郭廷賢，陸無畏，郭芳芳

(東南大學附屬中大醫(yī)院 燒傷整形科，江蘇 南京 210009)

脂肪干細胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)是一種間充質(zhì)干細胞，是從脂肪組織中分離得到的一種具有自我更新和多向分化潛能的干細胞。已證實ADSCs可分化成多種細胞譜系，具備修復、維護或增強各種組織的潛力[1-2]。ADSCs來源豐富，分離、鑒定與培養(yǎng)較易操作，不存在應(yīng)用胚胎干細胞時的倫理道德問題[3]。與其他干細胞比較，ADSCs在實際應(yīng)用方面有著獨特優(yōu)勢，是理想的血管內(nèi)皮細胞(vascular endothelial cells,VECs)來源。創(chuàng)面修復狀況會影響患者生活質(zhì)量，一直是外科學中的熱點問題。VECs能促進受損組織血運重建及受損器官功能恢復[4]，但其來源是臨床應(yīng)用的瓶頸。研究證實ADSCs在特定條件下可分化為VECs，將獲得的細胞注入受損組織可加快創(chuàng)面修復[5]。

1 ADSCs與VECs的鑒定

1.1 ADSCs的鑒定

ADSCs與其他間充質(zhì)干細胞一樣均表達多向分化潛能細胞的標記分子，其功能的發(fā)揮在很大程度上依賴于表面表達的分子，同時這種表面標記分子也是鑒定細胞種類的重要標志。2013年，國際脂肪應(yīng)用技術(shù)協(xié)會[6]宣布從人體中分離的ADSCs表型為CD31-/CD34+/CD45-/CD235a-，而經(jīng)體外培養(yǎng)的ADSCs表型為CD31-/CD44+/CD45-/CD73+/CD90+/CD105+。

1.2 VECs的鑒定

VECs作為形成血管壁的細胞，通過參與血管新生、分泌一氧化氮(nitric oxide，NO)等血管舒張因子調(diào)節(jié)血管通透性，與血管中的成分相互作用在維持血管穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮極為重要的作用[7]。對于VECs的鑒定，國內(nèi)外學者大都會從以下3方面[8-10]進行：(1) 形態(tài)學：鏡下成熟VECs具有特征性的鑲嵌狀鋪路石樣形態(tài)。(2) 細胞表面標記：成熟VECs其表型為CD31、血管內(nèi)皮生長因子受體-2(VEGF-R2)、VECs鈣黏連蛋白(VE-Cadherin)表達陽性，同時胞漿內(nèi)血管性血友病因子(von Willebrand factor，vWF)染色陽性。(3) 細胞功能：成熟VECs應(yīng)具備小管形成的能力，分泌NO，并攝取乙?；兔芏戎鞍?acetylated low density lipoprotein，ac-LDL)。

2 ADSCs分化為VECs的誘導方法

誘導ADSCs向VECs分化的方法雖然很多，但主要是培養(yǎng)基誘導培養(yǎng)、共培養(yǎng)以及基因轉(zhuǎn)染3種方法。

2.1 培養(yǎng)基誘導培養(yǎng)

培養(yǎng)基誘導培養(yǎng)多采用直接誘導分化。Colazzo等[9]將培養(yǎng)至第3代ADSCs的培養(yǎng)基中添加50 ng·ml-1的血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)來誘導分化，經(jīng)過7 d的培養(yǎng)，有15%的細胞內(nèi)皮標記物呈陽性，這些細胞也能夠攝取ac-LDL，并在Matrigel成管實驗中形成管狀結(jié)構(gòu)。劉琳等[10]在Colazzo等的實驗基礎(chǔ)上，加入了堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor，b-FGF)進行聯(lián)合誘導培養(yǎng)，經(jīng)過21 d的培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)被誘導的ADSCs的細胞形態(tài)向VECs轉(zhuǎn)化，呈鋪路石樣形態(tài),VECs第Ⅷ因子相關(guān)抗原染色細胞陽性,透射電鏡下可見W-P小體(Weibel-Palade body)。以上都表明在誘導ADSCs向VECs分化時，培養(yǎng)基添加細胞生長因子具有積極的作用。Shang等[11]在誘導ADSCs向VECs分化時，設(shè)計了在培養(yǎng)基添加VEGF和骨形成蛋白-4(bone morphogenetic protein-4，BMP-4)，并聯(lián)合缺氧環(huán)境處理的誘導方法。結(jié)果表明，在添加VEGF的條件下，ADSCs就可以向VECs分化，但是分化率不高，而聯(lián)用BMP-4的細胞組分化程度較高，分化的細胞數(shù)量也顯著增加。值得注意的是，缺氧處理條件下的ADSCs不僅高度表達了VECs標記物，包括 CD31、VEGF-R2 和 VE-Cadherin，還顯示出體外血管生成的潛力，可以攝取ac-LDL并具備體外分泌NO的能力。

研究均顯示，在體外對ADSCs進行培養(yǎng)基定向誘導時VEGF是至關(guān)重要的，其作用促使ADSCs向VECs分化。但值得注意的是，當在培養(yǎng)基繼續(xù)添加血管發(fā)生相關(guān)的其他細胞因子時，ADSCs分化為VECs的程度往往會升高，與此同時獲得的VECs的數(shù)量也會增多[9-11]。

2.2 共培養(yǎng)體系誘導

焦自釗等[12]研究發(fā)現(xiàn)，將ADSCs和VECs以1∶1的比例在培養(yǎng)基上共培養(yǎng)，最終共培養(yǎng)上清液中VEGF、b-FGF濃度明顯高于VECs單獨培養(yǎng)組，同時ADSCs有明顯的向VECs分化趨勢，并具有VECs的形態(tài),研究提示ADSCs可能通過直接分泌或間接作用來促進VECs分泌VEGF、b-FGF等細胞因子，進而影響VECs增殖及血管化，也改變了ADSCs的分化方向。最新研究中，石志康等[13]將兔的ADSCs和VECs共培養(yǎng)接觸，結(jié)果可見體外培養(yǎng)擴增的ADSCs呈梭形生長，VECs形態(tài)多樣，呈鋪路石樣。經(jīng)免疫組化染色分析，發(fā)現(xiàn)ADSCs與VEC共培養(yǎng)組上清夜中VEGF、平滑肌肌動蛋白(alpha-smooth muscle actin，α-SMA)的表達明顯高于單獨培養(yǎng)組,該研究提示我們ADSCs和VECs經(jīng)體外共培養(yǎng)可作為種子細胞參與組織工程用于增加組織血管的生成。

在這些共培養(yǎng)的研究中均發(fā)現(xiàn)共培養(yǎng)上清液可以檢測到VEGF的表達增加，ADSCs可以向VECs分化。

2.3 基因轉(zhuǎn)染定向誘導

關(guān)于使用基因轉(zhuǎn)染技術(shù)來進行定向誘導的方法，李江璇等[14]通過將攜帶 VEGF基因的慢病毒表達載體轉(zhuǎn)染于人ADSCs,檢測其培養(yǎng)基上清液中細胞生長因子的表達，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染VEGF基因后的人ADSCs可以分泌VEGF和b-FGF，培養(yǎng)基的上清液也可以提高VECs的增殖活力和遷移能力。同時還有研究者[15]將含有血小板衍生內(nèi)皮生長因子(platelet derived growth factor，PDGF)基因的慢病毒表達載體轉(zhuǎn)染于兔ADSCs，同時設(shè)置對照組，注入皮下觀察ADSCs的形態(tài)和其表達蛋白，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染了PDGF基因的ADSCs表達PDGF的數(shù)量明顯增加，同時皮下新生血管數(shù)量明顯增加，說明基因轉(zhuǎn)染的方法可促進ADSCs分泌細胞因子，同時促進ADSCs向VECs分化。

以上研究說明ADSCs具有向VECs分化的潛力，是VECs體外來源的理想途徑，誘導過程中VEGF尤為重要。只有對分化機制進行深入研究和探索，才能獲得高分化度、高成熟度、高轉(zhuǎn)化率的血管內(nèi)皮種子細胞，進而為組織工程血管構(gòu)建提供研究基礎(chǔ)。

3 ADSCs分化為VECs的相關(guān)機制

對誘導ADSCs向VECs分化機制的研究很多，近期研究主要涉及調(diào)節(jié)細胞表面蛋白受體、通過細胞攜帶外泌體和影響細胞信號轉(zhuǎn)導通路3個方面。

3.1 通過調(diào)節(jié)ADSCs表面酪氨酸激酶受體來影響分化方向

Mustonen等[16]研究發(fā)現(xiàn)，成熟VECs表面有3類主要的酪氨酸激酶受體及其配體家族(VEGF/VEGFR、Ang/Tie、Ephrin/Eph)，其在血管的生成中起到了相當重要的作用。Cheng等[17]研究發(fā)現(xiàn)，Eph的受體酪氨酸激酶的活化,在VEGF依賴的血管生成中具有重要作用，該實驗結(jié)果還顯示:(1) VEGF能誘導血管內(nèi)皮上酪氨酸激酶受體EphrinA的表達和內(nèi)源性EphA2受體活化磷酸化；(2)如果阻滯EphA受體的活性，會抑制VEGF依賴的血管形成。同時還有研究顯示,EphB的配體EphrinB2能抑制VEGF和血管生成素(angiopoietin-1，Ang-1)誘導的RAS/MAPK信號途徑,從而抑制VEGF和Ang-1誘導的動脈處VECs增殖和遷移[18]，這對動靜脈交界處毛細血管內(nèi)皮正確的形態(tài)學發(fā)生是極為重要的因素。Shang等[11]成功誘導ADSCs向VECs分化，其潛在機制就是在低氧環(huán)境下EphrinB2的去甲基化，影響了后續(xù)相關(guān)的蛋白合成信號通路，促進了ADSCs向VECs的分化，可以進一步認為，影響ADSCs表面受體酪氨酸激酶的活性，可以定向促進ADSCs向VECs分化。

3.2 通過ADSCs外泌體攜帶物質(zhì)來影響分化方向

外泌體是細胞胞膜系統(tǒng)通過主動分泌排出的一種直徑40～150 nm的盤狀小囊泡，同時外泌體具有和其來源細胞相同的生物學功能[19-20]。研究顯示，不同來源的外泌體其合成分泌的RNA具有不同的結(jié)構(gòu),產(chǎn)生特定的生物調(diào)控信息,從而影響機體生理過程[21-22]。張靜等[23]將收集到的ADSCs外泌體注入人臍靜脈VECs的培養(yǎng)液中，發(fā)現(xiàn)實驗組的細胞培養(yǎng)液中VEGF蛋白表達量明顯高于對照組；體外Matrigel成管實驗中，發(fā)現(xiàn)實驗組形成管狀結(jié)構(gòu)明顯增多，提示ADSCs外泌體可以促進血管內(nèi)皮的增殖、遷移及管樣結(jié)構(gòu)形成。而張亞等[24]研究ADSCs分化成VECs前后ADSCs外泌體攜帶的mi-RNA的差異性表達，發(fā)現(xiàn)了數(shù)個mi-RNA通過調(diào)控與干細胞的分化、細胞增殖和細胞周期調(diào)控、生長因子、轉(zhuǎn)錄因子、跨膜蛋白、結(jié)合蛋白等息息相關(guān)的靶基因，從而參與調(diào)控人ADSCs向VECs的分化過程。

以上研究表明，ADSCs外泌體攜帶的不同mi-RNA，通過影響后續(xù)相關(guān)靶基因的表達，可以誘導ADSCs向VECs分化，例如一項來自國外學者的研究就表明誘導前后ADSCs外泌體攜帶的mi-RNA的差異性表達，可以介導靶基因EphrinB2調(diào)控VEGF依賴的血管生成，同時可調(diào)節(jié)纖溶酶和基質(zhì)金屬酶兩種蛋白的活性來調(diào)控ADSCs向VECs分化[25]。

3.3 通過影響ADSCs信號轉(zhuǎn)導通路來影響分化方向

許多研究表明，ADSCs具有多向分化的潛能，通過多種信號通路介導ADSCs可以分化為多種不同的細胞，主要包括成骨細胞、軟骨細胞、神經(jīng)元、平滑肌細胞、淋巴管內(nèi)皮細胞等[26-30]，同時具有向VECs分化的能力。Hellstrom等[31]研究顯示，VEGF信號通路的下游通路Dll4/Notch信號通路在調(diào)控新生血管形成上具有極其重要的意義，這也是VEGF在血管發(fā)生中發(fā)揮重要作用的基礎(chǔ)。而Kim等[32]也發(fā)現(xiàn)，BMP信號通路的下游通路Alk1-BMPRII / ActRII-ID1 / ID3通路在血管新生中起到了重要的調(diào)控作用，這也是Shang等[11]在誘導ADSCs向VECs分化時聯(lián)合使用VEGF和BMP-4的實驗基礎(chǔ)。殷令妮等[33]研究發(fā)現(xiàn)，低氧培養(yǎng)不僅可以刺激ADSCs增殖，還可以促進ADSCs向VECs分化，此過程是由PI3K/Akt信號通路介導發(fā)生，此通路還介導多種細胞因子如VEGF、PDGF的產(chǎn)生，進而促進ADSCs向VECs分化。

4 ADSCs定向分化為VECs的應(yīng)用現(xiàn)狀

近些年來，隨著人們對于誘導ADSCs向VECs轉(zhuǎn)化的研究深入，ADSCs越來越多地被應(yīng)用在血管組織工程之中。Volz等[34]研究認為，如何應(yīng)對重度燒傷創(chuàng)面修復、畸形矯正術(shù)后和腫瘤切除術(shù)后的受損軟組織的替代，成為臨床上一個棘手的問題。盡管目前外科手術(shù)技術(shù)的不斷革新和諸多新型合成材料的應(yīng)用在一定程度上緩解了這一情況，但在供體和受體部位的實際應(yīng)用中仍存在大量局限性和并發(fā)癥，影響預后質(zhì)量，因此迫切需要開發(fā)出新的方法以及材料允許永久替代自身軟組織[35]。ADSCs的誘導分化作為血管化脂肪組織工程的基本工具，應(yīng)用其開發(fā)安全、高效的體外脂肪組織構(gòu)建物成為了當今的技術(shù)熱點，尤其是脂肪組織工程血管化，在血管組織工程中具有更重要的地位。Kayabolen 等[36]開發(fā)出了一個具有良好機械性能的生物相容性的水凝膠支架，將脫細胞脂肪組織(decellularized adipose tissue，DAT)和纖維蛋白(Fibroin，F(xiàn)ib)以1∶3的比例混合制備水凝膠，該水凝膠支架是具有良好的支持VECs生存的脂肪組織構(gòu)建物。Park等[37]在實驗中發(fā)現(xiàn)ADSCs引起的三維細胞團(three dimensional cell masses，3DCMs)發(fā)生了缺氧狀況，加速了VEGF的表達，促進了新生血管的生成，說明ADSCs的3DCMs可以用作新血管形成的VECs來源，也可以與其他細胞類型共同植入進行再生醫(yī)學研究。

目前來說，血管化脂肪組織工程是一個非常有前景的領(lǐng)域，期待著我們尋找到新的可誘導ADSCs分化為VECs的靶點，或者構(gòu)建新的模型來進行血管組織工程。不過我們?nèi)詰?yīng)當意識到，盡管ADSCs分化被視為再生醫(yī)學中新的干細胞療法的工具鑰匙，但仍需綜合宿主環(huán)境和患者相關(guān)因素，通過進一步研究以提高其效率及可應(yīng)用性[38]。

5 展 望

ADSCs在促進創(chuàng)面愈合方面存有巨大潛力，尤其是血管脂肪組織工程化更是具有非常大的發(fā)展前景。但如何尋找到一個新的靶點，以及怎樣通過最新技術(shù)構(gòu)建一個高效安全可利用的模型都是非常值得探索的。相信在不久的未來，隨著血管組織工程理論的不斷完善，我們可以結(jié)合最新的科學技術(shù)制作出應(yīng)用于受損組織的安全、高性能的再生血管替代材料。