邢會(huì)香 張學(xué)花 劉紅 肖秋霞 朱海俊 郭靜

(青海普蘭特藥業(yè)有限公司，青海 西寧 810000)

白術(shù)是常用的補(bǔ)益藥，為菊科植物白術(shù)(AtractylodesmacrocephalaKoidz.)的干燥根莖，性溫，味甘、苦[1]，具有健脾益氣、燥濕利水、止汗、安胎的功效，可用于脾虛食少，腹脹泄瀉，痰飲眩悸，水腫，自汗，胎動(dòng)不安[2]。白術(shù)的化學(xué)成分主要有揮發(fā)油、多糖、內(nèi)酯類成分等[3]，內(nèi)酯類成分具有抗炎、抗癌、促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)吸收和調(diào)節(jié)胃腸道功能的作用[4]，《中華人民共和國藥典》2015年版[5]與2020年版[2]白術(shù)藥材項(xiàng)下均未有含量檢測項(xiàng)，故本研究選擇白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ、Ⅲ為研究對(duì)象并建立其在白術(shù)中的含量測定方法。相關(guān)文獻(xiàn)含量多以HPLC測定白術(shù)內(nèi)酯類成分[6-9]，HPLC進(jìn)樣體積大、流速大、分析時(shí)間長，本研究采用UPLC-PDA測定白術(shù)內(nèi)酯類成分，較HPLC更節(jié)省時(shí)間、溶劑，且能通過峰純度準(zhǔn)確排除陰性干擾，提高檢測靈敏度、縮短檢驗(yàn)周期。采用本研究方法分析了16批市場主流藥材的質(zhì)量情況，也為藥材的資源評(píng)價(jià)和合理使用提供科學(xué)參考。

1 材料

1.1儀器 ACQUITY UPLC H-CLASS超高液相色譜儀(ACQUITY UPLC PDA eLambda檢測器，Waters)；MS105型(十萬分之一)電子分析天平(METTLER TOLEDO)；ML-204T-02型(萬分之一)電子分析天平[梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司]；JP-080ST型超聲清洗儀(深圳市潔盟清洗設(shè)備有限公司有限公司)；TG16-WS型高速離心機(jī)(常州金壇良友儀器有限公司)。

1.2藥材與試劑 白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ?qū)φ掌?中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：111976-201501，純度：99.9%)；白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ對(duì)照品(中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：111978-201501，純度：99.9%)；白術(shù)藥材共16批次，經(jīng)鑒定均為菊科植物白術(shù)AtractylodesmacrocephalaKoidz.的干燥根莖；甲醇、乙腈均為進(jìn)口色譜純，磷酸等其他試劑均為分析純，水為屈臣氏蒸餾水。

2 方法與結(jié)果

2.1色譜條件[10-15]色譜柱：CORTECS UPLC T3(100×2.1 mm，1.6 μm)；流速為0.35 mL·min-1；檢測波長為220 nm；進(jìn)樣量為5 μL;以乙腈為流動(dòng)相A，以0.1%磷酸溶液為流動(dòng)相B,按照表1進(jìn)行梯度洗脫。理論板數(shù)按白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ峰計(jì)算應(yīng)不低于4500。

表1 梯度洗脫程序

2.2溶液的制備

2.2.1空白溶液 70%甲醇水溶液。

2.2.2對(duì)照品溶液 精密稱定白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ?qū)φ掌?0.54 mg、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ對(duì)照品10.42 mg分別置于100 mL容量瓶中，加70%甲醇水溶液使溶解并定容至刻度，搖勻，分別精密移取上述溶液各10 mL置于同一100 mL容量瓶中，加70%甲醇水溶液定容至刻度，搖勻，即得。

2.2.3供試品溶液 取本品粉末(過三號(hào)篩)約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇水溶液50 mL，稱定重量，超聲處理10分鐘，放冷，再稱定重量，用70%甲醇水溶液補(bǔ)足減失的重量，搖勻，離心(10000 r·min-1，5 min)，濾過，取續(xù)濾液，即得，進(jìn)樣前用0.22 μm微孔濾膜過濾。

2.3系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 按照2.2方法分別制備得到對(duì)照品溶液和供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，記錄色譜。結(jié)果顯示對(duì)照品連續(xù)進(jìn)樣5針，白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ和白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ峰面積的RSD分別為0.1%、0.1%，保留時(shí)間的RSD分別為0.3%、0.4%，對(duì)照品和供試品溶液中白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ和白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ色譜峰與前后雜質(zhì)峰分離度均大于1.50，白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ色譜峰的理論塔板數(shù)均不小于4500，提示該色譜系統(tǒng)適用性良好。

2.4專屬性試驗(yàn) 按照2.2方法分別制備得到空白溶液、對(duì)照品溶液、供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，記錄色譜，見圖1。結(jié)果顯示空白溶液對(duì)主色譜峰無干擾，對(duì)照品和供試品溶液中主色譜峰保留時(shí)間一致。另采用PDA檢測器對(duì)對(duì)照品溶液、供試品溶液中的主色譜峰進(jìn)行峰光譜掃描和純度檢測。結(jié)果顯示對(duì)照品和供試品溶液中主色譜峰純度角度小于純度閾值，純度符合要求，具體數(shù)據(jù)見表2，本試驗(yàn)提示該方法專屬性良好。

注：A.空白溶液；B.白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ和白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ對(duì)照品；C.供試品溶液；1.白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ；2.白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ

表2 白術(shù)和對(duì)照品主色譜峰純度角度和純度閾值列表

2.5線性關(guān)系考察

2.5.1白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ?qū)φ掌肪€性關(guān)系考察 精密稱定白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ?qū)φ掌?0.54 mg，加70%甲醇水溶液制成105.3 μg·mL-1的白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ?qū)φ掌纺敢骸７謩e精密量取適量上述母液，稀釋配制成濃度為0.4212、2.106、10.53、31.59、52.65 μg·mL-1的系列對(duì)照品溶液。按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，記錄色譜。以質(zhì)量濃度(X,μg·mL-1)為橫坐標(biāo)、峰面積(Y)為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性擬合，得回歸方程Y=56920X+19.391(r=1.0000)。結(jié)果表明，白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ在0.4212～52.65 μg·mL-1線性關(guān)系良好。

2.5.2白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ對(duì)照品線性關(guān)系考察 精密稱定白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ對(duì)照品10.42 mg，加70%甲醇水溶液制成104.1 μg·mL-1的白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ對(duì)照品母液。分別精密量取適量上述母液，稀釋配制成濃度為0.4164、2.082、10.41、31.23、52.05 μg·mL-1的系列對(duì)照品溶液。按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，記錄色譜。以質(zhì)量濃度(X,μg·mL-1)為橫坐標(biāo)、峰面積(Y)為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性擬合，得回歸方程Y=37992X+20.82(r=1.0000)。結(jié)果表明，白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ在0.4164～52.05 μg·mL-1線性關(guān)系良好。

2.6重復(fù)性試驗(yàn) 由實(shí)驗(yàn)員(甲)分別取白術(shù)(河北省保定市安國西伏落鎮(zhèn)，批號(hào)：B201)藥材粉末(過三號(hào)篩)約0.5 g，平行6份樣品，精密稱定，按照2.2.3方法制備得到6份供試品溶液。按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，記錄色譜。結(jié)果白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ和白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ平均含量分別為0.069%和0.050%，RSD分別為1.1%、1.1%，提示該方法重復(fù)性良好。

2.7中間精密度試驗(yàn) 由另外一名實(shí)驗(yàn)員(乙)分別取白術(shù)藥材粉末(過三號(hào)篩)約0.5 g，平行6份樣品，精密稱定，按照2.2.3方法制備得到6份供試品溶液。按2.1項(xiàng)下色譜條件用另一臺(tái)G18QSM448A超高液相色譜儀進(jìn)行測定，記錄色譜。結(jié)果甲乙兩名實(shí)驗(yàn)員在不同儀器上測得白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ和白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ含量的RSD分別為2.4%、3.6%，提示該方法中間精密度良好，具體數(shù)據(jù)見表3。

表3 中間精密度試驗(yàn)結(jié)果(n=9)

2.8加樣回收試驗(yàn) 取已知含量的白術(shù)藥材粉末(過三號(hào)篩)約0.25 g，平行9份樣品，分為3組，分別加入3個(gè)質(zhì)量分?jǐn)?shù)水平(50%、100%和150%)的白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ和白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ對(duì)照品。按照2.2.3項(xiàng)下溶液制備方法制備得到9份供試品溶液。按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，記錄色譜并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表4。

表4 回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=9)

2.9穩(wěn)定性試驗(yàn) 取2.2.3項(xiàng)下供試品溶液適量，分別置于室溫下放置0、1、2、4、6、8、12、24 h時(shí)按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，記錄色譜。結(jié)果供試品中白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ和白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ色譜峰峰面積的RSD值分別為1.2%和0.7%。結(jié)果表明供試品在70%甲醇水溶液中24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好，具體數(shù)據(jù)見表5。

表5 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

2.10耐用性試驗(yàn) 本研究中耐用性試驗(yàn)是通過微調(diào)測試條件中的單個(gè)變量觀察結(jié)果的不受影響程度，改變的測試變量包括流動(dòng)相組成、流速、柱溫、色譜柱。結(jié)果表明該方法耐用性良好，具體數(shù)據(jù)見表6。

表6 耐用性試驗(yàn)結(jié)果

2.11樣品含量測定 取16批次白術(shù)樣品適量，按照2.2.3方法制備供試品溶液，再按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，雙樣雙針，記錄色譜并計(jì)算樣品含量，結(jié)果見表7。

表7 白術(shù)樣品中白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ和白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ含量測定結(jié)果(n=2)

3 討論

3.1檢測波長的選擇 對(duì)白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ和白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ對(duì)照品溶液分別進(jìn)行190～400 nm掃描，結(jié)果白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ在221 nm處有最大吸收，白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ在193,220 nm處有最大吸收，兼顧白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ和白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ的最大吸收，最終選擇220 nm為檢測波長。

3.2色譜條件的選擇 本研究考察了柱溫、流速、進(jìn)樣體積對(duì)色譜峰分離的效果，結(jié)果當(dāng)柱溫30 ℃、流速0.30 mL·min-1、進(jìn)樣體積10 μL時(shí)峰形均未達(dá)到要求，柱溫40 ℃、流速0.35 mL·min-1、進(jìn)樣體積5 μL時(shí)峰形符合要求。

3.3提取條件的選擇 查閱文獻(xiàn)，提取條件有甲醇、乙醇等溶劑超聲或回流處理[9,16-20]，故本研究考察了不同比例和不同類別的提取溶劑(30%、50%、70%甲醇水溶液，50%乙腈水溶液和50%乙醇水溶液)進(jìn)行提取，同時(shí)考察了不同提取方式(超聲和回流)、不同提取時(shí)間(10、20、30 min)和不同溶劑量(10、25、50、100 mL)對(duì)白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ和白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ含量的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)提取溶劑和溶劑量對(duì)結(jié)果有較顯著的影響，而提取方式和提取時(shí)間對(duì)含量結(jié)果影響較小，因此最終確定最佳提取條件為50 mL 70%甲醇水溶液超聲提取10 min。

3.4不同產(chǎn)地藥材質(zhì)量的差異 本研究采用UPLC-PDA對(duì)浙江省、河北省、安徽省不同地區(qū)的白術(shù)藥材同時(shí)測定了白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ和白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ的含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)16批藥材中浙江省金華市磐安縣玉山鎮(zhèn)和安徽省亳州市譙城區(qū)古井鎮(zhèn)的白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ和白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ總含量較高，但該兩個(gè)省其它地區(qū)藥材含量均參差不齊，差異較大，只有產(chǎn)地河北的整體均一性較好。雖白術(shù)為浙江省的道地藥材，但整體含量偏低的較多，這可能與藥材采收時(shí)間、生長年限等因素有關(guān)。

綜上所述，該方法操作簡單，節(jié)省成本，可以同時(shí)測定白術(shù)中白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ和白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ的含量且重復(fù)性、準(zhǔn)確度及耐用性良好，本研究為今后中國藥典增加含量測定指標(biāo)，控制白術(shù)藥材質(zhì)量奠定了良好的基礎(chǔ)。