的方法參照SumOnetube RT Mixture Ⅲ（gDNA removal）試劑盒（夏末科技 SUM7806）的說明書。稀釋后的cDNA作為qRT-PCR的模板。以葡萄Actin為內(nèi)參基因。實(shí)驗(yàn)方法參考Shi[12]進(jìn)行3 次生物學(xué)重復(fù)，每處理 3次技術(shù)重復(fù)。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量引物Table 1 Real time-PCR reaction primers

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

用Excel軟件對大田統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理分析，用Origin 8.0繪制實(shí)時(shí)熒光定量PCR數(shù)據(jù)分析圖?；蛳鄬Ρ磉_(dá)量的顯著性分析通過SPSS 25.0單因素方差分析的LSD法分析比較檢驗(yàn)（P＜0.01）差異結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄霜霉病田間自然抗病性鑒定

2.1.1 中國野生葡萄霜霉病田間自然抗病性鑒定

利用田間自然抗病鑒定的方法對中國野生葡萄10個(gè)種29個(gè)株系進(jìn)行抗霜霉病鑒定（表2）。其中，中國野生種華東葡萄商南-1、湖南-1、商南-2，毛葡萄南鄭-1，復(fù)葉葡萄眉縣-6、白水-40、渭南-3，癭薁葡萄安林-2、安林-3對霜霉病有較高的抗性；復(fù)葉葡萄留壩-11、留壩-9為易感霜霉病株系。

表2 田間自然條件下中國野生葡萄對霜霉病的抗性鑒定Table 2 Identification of Chinese wild Vitis resistance to downy mildew under natural conditions in the field

圖1 人工接種霜霉菌侵染過程菌絲生長觀察Figure 1 Observation of the infection process of Plasmopara viticola inoculated hypha

2.1.2 歐洲種與歐美雜種葡萄霜霉病田間抗病性鑒定

利用田間自然抗病鑒定方法對17個(gè)歐洲種、9個(gè)歐美雜種進(jìn)行抗霜霉病鑒定。其中歐美雜種‘瑞比爾’‘SO4’‘高妻’對霜霉病有較高的抗性；歐洲品種‘白詩南’‘法國藍(lán)’‘黑玫瑰’易感霜霉?。ū?）。

表3 田間自然條件歐洲葡萄與歐美雜種葡萄對霜霉病的抗性鑒定Table 3 Identification of resistance European varieties and Euro-America hybrids to downy mildew under natural conditions in the field

2.2 田間人工接種霜霉菌的侵染菌絲觀察

利用人工接種的方法對抗病株系丹鳳-2，感病品種‘白玉霓’‘黑比諾’‘法國藍(lán)’進(jìn)行人工接種霜霉菌處理，觀察侵染過程。發(fā)現(xiàn)丹鳳-2接種霜霉菌84 h后可觀察到初生菌絲；‘白玉霓’接種12 h后有初生菌絲，36 h后有分支的長菌絲，84 h后出現(xiàn)聚集成團(tuán)的長菌絲；‘黑比諾’接種12 h后可觀察到長菌絲，36 h后可觀察到有分支的長菌絲，60 h后出現(xiàn)聚集成團(tuán)的長菌絲，84 h后出現(xiàn)壞死；‘法國藍(lán)’接種12 h后可觀察到長菌絲， 36 h后可觀察到有分支的長菌絲，84 h后出現(xiàn)聚集成團(tuán)的長菌絲。霜霉菌侵入‘白玉霓’‘黑比諾’‘法國藍(lán)’后，菌絲的生長和發(fā)育明顯快于丹鳳-2。

2.3 部分種質(zhì)抗病相關(guān)基因表達(dá)水平

通過病原菌侵染觀察，對不同種質(zhì)的入侵能力不同，這可能與組織結(jié)構(gòu)有關(guān)，也可能與抗病基因表達(dá)后促進(jìn)抵抗病原菌入侵的物質(zhì)累積有關(guān)。對兩個(gè)中國野生葡萄抗病株系丹鳳-2、塘尾和兩個(gè)易感品種‘黑比諾’‘白玉霓’接種霜霉菌后進(jìn)行qRT-PCR分析，通過檢測抗病相關(guān)基因的表達(dá)結(jié)果顯示，抗病基因在抗病品種和易感品種中的表達(dá)有顯著差異，中國野生葡萄抗病株系丹鳳-2的葉片接種霜霉菌12 h后苯丙氨酸解氨酶基因PAL表達(dá)量顯著提高，芪合酶基因STS接種霜霉菌96 h后表達(dá)量顯著高于易感品種‘黑比諾’‘白玉霓’；中國野生葡萄抗病株系丹鳳-2、塘尾的葉片接種霜霉菌后病程相關(guān)基因非表達(dá)子NPR1基因均出現(xiàn)表達(dá)量遞減的情況；中國野生葡萄抗病株系丹鳳-2、塘尾和兩個(gè)易病品種‘黑比諾’‘白玉霓’的葉片在人工接種霜霉菌后，類甜蛋白基因TLP均出現(xiàn)表達(dá)量遞增的趨勢。

圖2 不同葡萄接種霜霉菌處理后抗病相關(guān)基因差異表達(dá)Figure 2 Expression of disease resistance-related genes after Plasmopara viticola inoculation in different grapevinesA：苯丙氨酸解氨酶基因PAL基因相對表達(dá)量；B：芪合酶基因STS相對表達(dá)量；C：病程相關(guān)基因非表達(dá)子NPR1相對表達(dá)量；D：類甜蛋白基因TLP相對表達(dá)量。顯示為平均值±SD（n＝3）；a代表極顯著（P＜0.01）A:The relative expression of PAL gene; B: The relative expression of STS gene; C: The relative expression of NPR1; D:The relative expression of TLP. The data were showed as mean value±SD (n＝3).a highly significant (P＜0.01), respectively

3 討論與結(jié)論

中國蘊(yùn)藏著豐富的野生葡萄種質(zhì)資源[13]，鑒定這些資源的抗病性是抗病育種的前提。賀普超等提出中國野生葡萄抗霜霉病的鑒定方法并對中國野生葡萄21個(gè)種67個(gè)株系和部分歐洲品種進(jìn)行抗病性鑒定認(rèn)為，華東葡萄、燕山葡萄、瘤枝葡萄、復(fù)葉葡萄、秋葡萄對抗霜霉病具有良好的抗性[14]。本次田間自然抗病性鑒定也發(fā)現(xiàn)，中國野生葡萄華東葡萄商南-1、湖南-1、商南-2，復(fù)葉葡萄眉縣-6、白水-40，秋葡萄白河-22、平利-7等株系對霜霉病都有較高的抗性。Blaich利用人工接種方法對45個(gè)歐洲種、32個(gè)美洲種及26個(gè)歐美雜交子代進(jìn)行接種霜霉菌處理，發(fā)現(xiàn)接種后歐洲種最容易表現(xiàn)癥狀，其次為歐美雜交子代，最不容易出現(xiàn)癥狀的為美洲種[15]。Bower以歐洲種為試材，利用田間自然抗病性鑒定法對29個(gè)歐洲種進(jìn)行鑒定后認(rèn)為，不同品種對霜霉病的抗性也不同[16]。Burruano利用人工接種霜霉菌的方法對不同葡萄品種接種后發(fā)現(xiàn)，霜霉菌在不同品種中的生長速度不同，其中霜霉菌在歐洲品種中生長最快[17]。本試驗(yàn)田間自然抗病性鑒定也發(fā)現(xiàn)，中國野生種、歐美雜交子代對霜霉病的抗性普遍高于歐洲品種。利用苯胺藍(lán)染色的方法發(fā)現(xiàn)霜霉菌侵入感病的歐洲品種‘白玉霓’‘黑比諾’‘法國藍(lán)’后，其菌絲的生長和發(fā)育明顯快于侵入中國野生葡萄抗病株系丹鳳-2；Trouvelot以18個(gè)歐洲種、11個(gè)美洲種為試材，人工接種霜霉菌的侵染過程發(fā)現(xiàn)，在接種霜霉菌5 d后，18個(gè)歐洲種中有17個(gè)出現(xiàn)壞死性病斑，而11個(gè)美洲種均沒有出現(xiàn)壞死性病斑[18]，這與本試驗(yàn)結(jié)果類似。萬怡震等[19]對中國野生葡萄17個(gè)種的67個(gè)株系在自然條件下進(jìn)行抗病性鑒定，發(fā)現(xiàn)多個(gè)株系對霜霉病抗性鑒定結(jié)果與本鑒定結(jié)果存在一定的差異，這可能與年份、樹齡及病原菌積累有關(guān)，這為進(jìn)一步的研究提供了方向。Javier以21個(gè)美洲品種和60個(gè)歐洲品種為試材，利用離體接種鑒定的方法進(jìn)行霜霉病抗性評價(jià)后認(rèn)為，歐洲種對霜霉病的抗性普遍低于美洲種[20]。Toffolatti以美洲種、歐洲種以及歐美雜種為試材，人工接種霜霉菌后從組織結(jié)構(gòu)抗性和生理生化抗性進(jìn)行分析后認(rèn)為，美洲葡萄對霜霉菌較高的抗性與葉片結(jié)構(gòu)和抗病基因的表達(dá)有關(guān)[21]。

組織結(jié)構(gòu)是植物抵抗真菌病害的重要器官[22]。在棉花、蠶豆、棗樹[23-25]等植物中都發(fā)現(xiàn)物理防御機(jī)制是植物抵御真菌侵染的重要方式。早期Marois以‘無核白’為試材利用氯仿溶劑除去葡萄表皮蠟質(zhì)層后發(fā)現(xiàn)，‘無核白’對灰霉病的抗性顯著降低[26]；Selim以‘無核白’和‘雷司令’為試材利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)分析后認(rèn)為，葡萄葉片下表皮中的殼聚糖合成基因是響應(yīng)霜霉菌侵染的重要基因[27]。Lema?tre-Guillier通過葡萄蛋白質(zhì)組學(xué)分析認(rèn)為，角質(zhì)層是葡萄抵御霜霉菌侵染的重要屏障[28]。有學(xué)者采用轉(zhuǎn)錄和代謝組學(xué)分析認(rèn)為，葡萄上表皮中的殼聚糖是抵御葡萄灰霉菌的重要物質(zhì)[29-30]；韓蕊通過對不同抗性葡萄葉片與黑痘菌互作的超微結(jié)構(gòu)觀察認(rèn)為，葡萄對黑痘病的抗性與上表皮厚度有關(guān)[31]。林玲認(rèn)為，毛葡萄葉背絨毛為阻礙霜霉菌的侵染發(fā)揮了重要作用[32]。本次通過對人工接菌后的中國野生毛葡萄抗病株系丹鳳-2，感病品種‘白玉霓’‘黑比諾’‘法國藍(lán)’侵染過程的觀察，認(rèn)為丹鳳-2葉背絨毛是其抵抗霜霉菌侵染的屏障。

葡萄生理生化指標(biāo)抗性是其抵御真菌侵染的重要途徑。苯丙氨酸解氨酶基因PAL表達(dá)量和活性的提高能促進(jìn)木質(zhì)素及酚類等次生物質(zhì)的合成，是植物抵抗真菌病害的關(guān)鍵基因[33]。本次實(shí)時(shí)熒光定量分析發(fā)現(xiàn)，中國野生葡萄抗病株系丹鳳-2在接種霜霉菌12 h后苯丙氨酸解氨酶基因PAL表達(dá)量顯著高于易感品種‘黑比諾’與‘白玉霓’；Vannozzi通過基因組學(xué)分析認(rèn)為，芪類物質(zhì)是葡萄抵御霜霉菌侵染的重要植保素之一[34]，Gamm以多個(gè)釀酒葡萄為試材，利用實(shí)時(shí)熒光定量分析技術(shù)發(fā)現(xiàn)多個(gè)抗病品種中的芪合酶基因STS在人工接種霜霉菌后會最先響應(yīng)霜霉菌的誘導(dǎo)[35]，本次實(shí)時(shí)熒光定量分析發(fā)現(xiàn)，丹鳳-2接種霜霉菌后芪合酶基因STS表達(dá)量顯著高于易感品種‘黑比諾’與‘白玉霓’；TLP家族是病程相關(guān)蛋白家族之一，在植物中具有廣譜的抗真菌活性。通過抑制真菌酶活性，使真菌細(xì)胞膜透化，從而起到抵抗真菌侵染的作用[33]。Kortekamp分析多個(gè)抗病品種和易感品種中的PR蛋白編碼基因和苯丙類代謝相關(guān)基因的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，抗病基因在抗病品種和易感品種中的表達(dá)有顯著差異，其中類甜蛋白基因TLP在抗病品種和易感品種中均有顯著表達(dá)[36]。本試驗(yàn)RT-PCR分析發(fā)現(xiàn)，類甜蛋白基因TLP在抗病株系丹鳳-2接種霜霉菌后12 h表達(dá)量顯著提高；趙惠以3個(gè)抗病株系和3個(gè)感病株系為試材，利用實(shí)時(shí)熒光定量分析技術(shù)認(rèn)為，TLP、NPR1在6個(gè)不同株系中響應(yīng)霜霉菌侵染迅速，可能是葡萄調(diào)控霜霉病抗性的關(guān)鍵基因[11]，這與本次實(shí)時(shí)熒光定量分析結(jié)果不同，其原因可能與試材有關(guān)。

綜上，中國野生葡萄、歐洲葡萄、歐美雜種葡萄對霜霉病表現(xiàn)出抗病性差異，其中中國野生葡萄商南-1、湖南-1、商南-2、南鄭-1、白水-40、渭南-3、安林-2、安林-3以及美洲品種‘瑞比爾’‘高妻’與砧木材料‘SO4’對霜霉病有較高的抗性，具有強(qiáng)的抗霜霉菌入侵以及抗病相關(guān)基因的上調(diào)表達(dá)能力。因此，中國野生葡萄抗霜霉病株系商南-1、湖南-1、商南-2、南鄭-1、白水-40、渭南-3、安林-2與安林-3是今后抗病育種可以利用的親本材料與抗病種質(zhì)。