趙一凡，彭文婷，李惠清，郭玉婷，王軍

（中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院葡萄與葡萄酒研究中心/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部葡萄酒加工重點實驗室，北京 100083）

關(guān)鍵字：釀酒葡萄；花色苷；黃酮醇；黃烷-3-醇；揮發(fā)性香氣化合物

類黃酮類化合物是葡萄中重要的酚類物質(zhì)，主要存在于葡萄的外果皮和種子中，包括花色苷、黃酮醇和黃烷醇等，對葡萄和葡萄酒的風(fēng)味具有重要作用?；ㄉ帐羌t葡萄和紅葡萄酒顏色的主要來源，以C6-C3-C6為骨架，C環(huán)上C3位羥基經(jīng)過糖苷化反應(yīng)形成[1]，花色苷可進(jìn)一步被?；揎?，生成乙?；?、香豆?；涂Х弱；幕ㄉ誟2]，極大地豐富了花色苷的種類。黃酮醇主要以糖苷形式存在于葡萄的果皮中，能夠抵御紫外線對葡萄果實的傷害，清除氧自由基[3]，也可以與花色苷結(jié)合形成復(fù)合物，對葡萄酒起到輔色作用[4]。黃烷醇包括黃烷-3-醇單體和聚合黃烷-3-醇（原花色素），主要存在于葡萄的果皮和種子中，是葡萄中含量最豐富的類黃酮類物質(zhì)，賦予葡萄酒以收斂性[5]。

香氣物質(zhì)主要包括萜烯類、吡嗪類、降異戊二烯、醇類、醛酮類和酯類等，是評判葡萄果實和葡萄酒品質(zhì)的重要指標(biāo)之一。在葡萄果實中通常以游離態(tài)和結(jié)合態(tài)兩種形式存在，其中游離態(tài)組分對香氣有直接貢獻(xiàn)，結(jié)合態(tài)香氣沒有揮發(fā)性，但可以在葡萄酒釀造過程中被糖苷酶水解而釋放出游離態(tài)的苷元，通過累加、協(xié)同、抑制等相互作用對葡萄酒的風(fēng)味質(zhì)量和典型性起作用[6]。

類黃酮和香氣物質(zhì)作為評價葡萄和葡萄酒質(zhì)量的重要參數(shù)，其種類和含量受到基因型的影響。山葡萄總花色苷含量遠(yuǎn)高于歐亞雜種，主要為花色苷雙糖苷[7]，不同顏色的葡萄品種中花色苷含量和比例存在差異[8]，不同歐亞種釀酒葡萄酚類物質(zhì)含量也存在差異，各有特點[9-12]，種、品種和營養(yǎng)系之間的差異還導(dǎo)致香氣組成上的不同[13]。我國山葡萄‘雙紅’‘雙優(yōu)’‘雙豐’中C6/C9類揮發(fā)性香氣物質(zhì)含量顯著高于歐亞種葡萄[7]，‘黑比諾’4個營養(yǎng)系的果實香氣中，2,6-二叔丁基對苯醌和n-十六酸的含量有很大差異[14]。除上述內(nèi)因外，類黃酮和香氣物質(zhì)的種類和含量還受到光照[15-16]、水分[17-18]、溫度等[19-21]環(huán)境因素和疏穗[22-23]、摘葉[24-26]、避雨棚[27]等栽培措施的影響。雖然類黃酮及香氣物質(zhì)的組成和含量因受外部環(huán)境因素的影響差別很大，但是不同品種的基因型是造成類黃酮及香氣物質(zhì)存在差異的關(guān)鍵因素。例如，部分葡萄品種的花色苷組成較為穩(wěn)定，不易受年份的影響[28]，而且果皮所含花色苷的種類及比例在一定程度上表現(xiàn)出葡萄的品種特性，因此可在某種條件下利用不同品種花色苷含量和組成的差異來區(qū)分葡萄品種甚至株系[7,29-30]。具有特殊的“黑胡椒”氣味的莎草奧酮是澳洲‘西拉’葡萄所釀造葡萄酒的特征香氣物，莎草奧酮的形成是因為萜烯合成酶基因VvTPS24的等位基因——倍半萜烯合成酶基因VvGuaS在葡萄果實中的不同表達(dá)，從而引起不同品種間萜烯物質(zhì)含量差異[31]。

本研究利用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（HPLC-MS）和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）技術(shù)對‘馬貝克’‘馬瑟蘭’‘美樂’‘小味兒多’和‘西拉’5個歐亞種紅色釀酒葡萄的類黃酮和香氣物質(zhì)進(jìn)行了檢測，分析其類黃酮及香氣物質(zhì)組成和含量差異，為釀酒葡萄品種鑒定和利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

1.1.1 試材

本試驗所用‘馬貝克’‘馬瑟蘭’‘美樂’‘小味兒多’和‘西拉’葡萄果實采自中國農(nóng)業(yè)大學(xué)上莊實驗站智能玻璃溫室（40°08′12″N，116°10′45″E），除‘西拉’為2014年定植外，其余品種均定植于2013年。南北行向，栽培密度為4 m×1 m，主干高度為2.2 m，水平葉幕，每株留梢量為20～40個。

在葡萄果實成熟期（E-L38）進(jìn)行采樣，每個品種隨機(jī)采取300粒發(fā)育良好且無病害的漿果，重復(fù)3次，放于冰盒中迅速運回實驗室。每個樣品一部分用于果實基本理化指標(biāo)的檢測，另一部分液氮速凍后保存于-40 ℃冰箱中，用于果實類黃酮和香氣物質(zhì)的分析。

1.1.2 試劑

色譜級甲醇、甲酸和乙腈，F(xiàn)isher公司；D-(+)-葡萄糖酸δ-內(nèi)酯、二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、(+)-兒茶素、(?)-表兒茶素、(?)-表棓兒茶素、(?)-表兒茶素沒食子酸酯和1-己醇、月桂烯、檸檬烯、里那醇、α-萜品醇、β-香茅醇、檸檬醛、香葉基丙酮、4-甲基-2-戊醇等香氣標(biāo)準(zhǔn)品，Sigma-Aldrich公司；固相萃取柱Cleanert PEP-SPE，Bonna-Agela公司。

1.2 儀器與設(shè)備

手持糖度計：Atago公司；pH計：賽多利斯有限公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海亞榮生化儀器廠；冷凍干燥機(jī)：北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司；Micro 17R離心機(jī)：賽默飛世爾公司；Agilent 1100系列配有二極管陣列檢測器（DAD）的LC/MSD Trap-VL高效液相色譜-離子阱質(zhì)譜聯(lián)用儀、Agilent 1200系列LC/MSD Trap-VL高效液相色譜-三重四級桿質(zhì)譜聯(lián)用儀、Agilent 1200系列配有可變波長檢測器（VWD）的高效液相色譜串聯(lián)Bruker系列離子阱質(zhì)譜聯(lián)用儀、Agilent 6890 GC和Agilent 5975 MS氣相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS）：美國Agilent公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 理化指標(biāo)檢測

每個品種每個生物學(xué)重復(fù)隨機(jī)取100粒漿果，稱量粒質(zhì)量；然后取果汁用于可溶性固形物、pH和可滴定酸等理化指標(biāo)的檢測?？扇苄怨绦挝锖蚿H值分別用手持糖度儀和pH計檢測，可滴定酸用酸堿滴定法測定，以酒石酸當(dāng)量表示，單位g/L。

1.3.2 花色苷和黃酮醇提取與檢測

（1）花色苷和黃酮醇提取。每個品種每個生物學(xué)重復(fù)各取100粒漿果，液氮速凍后，手工剝皮。將剝下的果皮和種子低溫研磨成粉，再放于-40 ℃的真空冷凍干燥機(jī)中冷凍干燥至恒重，并將凍干粉保存于-40 ℃的冰箱待用。

花色苷和黃酮醇的提取參照Downey等[32]。準(zhǔn)確稱取0.100 g果皮干粉放入2 mL離心管中，加入1 mL50%甲醇水溶液，低溫避光超聲萃取20 min后，在4 ℃的條件下8000 r/min離心5 min。然后將上清液轉(zhuǎn)移于新的離心管中，重復(fù)上述操作，將兩次提取的上清液充分混勻并保存在-40 ℃冰箱。

（2）花色苷檢測。采用Agilent 1100系列液相色譜-離子阱質(zhì)譜聯(lián)用儀，色譜柱為Kromasil C18色譜柱，柱溫50 ℃，進(jìn)樣量30 μL，檢測波長525 nm，流速1 mL/min。洗脫流動相A和流動相B分別為水∶甲酸∶乙腈＝92∶2∶6（Vol）和水∶甲酸∶乙腈＝44∶2∶54（Vol）。洗脫程序為：0 min，0% B；1 min，10% B；18 min，25% B；20 min，25% B；30 min，40% B；35 min，70% B；40 min，100% B。

質(zhì)譜采用電噴霧離子源（ESI），正離子模式，離子掃描范圍為100～1500 m/z，霧化器壓力為30 psi，干燥氣流速為10 L/min，溫度為325 ℃，每個樣品重復(fù)進(jìn)樣2次。花色苷定量采用外標(biāo)法，外標(biāo)物為二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷，花色苷含量均以二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷的含量計，單位為mg/kg FW?；ㄉ斩繕?biāo)準(zhǔn)曲線為Y＝59.221X＋16.1128（R2＝0.9989）。

（3）黃酮醇檢測。采用Agilent 1200系列高效液相色譜儀串聯(lián)Bruker系列離子阱質(zhì)譜儀，色譜柱為Zorbax SBC18。柱溫為40 ℃，進(jìn)樣量為50 μL，檢測波長為360 nm。流動相A為乙腈∶甲酸∶水＝50∶85∶865，流動相B為乙腈：甲醇∶甲酸∶水＝250∶450∶85∶215，流動相的流速為0.63 mL/min。洗脫程序如下：0 min，0% B；24.2 min，14.2% B；27 min，15.7% B；33.4 min，18.8% B；39 min，23.5% B；45 min，26% B；47 min，27.4% B；51.6 min，32% B；61.8 min，40% B；67.8 min，100% B；78.4 min，0% B。

質(zhì)譜采用電噴霧離子源（ESI），負(fù)離子模式，離子掃描范圍為0～1000 m/z，霧化氣壓力為30 psi，干燥氣流速為10 L/min，溫度為325 ℃。黃酮醇定量采用外標(biāo)法，外標(biāo)物為槲皮素-3-O-葡萄糖苷，黃酮醇以槲皮素-3-O-葡萄糖苷的含量計，單位為mg/kg FW。黃酮醇定量標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y＝59.029X－42.801（R2＝0.9970）。

1.3.3 黃烷醇提取與檢測

（1）黃烷醇提取。游離黃烷醇提取參照梁娜娜[33]。準(zhǔn)確稱取0.100 g果皮或種子的凍干粉于2 mL離心管中，加入1 mL含0.5%抗壞血酸的70%丙酮水溶液，充分震蕩5 min后在4 ℃的溫度下以8000 r/min離心10 min，后將上清液轉(zhuǎn)移至新的5 mL離心管中。重復(fù)兩次上述步驟，將3次提取的上清液合并，取400 μL加入新的2 mL離心管中，在常溫避光條件下進(jìn)行氮吹直至完全吹干，然后先后加入200 μL含1%鹽酸的甲醇和200 μL的0.2 mol/L乙酸鈉水溶液進(jìn)行溶解、中和，最后將提取液保存于-40 ℃冰箱中待用。

裂解黃烷醇的提取方法參照梁娜娜等[33]。準(zhǔn)確稱取0.050 g果皮或種子的凍干粉于2 mL離心管中，加入500 μL間苯三酚緩沖液（0.5%抗壞血酸，0.3 mol/L鹽酸，50 g/L間苯三酚甲醇），在50 ℃的條件下避光水浴20 min后，加入500 μL的0.2 mol/L乙酸鈉終止反應(yīng)，充分混勻后在4 ℃條件下8000 r/min離心15 min，將上清液轉(zhuǎn)移至新的5 mL離心管中，重復(fù)兩次上述步驟，合并3次提取的上清液，并保存于-40°C的冰箱中待用。

（2）黃烷醇檢測。黃烷醇采用Agilent 1200系列高效液相色譜-三重四級桿質(zhì)譜聯(lián)用儀進(jìn)行定量檢測。色譜柱為Poroshell 120 EC-C18column。柱溫為55 ℃，進(jìn)樣量為1 μL，檢測波長為280 nm，流速為0.4 mL/min。流動相A為0.1%甲酸水溶液，流動相B為含0.1%甲酸的50%甲醇乙腈溶液。洗脫程序如下：0～28 min，10%～46% B；28～29 min，46%～10% B。

質(zhì)譜采用電噴霧離子源，負(fù)離子模式，霧化氣壓力為35 psi，干燥氣流速12 L/h，溫度350 ℃，噴霧電壓4 kV，采用多反應(yīng)監(jiān)測模式（MRM）對目標(biāo)化合物進(jìn)行分析。黃烷醇定量時，4種黃烷醇的含量分別以兒茶素（C）、表兒茶素（EC）、表棓兒茶素（EGC）和表兒茶素沒食子酸酯（ECG）為外標(biāo)物進(jìn)行計算，單位為mg/kg FW。

定量標(biāo)準(zhǔn)曲線，兒茶素：Y＝965.16X＋558.87（Y＜20 000，R2＝0.9997），Y＝526.93X＋17 110（Y≥20000，R2＝0.9972）；表兒茶素：Y＝1407.6X＋929.52（Y＜30 000，R2＝0.9992），Y＝444.48X＋28 086（Y≥30 000，R2＝0.9991）；表兒茶素沒食子酸酯：Y＝2850.6X＋3503.3（Y＜50 000，R2＝0.9981），Y＝710.51X＋137 514（Y≥50 000，R2＝0.9979）；表棓兒茶素：Y＝19.42X－28.647（R2＝0.9981）。

1.3.4 香氣物質(zhì)提取與檢測

（1）香氣物質(zhì)提取。游離態(tài)香氣物質(zhì)提?。簭?40 ℃的冰箱中取出樣品，每個品種取果實50 g，液氮速凍后，除去果柄和種子，加入0.5 g D-(+)-葡萄糖酸內(nèi)酯和2 g聚乙烯聚吡咯烷酮（PVPP）后將果皮和果肉研磨成粉末，并置于4 ℃冰箱中靜置浸提4 h。后在4 ℃下以8000 r/min的轉(zhuǎn)速離心15 min得到澄清葡萄汁，一部分直接用于檢測游離態(tài)香氣，另一部分用于提取糖苷結(jié)合態(tài)香氣物質(zhì)。

結(jié)合態(tài)香氣物質(zhì)的提?。浩咸压麑嵦擒战Y(jié)合態(tài)香氣物質(zhì)的提取參照蘭義賓等[34]。在活化后的固相萃取柱中加入1 mL上述澄清葡萄汁，然后依次加入5 mL的蒸餾水和5 mL的二氯甲烷，最后用20 mL甲醇將結(jié)合態(tài)的香氣物質(zhì)洗脫下來并收集洗脫液至50 mL的圓底燒瓶內(nèi)。用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干上述洗脫液，然后用5 mL 0.2 mol/L檸檬酸/磷酸氫二鈉緩沖液（pH＝5）重新溶解，轉(zhuǎn)移至新離心管中，加入100 μL 100 mg/L的糖苷酶（AR 2000），置于40 ℃培養(yǎng)箱中16 h。

（2）香氣物質(zhì)檢測。利用本實驗室已優(yōu)化的頂空固相微萃取-氣相質(zhì)譜（HS-SPME-GC/MS）聯(lián)用方法分析葡萄果實中的香氣物質(zhì)[35-36]。

將5.0 mL上述提取的澄清葡萄汁加入到20 mL香氣進(jìn)樣瓶中，加入1.00 g NaCl和10 μL 1.0018 mg/mL的內(nèi)標(biāo)溶液（4-甲基-2-戊醇），并迅速用帶有聚四氟乙烯隔墊的蓋子擰緊，置于CTC-PAL自動進(jìn)樣裝置上加熱攪拌30 min。然后將已活化的SPME萃取頭插入進(jìn)樣小瓶的頂空部分，在40 ℃下繼續(xù)加熱攪拌30 min，待揮發(fā)性成分在液體、頂空和SPME三相中達(dá)到平衡時，取出SPME萃取頭，立即插入GC/MS進(jìn)樣口，在250 ℃條件下解析8 min。每個樣品萃取兩次。

所用毛細(xì)管柱為HP-INNOWAX（60 m×0.25 mm ×0.25 μm），載氣為高純氦氣，流速為1 mL/min。升溫程序如下：50 ℃保持1 min，以3 ℃/min升溫至220 ℃保持5 min。其他條件如下：進(jìn)樣口溫度250 ℃，采取不分流模式，電離方式為電子轟擊離子源，電離能70 ev，離子源溫度230 ℃，質(zhì)譜接口溫度280 ℃，質(zhì)量掃描范圍30～350 u。

揮發(fā)性香氣物質(zhì)定性分析根據(jù)NIST08標(biāo)準(zhǔn)譜庫中的保留指數(shù)和質(zhì)譜信息進(jìn)行，采用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量分析。對于有標(biāo)準(zhǔn)品的香氣物質(zhì)根據(jù)其標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量，對于沒有標(biāo)準(zhǔn)品的香氣物質(zhì)利用具有相同化學(xué)結(jié)構(gòu)或相近碳原子數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行相對定量，葡萄果實中香氣物質(zhì)的含量表示為μg/kg FW。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Office Excel 2019軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的整理，平均值、標(biāo)準(zhǔn)差和單因素方差分析均采用SPSS 23.0軟件處理。采用Origin 9.0軟件對果皮中的花色苷和黃酮醇的數(shù)據(jù)進(jìn)行作圖分析。采用SIMCA 14.0進(jìn)行正交偏最小二乘法判別分析（OPLS-DA）。

2 結(jié)果與分析

2.1 果實理化指標(biāo)

表1為供試釀酒葡萄品種成熟期果實的可溶性固形物、pH、可滴定酸和百粒漿果質(zhì)量等基本理化指標(biāo)的檢測結(jié)果。5個釀酒葡萄品種的可溶性固形物含量介于18.35%～21.60%，其中‘西拉’的可溶性固形物最高，‘馬貝克’的可溶性固形物最低，比‘西拉’低3.25%。供試品種果汁pH在3.22～3.69，可滴定酸含量在6.74～9.0 g/L，其中‘美樂’葡萄果實的酸度較高，可滴定酸含量最大，pH較低，為3.32。比較5個品種的漿果質(zhì)量可以看出，‘馬貝克’的百粒漿果質(zhì)量最大（162.39 g），其次是‘西拉’和‘美樂’，而‘馬瑟蘭’和‘小味兒多’的漿果質(zhì)量較小。

表1 五個釀酒葡萄品種果實理化指標(biāo)Table 1 Physiochemical parameters of five winegrape varieties

2.2 花色苷

對5個供試釀酒葡萄品種果皮中不同花色素類花色苷的含量進(jìn)行分析（表2），其中，‘馬瑟蘭’的總花色苷含量最大，為1379.98 mg/kg FW；‘美樂’的總花色苷含量最小，約為‘馬瑟蘭’總花色苷含量的24%，顯著低于其余4個品種。所有供試品種均含有豐富的二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷、二甲花翠素-3-O-乙酰葡萄糖苷和二甲花翠素-3-O-反式香豆酰葡萄糖苷等花色苷，其中‘馬瑟蘭’的二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷的含量最大，為478.53 mg/kg FW。

表2 五個釀酒葡萄品種果皮中花色苷含量Table 2 The anthocyanin content in the skin of five winegrape varieties mg/kg FW

對供試品種果皮花色苷的種類進(jìn)行分析（圖1 A），發(fā)現(xiàn)在檢測到的花青素類、花翠素類、甲基花青素類、甲基花翠素類和二甲基花翠素類等5種類型的花色苷中，所有品種中均以二甲花翠素類花色苷為主，其次為甲基花青素類花色苷或甲基花翠素類花色苷，而花翠素類花色苷和花青素類花色苷的積累量較少。二甲花翠素類花色苷在‘馬貝克’‘馬瑟蘭’和‘小味兒多’中的相對含量較高，而‘美樂’和‘西拉’中二甲花翠素類花色苷的相對含量較低。甲基花青素類的花色苷在‘美樂’和‘西拉’的總花色苷中占較高比例，如‘西拉’中的甲基花青素-3-葡萄糖苷的含量為352.09 mg/kg FW，顯著高于其他品種，是它們的4～6倍，占到總花色苷含量30%以上，而大多數(shù)品種中的花青素類花色苷或花翠素類花色苷的含量低于30 mg/kg FW，且不足總花色苷含量的3%，品種間差異明顯。

圖1 五個釀酒葡萄品種果皮花色苷種類（A）、?；愋停˙）、產(chǎn)生路徑（C）和甲基化類型（D）占比Figure 1 Composition of anthocyanins in the skin of five wine grape varieties

由圖1 B可知，不同種類酰化花色苷含量存在較大差異，所有供試品種中的酰化花色苷含量均占到總花色苷含量的一半以上，其中‘馬貝克’和‘西拉’的?；ㄉ照急容^大，其次為‘小味兒多’，而‘馬瑟蘭’和‘美樂’的?；ㄉ盏恼急容^小。在花色苷?；愋蜕希Х弱；幕ㄉ障鄬τ谝阴；拖愣辊；幕ㄉ照急茸钚。R貝克’和‘馬瑟蘭’中幾乎未檢測到咖啡?；幕ㄉ眨R貝克’和‘西拉’中香豆?；ㄉ账嫉谋壤哂谝阴；?，分別是乙?；ㄉ盏?倍和2倍，而‘馬瑟蘭’‘美樂’和‘小味兒多’的乙?；ㄉ账嫉谋壤哂谙愣辊；ㄉ眨嫉娇偦ㄉ蘸康?0%左右。

根據(jù)花色素B環(huán)上取代基的位置和數(shù)量，可將花色苷分為兩類：由花青素、甲基花青素及其?；ㄉ战M成的3'-OH取代的花色苷衍生物和由花翠素、甲基花翠素、二甲基花翠素及其?；ㄉ战M成的3'5'-OH取代的花色苷衍生物。如圖1 C所示，‘馬貝克’和‘馬瑟蘭’F3'5'H路徑的花色苷占比較大，即花翠素衍生物的積累大于花青素衍生物的積累，果實顏色更偏向藍(lán)色色調(diào)，而‘美樂’和‘西拉’中F3'H路徑的花色苷占比較大，花青素衍生物的積累量較為豐富。

如圖1 D所示，不同品種花色苷的甲基化程度也存在較大差異，‘馬貝克’花色苷的甲基化程度顯著高于其他品種。

2.3 果皮黃酮醇

由表3可知，‘馬瑟蘭’的總黃酮醇含量最高，為132.32 mg/kg FW；‘美樂’的總黃酮醇含量顯著低于其他品種，僅為其他品種的34%～59%。在所有種類的黃酮醇中，‘馬貝克’‘美樂’‘小味兒多’和‘西拉’的槲皮素-3-O-半乳糖苷含量較高，為10.63～36.56 mg/kg FW，而山奈酚-3-O-葡萄糖半乳糖苷的含量較低，在6 mg/kg FW以下。

在檢測出的山奈酚類、槲皮素類、異鼠李素、楊梅酮類、西伯利亞落葉松黃酮和丁香亭等6類黃酮醇中（圖2 A）均以槲皮素類為主，為23.21～81.23 mg/kg FW，占到其黃酮醇總量的48%～62%，其次為山奈酚類或楊梅酮類，而異鼠李素、西伯利亞落葉松黃酮和丁香亭的含量較低，大多在10 mg/kg FW以下。此外，‘馬貝克’中積累了較為豐富的山奈酚類黃酮醇，是除‘小味兒多’外其余3個品種的5～6倍，約占黃酮醇總量的24%，表明其F3'H路徑的黃酮醇較為豐富。

結(jié)合表3和圖2 B可知，‘小味兒多’的丁香亭和楊梅酮類黃酮醇的含量顯著低于其他品種，均低于5 mg/kg FW，且其F3'5'H路徑的產(chǎn)物積累較少，僅約為總黃酮醇含量的13%，而其他品種該路徑所產(chǎn)生的黃酮醇均占到總黃酮醇含量的25%以上。5個供試品種F3'H路徑黃酮醇約占總黃酮醇的50%～72%，F(xiàn)3'H路徑的黃酮醇在‘馬瑟蘭’和‘小味兒多’中積累較為豐富，而在‘馬貝克’中的積累量顯著較低。

表3 五個釀酒葡萄品種果皮黃酮醇含量Table 3 The flavonol content in the skin of five wine grape varieties mg/kg FW

圖2 C中‘馬貝克’黃酮醇的甲基化修飾程度較低，其甲基化的黃酮醇只占到黃酮醇總量的15%左右。與之相比，‘馬瑟蘭’和‘美樂’黃酮醇的甲基化程度較高，其甲基化黃酮醇的占比均大于20%。

圖2 五個葡萄品種果皮中黃酮醇種類（A）、產(chǎn)生路徑（B）和甲基化類型（C）占比Figure 2 Composition of flavonols in the skin of five winegrape varieties

2.4 果皮和種子中黃烷-3-醇分析

對5個供試品種果皮和種子中黃烷-3-醇進(jìn)行定性定量分析，結(jié)果如表4和表5所示。果皮和種子中的黃烷-3-醇分為游離單元、起始單元和延伸單元，其中延伸單元占比最大，其占到果皮中總黃烷-3-醇含量的90%以上，在種子中也得到類似的結(jié)果。游離單元在果皮總黃烷-3-醇含量中的占比最小，不足1%，且含量僅為9～22 mg/kg FW。

表4 五個釀酒葡萄品種果皮黃烷-3-醇含量Table 4 The flavanol-3-ol content in the skin of five wine grape varieties mg/kg FW

表5 五個釀酒葡萄品種種子黃烷-3-醇含量Table 5 The flavanol-3-ol content in the seed of five wine grape varieties mg/kg FW

果實中的總黃烷-3-醇主要以表兒茶素為主，含量最為豐富，而兒茶素、表棓兒茶素和表兒茶素沒食子酸酯的含量相對較少。分析果皮和種子中的總黃烷-3-醇含量，‘馬貝克’‘西拉’和‘小味兒多’果皮中的總黃烷-3-醇含量較為豐富，而種子中的總黃烷-3-醇含量較少。與之相反，‘馬瑟蘭’和‘美樂’果皮中的總黃烷-3-醇含量顯著低于其他品種，而種子中卻含有相對較多的黃烷-3-醇。

平均聚合度為起始單元和延伸單元的總摩爾數(shù)與起始單元摩爾數(shù)的比值。不同品種果皮中黃烷-3-醇的平均聚合度存在顯著差異，其中‘小味兒多’果皮中的黃烷-3-醇的平均聚合度最高（67.9），約為其余品種的2～3倍，而‘馬瑟蘭’果皮中黃烷-3-醇的平均聚合度僅為23.33，平均聚合度最低。由此可見，5個供試品種果皮黃烷-3-醇的平均聚合度均高于種子，而種子中黃烷-3-醇的平均聚合度均未達(dá)到20。

2.5 香氣物質(zhì)含量和組成

游離態(tài)香氣物質(zhì)具有揮發(fā)性，其對葡萄的香氣有直接的貢獻(xiàn)，而非揮發(fā)性的結(jié)合態(tài)香氣，在葡萄酒釀造過程中經(jīng)酶解或酸解可以釋放出具有揮發(fā)性的物質(zhì)，對香氣有潛在的貢獻(xiàn)。如表6所示，5個供試品種中檢測到的香氣物質(zhì)均以游離態(tài)香氣為主，其中‘馬貝克’的游離態(tài)香氣積累最為豐富，達(dá)到10 991.38 μg/kg FW，而‘美樂’的游離態(tài)香氣含量顯著低于‘馬貝克’，為5475.03 μg/kg FW。

游離態(tài)香氣物質(zhì)中，C6/C9類的醛、醇和酯來源于酶促脂質(zhì)氧化路徑，可賦予葡萄和葡萄酒典型的草本植物味和青草味，也被稱為綠葉氣味物質(zhì)[37]。從表6可以看出，在游離態(tài)香氣物質(zhì)中，C6/C9類含量最為豐富，除‘馬瑟蘭’外，所有供試品種的C6/C9類游離態(tài)香氣物質(zhì)均占到總游離態(tài)香氣的85%以上，而C6/C9類的結(jié)合態(tài)類香氣僅占到總結(jié)合態(tài)香氣的12%～25%。‘馬瑟蘭’‘美樂’和‘西拉’均含有較多的游離態(tài)和結(jié)合態(tài)萜烯物質(zhì)，顯著高于‘馬貝克’和‘小味兒多’。降異戊二烯類包括β-大馬士酮、β-紫羅蘭酮、茶螺烷和香葉基丙酮等物質(zhì)，其感官閾值極低，是葡萄品種香的重要貢獻(xiàn)者[4,36]，游離態(tài)和結(jié)合態(tài)降異戊二烯類香氣在所有品種中的含量均低于50 μg/kg FW，積累量很少。醇類對于葡萄的香氣也有貢獻(xiàn)，在5個歐亞種葡萄品種中，‘美樂’中游離態(tài)醇類含量僅5.18 μg/kg FW，其它品種均在280 μg/kg FW左右；對結(jié)合態(tài)醇類物質(zhì)來說，‘馬貝克’‘小味兒多’和‘西拉’中該類物質(zhì)的含量顯著高于‘馬瑟蘭’和‘美樂’，均在1400 μg/kg FW以上。酯類物質(zhì)可賦予葡萄和葡萄酒花香和成熟的果香[38]。就酯類而言，大部分品種的游離態(tài)和結(jié)合態(tài)酯類香氣的含量均＞500 μg/kg FW，而且游離態(tài)酯類的含量均高于結(jié)合態(tài)酯類，其中‘馬貝克’游離態(tài)酯類的含量最高，達(dá)到1017.08 μg/kg FW。

表6 五個釀酒葡萄品種果實游離態(tài)和結(jié)合態(tài)香氣物質(zhì)含量Table 6 Free and bound aroma compounds content in the berries of five wine grape varieties μg/kg FW

綜上所述，不論是游離態(tài)香氣還是結(jié)合態(tài)香氣，不同種類的香氣在不同釀酒葡萄品種的含量和組成均存在較大差異，是區(qū)分葡萄品種的重要指標(biāo)。

2.6 類黃酮和香氣物質(zhì)OPLS-DA分析

利用OPLS-DA分別對5個供試品種成熟期葡萄果實類黃酮和香氣物質(zhì)進(jìn)行分析，所得OPLS-DA模型顯示不同供試品種之間存在區(qū)別，通過S-plot圖進(jìn)行品種間差異物質(zhì)篩選，得到VIP值＞1.5的類黃酮和香氣物質(zhì)如表7所示，這些物質(zhì)對于區(qū)分供試品種起到重要作用。

由表7可知，‘馬貝克’VIP值＞1.5的特征物質(zhì)有4-甲基愈創(chuàng)木酚、結(jié)合態(tài)異胡薄荷醇、結(jié)合態(tài)萜烯類、游離態(tài)己烯醛、游離態(tài)C6/C9類等香氣物質(zhì)和果皮黃烷醇和果皮表兒茶素等類黃酮物質(zhì)，其中果皮中黃烷醇和游離態(tài)(E)-2-己烯醛、游離態(tài)C6/C9類在‘馬貝克’中更高；‘馬瑟蘭’VIP值＞1.5的特征物質(zhì)有果皮和種子中黃烷醇、種子中表兒茶素和表棓兒茶素沒食子酸酯的延伸單元、二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷、二甲花翠素-3-O-乙酰葡萄糖苷、總花色苷以及結(jié)合態(tài)醇類等，其中果皮和種子中黃烷醇、二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷、二甲花翠素-3-O-乙酰葡萄糖苷、總花色苷等類黃酮物質(zhì)在‘馬瑟蘭’中含量更高；‘美樂’VIP值＞1.5的特征物質(zhì)有總花色苷、種子中黃烷醇和表兒茶素延伸單元、果皮中黃烷醇、游離態(tài)己烯醛、游離態(tài)C6/C9類、游離態(tài)酯類、游離態(tài)醇類、結(jié)合態(tài)苯乙醇和結(jié)合態(tài)醇類。除種子中黃烷醇外，其他特征物質(zhì)含量均較低；‘小味兒多’VIP值＞1.5的特征物質(zhì)有果皮中黃烷醇總量、果皮中表兒茶素延伸單元、游離態(tài)C6/C9類、結(jié)合態(tài)醇類、酯類、萜烯和其他香氣等； ‘西拉’VIP值＞1.5的特征物質(zhì)有種子中黃烷醇、表兒茶素延伸單元、4-甲基愈創(chuàng)木酚、結(jié)合態(tài)苯乙醇、結(jié)合態(tài)醇類和結(jié)合態(tài)其他類香氣等。4-甲基愈創(chuàng)木酚、結(jié)合態(tài)苯乙醇、結(jié)合態(tài)醇類和結(jié)合態(tài)其他類香氣物質(zhì)含量，4-甲基愈創(chuàng)木酚和結(jié)合態(tài)苯乙醇可以作為‘西拉’區(qū)別于其他品種的特征香氣物質(zhì)。

表7 五個釀酒葡萄特征類黃酮和香氣物質(zhì)VIP值Table 7 VIP value of characteristic flavonoids and aroma substances of five wine grapes

綜上可知，OPLS-DA可以篩選出各釀酒葡萄果實的特征物質(zhì)，將不同品種區(qū)分開來。

3 討論與結(jié)論

不同釀酒葡萄品種的類黃酮及香氣物質(zhì)的含量和組成存在較大差異，可作為區(qū)分葡萄品種的依據(jù)。邢婷婷等[12]研究結(jié)果表明，14個歐亞種釀酒葡萄的花色苷組成和含量存在明顯差異，可作為化學(xué)指紋區(qū)分不同品種，例如，‘西拉’和‘馬瑟蘭’總花色苷含量最高，‘馬貝克’花青素類花色苷含量較低，‘黑比諾’二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷的含量最大，但不含?；ㄉ眨R貝克’和‘西拉’的?；ㄉ辗e累量較豐富。李琪等[9]利用HPLC法檢測甘肅地區(qū)9個釀酒葡萄的組成和含量，其結(jié)果中‘美樂’總花色苷含量最高。在本試驗中，‘馬瑟蘭’的總花色苷含量最高，‘美樂’的總花色苷含量最低，可能是因為不同地區(qū)環(huán)境因素和栽培措施的影響，‘馬貝克’花色苷的甲基化和酰基化程度較高，與前人研究結(jié)果一致。姜文廣等[39]結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用和氣相色譜-聞香技術(shù)對‘蛇龍珠’‘赤霞珠’‘品麗珠’和‘美樂’等葡萄果實中的揮發(fā)性香氣進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)不同葡萄品種香氣的種類相似，但香氣的強(qiáng)度存在較大差異。本試驗中，不同品種不同類別香氣物質(zhì)含量和組成存在差異，其中，‘馬貝克’游離態(tài)香氣含量最高，C6/C9類香氣物質(zhì)豐富，‘馬瑟蘭’C6/C9類游離態(tài)香氣物質(zhì)含量較少，‘馬瑟蘭’‘美樂’和‘西拉’均含有較多的游離態(tài)和結(jié)合態(tài)萜烯物質(zhì)，‘美樂’游離態(tài)醇類物質(zhì)的積累量顯著低于其他品種，‘小味兒多’和‘西拉’結(jié)合態(tài)醇類的含量顯著高于‘馬瑟蘭’和‘美樂’。利用OPLS-DA模型能夠?qū)⑺衅贩N完全區(qū)分。

本研究以中國農(nóng)業(yè)大學(xué)上莊實驗站玻璃溫室種植的‘馬貝克’‘馬瑟蘭’‘美樂’‘小味兒多’‘西拉’等5個品種為實驗材料，測定成熟期釀酒葡萄果實類黃酮和香氣物質(zhì)組成和含量。結(jié)果表明，除‘美樂’外，其他品種均含有豐富的花色苷，‘馬貝克’‘馬瑟蘭’中黃酮醇和黃烷醇含量較高，‘馬貝克’游離態(tài)C6/C9類、游離態(tài)酯類和結(jié)合態(tài)酯類香氣含量最高，‘馬瑟蘭’結(jié)合態(tài)萜烯含量最高，‘小味兒多’游離態(tài)和結(jié)合態(tài)降異戊二烯類、游離態(tài)醛酮類香氣含量最高，‘西拉’游離態(tài)萜烯和醇類香氣含量最高?！R貝克’‘馬瑟蘭’‘小味兒多’‘西拉’表現(xiàn)較好，具有種植潛力。