李元鵬 張英杰 張京偉 郭文姣 劉學(xué)慶 孫紀(jì)霞*

（1煙臺(tái)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，煙臺(tái) 264005；2山東省煙臺(tái)市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，煙臺(tái) 265500）

在影響蘋果產(chǎn)量、品質(zhì)和商品率的諸多因素中，蘋果病毒病是重要原因之一[1]，制約了蘋果產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[2]。全球的蘋果病毒有40多種，且多為復(fù)合感染，目前尚無防治蘋果病毒病的有效藥劑，生產(chǎn)上應(yīng)用脫毒苗木是最有效的方法。國內(nèi)科研院所已通過莖尖法和微體嫁接法獲得了富士、嘎拉等蘋果品種的脫毒原種苗，并建立了脫毒蘋果品種保存圃。從脫毒苗保存圃剪取接穗，通過組織培養(yǎng)進(jìn)行快速繁育，可在短時(shí)間內(nèi)獲得大量脫毒種苗，現(xiàn)將脫毒苗組培快繁技術(shù)介紹如下。

1 初代培養(yǎng)

當(dāng)脫毒品種1年生枝條新生芽長(zhǎng)至2 cm左右時(shí)將其剪下，除去展開的新生葉片，置于流動(dòng)的自來水下沖洗7 h，用75%(V/V)的酒精浸泡8 s，然后用0.1%的氯化汞（HgCl2）消毒處理10 min，最后用無菌水沖洗5次。將消毒后的莖尖接種到滅菌后的培養(yǎng)基上，配方為2/3MS+0.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+30 g/L蔗糖+6 g/L瓊脂 （可再加500 mg/L PVP降低污染率），pH調(diào)至5.8后分裝到潔凈的培養(yǎng)瓶中，每瓶約50 mL。然后在121℃的高壓滅菌鍋中滅菌25 min。滅菌完成后，待培養(yǎng)基凝固，在超凈工作臺(tái)上接種莖尖，每瓶接種3～5個(gè)。接種完成后，置于溫度 26 ℃、光強(qiáng) 35 μmol·m-2·s-1、光照14 h/d的條件下培養(yǎng)15 d，期間除去褐化和污染的莖尖。

2 繼代培養(yǎng)

將初代培養(yǎng)獲得的生長(zhǎng)良好的莖尖接種到MS+0.6 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+30 g/L蔗糖+6 g/L瓊脂，pH為5.8的繼代培養(yǎng)基上，參照初代培養(yǎng)的操作分裝、滅菌。然后在超凈工作臺(tái)上接種，每瓶接種3株，培養(yǎng)環(huán)境與初代培養(yǎng)一致。若需獲得較多數(shù)量的不定芽，可以適當(dāng)縮短光照時(shí)間[3]。

3 生根培養(yǎng)

選取生長(zhǎng)健壯、株高3 cm左右的繼代培養(yǎng)植株，接種在1/2 MS+0.25 mg/L IBA+20 g/L蔗糖+6.8 g/L瓊脂，pH為5.8的的生根培養(yǎng)基上，每瓶接種3株，培養(yǎng)環(huán)境與初代培養(yǎng)一致。

4 煉苗及移栽

組培苗根系長(zhǎng)度大于2 cm后，在使用60%遮陰網(wǎng)遮陰的溫室內(nèi)，保持溫度20～25℃、相對(duì)濕度60%左右，煉苗10 d。然后打開瓶口，自然光下煉苗5 d。將附著在組培苗根部的培養(yǎng)基和雜質(zhì)清洗干凈，用百菌清浸泡10 min，再用流水沖洗4 min，最后栽種在基質(zhì)組成為蛭石∶草炭∶營養(yǎng)土為 2∶2∶1的苗床上。 移栽后7 d噴0.1%百菌靈，后期正常管理，30 d后統(tǒng)計(jì)成活情況。對(duì)于移栽后不易成活的品種，可采用水培煉苗，即將洗凈的株系置于含1／2霍格蘭德營養(yǎng)液的瓶中，自然光下帶瓶蓋煉苗2周，然后揭開瓶蓋置于全營養(yǎng)液的瓶中，每周更換1次營養(yǎng)液，自然光下煉苗5周后移栽。