梁學萍，范廣來，范中原

（1.淮安市婦幼保健院，江蘇 淮安 223002；2.南京醫(yī)科大學康達學院，江蘇 連云港 222000）

血小板功能檢測是近幾年逐漸在基層各家醫(yī)院開展并廣泛應用于臨床的一項針對血小板的檢測，之前只是注重對血小板計數(shù)、血小板體積、血塊回收試驗、網(wǎng)織血小板的檢測。隨著醫(yī)療發(fā)展，臨床對血小板功能越來越重視，而不是僅僅停留在用血小板數(shù)量來判斷血小板功能。目前國內(nèi)外臨床對血小板功能的檢查主要有血小板黏附試驗、血小板聚集試驗、血小板釋放，還有一些特殊檢查：血小板代謝、血小板膜蛋白檢測。血小板在血栓形成和止血中起著重要的調(diào)節(jié)作用，血小板功能的測試一直在出血疾病診斷和治療中廣泛應用，在心血管疾病、抗血小板藥物監(jiān)測、妊娠產(chǎn)科、圍手術期評估出血風險。血小板在正常止血過程中起基礎性作用，而其遺傳或者后天功能障礙導致血小板功能異常，一些實驗方法根據(jù)血小板聚集、血小板黏附、凝塊形成過程中的黏彈性特征、血栓素代謝評價描述血小板功能不同方面。隨著醫(yī)療發(fā)展，新的臨床應用被不斷地發(fā)現(xiàn)。血小板還有助于調(diào)節(jié)炎癥、宿主預防和免疫、胎兒血管重塑、腫瘤生長和轉移[1-2]。

1 血小板的相關介紹

血小板為圓盤型，體積比紅細胞、白細胞小，大小2～4 μm。血小板計數(shù)正常值在(100～300)×109/L。血小板是由骨髓造血組織中的巨核細胞產(chǎn)生，平均壽命7～14 d。血小板是1882年由意大利醫(yī)師Bizzozero發(fā)現(xiàn)的，他不僅在血液中識別出血小板而且利用實時顯微鏡觀察到它們在血管壁受損區(qū)域形成血栓，現(xiàn)在該方法被用于詳細地研究血小板與血管壁的相互作用和血栓形成的動力學[3]。血小板是一種復雜的細胞研究，需要專門的方法來捕捉這種血小板反應的多樣性。為了應對這一挑戰(zhàn)，人們研究了多種的血小板功能檢測方法。

2 血小板功能檢測的影響因素

2.1 血液采樣條件 血液采樣條件目前已經(jīng)被證明影響血小板功能，包括晝夜規(guī)律[4]，運動[5]，禁食[6]，咖啡和含咖啡因的飲料[7-8]，和吸煙[9]。盡管在理想情況下，血小板功能研究樣本只能收集到禁食和休息的，沒有包括當天檢測時吸煙、咖啡因攝入、運動以及已知會影響血小板功能的藥物或物質(zhì)（如抗炎藥、抗血小板藥物、磷酸二脂酶抑制劑，某些精神藥物和草藥），實際上很多這樣的影響因素難以控制。

2.2 靜脈穿刺 靜脈穿刺應由經(jīng)驗豐富的抽血醫(yī)生從肘前靜脈窩采集血液，采用標準的、非創(chuàng)傷性的方案，使用最小的止血帶壓力進行干凈的靜脈穿刺[10]。采集管中血液與抗凝劑的比例，采集樣本血液的不足和過度也會影響，應努力將血液抽取到制造商指定的標記，以避免造成抗凝比例失調(diào)。采集樣本結束后應將采集管輕輕翻轉3～5 次以使抗凝血劑與血液充分混合。

2.3 抗凝劑選擇 在目前臨床血小板功能檢測中，最常用的抗凝劑是檸檬酸鈉[10]，其他的抗凝劑還有肝素、雙凝血酶/Xay因子抑制劑芐基磺酰-D-精氨酸-4-氨基苯甲酰胺和檸檬酸-葡萄酸[11]。有研究[12]表明，用檸檬酸鈉能一定程度降低EDTA-K對血小板的影響。EDTA不是一種適合血小板功能檢測的抗凝劑[13]。

2.4 其他 血小板功能受多種因素影響，如血小板計數(shù)、血細胞壓積、白細胞。除此以外還包括年齡、體重、糖尿病、貧血等，種族、性別、飲食也會影響血小板功能檢測[14]。

3 血小板功能實驗室檢測方法

3.1 出血時間（BT） BT最早是1910年由Duke開發(fā)，是第一個體內(nèi)血小板試驗。直到20世紀90年代仍然被認為是最有用的血小板功能試驗[15]。BT是測量血小板和血漿黏附蛋白如血友病因子驅(qū)動的生理性止血，并整合血液成分與血管壁的相互作用。然而BT重復性差、有創(chuàng)性，對許多輕度血小板缺陷不敏感，且耗時。此外，BT的應用在過去20年里迅速減少，取而代之的是對新鮮采集的血液樣本進行體外血小板功能測定。

3.2 光透射法（LTA） LTA于20世紀60年代初被引入，是血小板功能缺陷患者檢測的金標準。這種光學檢測是根據(jù)測得的濁度變化作為光透射的變化，而光透射的變化與加入激活劑誘導的血小板聚集程度成正比。在臨床實踐中使用光透射法來預測血栓形成的風險或監(jiān)測抗血小板藥物的療效。LTA是通過標準化方法使用富血小板血漿的光透射來測量血小板聚集。當血小板在血小板激活劑作用下開始聚集時，懸浮液的濁度降低并轉化為更高的透光率（乏血小板血漿的透光率用于定義100%的透光率）。因此，血小板聚集的動態(tài)是實時測量的血小板聚集。這種技術允許讀出光的同時進行傳輸，從而測量在聚集過程中高密度顆粒的核酸分泌[16]。該方法對以血小板分泌異常為特征的常見疾病更敏感，對于臨床懷疑血小板缺陷的患者，LTA是一種有用的首次篩選試驗[15]。目前有幾種常見的激活劑被用于光透射聚集儀中刺激血小板，比如二磷酸腺苷（ADP），花生四烯酸（AA），腎上腺素，膠原蛋白，血栓素類似物[17-18]。LTA需注意的是，實驗中制備富血小板血漿的血液樣本，需遵循標準化程序，以減少體外血小板活化和血小板脫敏的風險。還包括血液標本保存的溫度、時間、血小板攪拌速度[18]。

3.3 全血阻抗法（WBA） WBA首次描述在1980年，是對全血中血小板的測量，因為它是敏感電阻抗的增加引起血小板功能聚集的形成，將兩個電極浸泡在鹽水稀釋的全血中，在鉑電極上的血小板受體激活劑稀釋后損傷樣本，電極浸入。該技術被用于監(jiān)測血小板聚集抑制程度[19]。與光透射法相比，該方法對技術要求較低，耗時較長。WBA對許多變量比較敏感，包括血小板計數(shù)和紅細胞壓積[20]、抗凝劑使用、血液采樣到檢測的時間。

3.4 流式細胞術 流式細胞術是一種基于激光的技術，它根據(jù)單個細胞穿過光源產(chǎn)生的散射光提供了豐富信息?，F(xiàn)在大多數(shù)機構都在使用，它可以在體外測試血小板反應性，檢測活化的血小板，血小板-白細胞聚集物和循環(huán)中的血小板源性微粒[21]。流式細胞術檢測血小板功能可用于監(jiān)測抗血小板藥物療效，還可用于研究血小板分泌。傳統(tǒng)的流式細胞術和雙色流細胞術研究血小板聚集可能對研究兒童患者特別有用，因為他們只能抽取少量的血液樣本，或者不能使用光透射法進行研究的中度、重度血小板減少癥患者[22]。

3.5 血栓彈力圖（TEG） 從血栓形成到溶栓，這種技術可以從整體上評估止血功能[23-24]。該檢測方法是用全血在加熱的杯子中孵育，在杯子中掛起一根連接電腦的針，隨著血栓形成，針的運動被阻礙，這被解釋為描述凝血強度的曲線。該方法對檢測血小板功能的中度變化缺乏敏感性[25]。該試驗執(zhí)行速度相對較快（＜30 min），主要優(yōu)點是提供血栓形成的完整過程，包括凝血動力學、凝血強度和纖維蛋白溶解度。該試驗提供了全血凝塊形成的全局成像以及血小板在內(nèi)的全血元素與凝血系統(tǒng)之間的相互作用。血栓彈性成像測量全血凝塊形成過程中發(fā)生的黏彈性變化，它受血小板功能、凝血因子、天然凝血抑制劑和纖維蛋白的影響。它被認為優(yōu)于標準的凝血方法來治療出血患者，特別是與獲得性凝血障礙相關的患者[26]。也建議將其用于診斷血小板功能障礙或者監(jiān)測抗血小板治療[27]。

3.6 血小板功能分析儀 血小板功能分析儀PFA-100更新為PFA-200，是一種基于墨盒的分析方法。測量抗凝血樣本堵住膜上150 μm孔所需的時間（模擬血管壁的損傷的部位）。全血通過毛細血管吸入，通過膠原蛋白和ADP或者腎上腺素覆蓋的膜。該儀器測量劑量時間（CT），即血小板堵塞形成的停止血液的延遲時間。有兩種墨盒可供測試，一種是孔徑為150 μm上涂有膠原蛋白加ADP（c-ADP），另一種是在膜上膠原蛋白加腎上腺素（c-EPI）包裹。膜孔的閉合是由血小板堵塞形成引起的，這是系統(tǒng)高剪切作用和血液樣本與膜的血栓形成表面相互作用的結果。這種檢測方法簡單、快速、只需要少量血液，而且不需要大量的專業(yè)培訓，血小板計數(shù)和細胞壓積影響閉合時間，血小板計數(shù)低于50×109/L或紅細胞壓積低于50%的患者仔細解釋其結果。PFA-100對血小板功能輕度異常的敏感性較差，而血小板功能輕度異常是目前最常見的血小板功能障礙，因此不建議對疑似血小板功能障礙的患者進行篩選。

4 血小板功能的臨床應用

4.1 血小板功能在止血和血栓中的應用 傳統(tǒng)上，血小板功能檢測的主要用途是識別異常出血潛在原因[28]，監(jiān)測高風險出血患者的止血治療，并在手術前或者手術中確保血小板功能正常[29]。血小板在止血中的主要作用：血管壁損傷時導致膠原和內(nèi)皮蛋白暴露于血液，通過與血小板表面的GPⅠb/Ⅸ/Ⅴ復合物結合介導引發(fā)血小板初始黏附，然后血小板開始迅速并短暫的黏附或沿著血管壁流動。蛋白與GPⅥ結合導致細胞激活，從而通過受體GPⅡb/Ⅲa和α1β1形成牢固的黏附和擴散。血小板黏附也會導致細胞內(nèi)信號傳導和血小板活化，導致脫顆粒包括ADP的釋放、血栓烷的產(chǎn)生、GPⅡb/Ⅲa復合物激活陰離子磷脂的暴露等。這些有助于血小板進一步聚集，介導纖維蛋白原和血管性血友病因子結合。血小板因子提供磷脂加速凝血酶和纖維蛋白原形成，從而穩(wěn)定產(chǎn)生止血栓[3]。

目前，血小板功能在血栓中也應用廣泛，比如心血管疾病、心機梗塞等，臨床根據(jù)血小板這一項功能，許多抑制血小板聚集的藥物已被批準用于血栓性疾病的治療[30]。血小板功能在血栓中應用，當血小板被激活時，血小板上糖蛋白GPⅡb/Ⅲa與纖維蛋白原或血管性血友病因子結合，從而介導血小板聚集。阻斷GPⅡb/Ⅲa可以防止不依賴于激活血小板物質(zhì)的血小板聚集，這種綜合抑制血小板聚集的方法被認為是治療各種臨床血栓栓塞的有效方法。

4.2 診斷血小板功能障礙（PFD） 實驗室檢測血小板功能對于診斷先天性和獲得性血小板疾病是重要的[31]。先天性血小板障礙分為：①黏附蛋白的血小板受體異常；②可溶性激活劑的血小板受體異常；③血小板顆粒異常；④信號傳導的缺陷；⑤膜磷脂異常[32]。目前已經(jīng)有幾種不同的血小板功能檢測用來識別和診斷血小板功能障礙，不同程度的血小板功能障礙采用不同的方法。在調(diào)查疑似先天性或獲得性血小板功能障礙疾病時，有必要獲得詳細的臨床表現(xiàn)和家族史，并在選擇實驗室測試之前進行體格檢查[33-34]，特別是最近的用藥史至關重要。應建議患者在可能的情況下停止使用任何可能干擾血小板的藥物，有些藥物可能會引起暫時性的止血缺陷，因此經(jīng)常需要重復試驗，血小板功能的其他獲得性缺陷也可能與其他臨床條件相關[35]。血小板功能檢測對遺傳性血小板障礙也有著重要作用。通常情況下，遺傳性血小板功能障礙患者在手術或創(chuàng)傷后會出現(xiàn)不同程度的黏膜皮膚出血，其中血小板分泌和信號轉導缺陷是最常見的。缺乏GPⅡb/Ⅲa的血小板分泌不僅具有聚集性缺陷，而且致密顆粒分泌受損，正常的聚集模式并不完全排除原發(fā)性分泌缺陷，這可能需要血小板分泌試驗來檢測[36-38]。血小板纖溶功能異常的血小板功能障礙特征是α顆粒中巨核細胞來源的尿激酶增強，當血小板合并到纖維蛋白凝塊時誘導細胞內(nèi)和細胞外蛋白水解[39]。

4.3 血小板功能在妊娠期的應用 血小板活化增加與產(chǎn)科并發(fā)癥有關，如先兆子癇和宮內(nèi)生長遲緩。血小板活化可以延伸到外周循環(huán)，外周循環(huán)激活血小板釋放血管活性胺，可能是高血壓和蛋白尿臨床綜合征的原因，這些臨床綜合征在妊娠合并先兆子癇和生長遲緩存在[40]，血小板聚集增加可能是胎盤介導的并發(fā)癥的機制。抑制血小板聚集的藥物可以預防血小板聚集[41]。血小板功能參數(shù)改變是子癇前期最常見的，對血小板功能檢測可以預防子癇前期的風險[42]。妊娠與血小板凝血和纖溶等主要止血變化有關，因此妊娠可引起止血異常是由于滋養(yǎng)細胞浸入子宮內(nèi)膜和胎兒胎盤的形成，早期孕期就可能出現(xiàn)凝血變化，這些變化易使婦女在懷孕期間和產(chǎn)褥期發(fā)生血栓栓塞和其他障礙，血小板功能的測定在血小板依賴性止血中發(fā)揮作用[43]。目前臨床妊娠期血小板功能的檢測主要用于止血、抗血栓藥物的監(jiān)測比如阿司匹林的監(jiān)測，阿司匹林作為一種抗凝血劑的功能被用于探索先兆子癇的預防和治療中。乙酰水楊酸可恢復胎兒有益的AA血清濃度，防止胎兒胎盤的血流量下降[44]。

4.4 評估對抗血小板藥物療效并指導臨床用藥 目前臨床用于血小板治療的藥物主要有水楊酸類和噻吩吡啶類藥物。水楊酸類的藥物中阿司匹林臨床應用最多，噻吩吡啶類藥物在臨床應用最為廣泛的是氯吡格雷。通過不同的誘導劑誘導血小板聚集，然后監(jiān)測血小板聚集率，根據(jù)血小板聚集率的情況反映血小板藥物治療的效果，目前應用最廣泛的誘導劑是AA和ADP。阿司匹林的抗血小板作用是通過破壞環(huán)氧酶COX-1和COX-2的功能來實現(xiàn)的，它會導致環(huán)氧酶COX-1的530位和COX-2的516位絲氨酸不可逆的乙?；?，限制AA進入酶的催化活性位點從而阻止血栓烷的進一步合成。在生理條件下，血栓素在體內(nèi)平衡，對血小板聚集和血管活動力有相反作用。氯吡格雷是一種有效的抗血栓藥物，可抑制ADP誘導的血小板聚集，大量臨床試驗結果表明氯吡格雷在有癥狀性的動脈粥樣硬化病史的患者預防血管缺血性事件（心肌梗死、中風）等方面優(yōu)于阿司匹林。氯吡格雷的抗聚集作用歸因于不可逆的抑制ADP與血小板表面嘌呤受體的結合[45]。隨著抗血小板藥物的研究發(fā)現(xiàn)，第三代噻吩吡啶—普拉格雷和替格瑞洛也被開發(fā)出來[46]。抗血小板藥物治療效果監(jiān)測是一個階段，通過服藥前、服藥中、服藥后等不同的時期，對血小板聚集功能進行檢查反映治療的效果?？寡“逅幬镏委煹乃幮Х磻嬖趥€體差異，在標準劑量的抗血小板藥物治療后，一些患者在進行血小板功能測試時出現(xiàn)高治療的血小板反應（HPR）狀態(tài)，未能達到足夠的血小板抑制相反也會出現(xiàn)治療中血小板反應較低而導致出血風險增高。所以在服藥期間通過對血小板聚集功能測試可以對風險預測提供預測價值[47]。

5 總結

血小板有許多不同的功能，血小板與血液和血管壁的多種成分相互作用。一些新的血小板抑制劑被逐漸引入到臨床實踐中，越來越多的抑制劑被發(fā)現(xiàn)并使用。目前已經(jīng)有許多種檢測方法，針對不同的功能對血小板進行優(yōu)化的特定測試。血小板功能試驗主要用于血小板疾病的診斷檢查，也用來評估抗血小板治療效果，也適用于識別動脈血栓形成風險增加的患者。此外，血小板功能測試越來越多地被用于測量術前抗血小板治療的殘余效應，目的是降低出血風險。在有限的范圍內(nèi)，血小板功能檢測試驗也用于評估高聚集性，作為血小板治療之外的血栓前狀態(tài)的潛在標志物。

6 展望

隨著醫(yī)療發(fā)展，血小板功能檢測的應用越來越廣泛，人們對將血小板功能測定用于其它目的越來越感興趣。傳統(tǒng)的血小板功能測定目前還沒有標準化，對血小板功能檢測結果的判定標準、治療還不全面。為了優(yōu)化血小板功能測試的使用，還需更多的研究，臨床對血小板功能檢測的質(zhì)量保證也越來越重視。血小板功能檢測除了限制在專門實驗室，在患者床邊檢查血小板功能的護理儀器也被研究出來并大量在臨床使用。因為傳統(tǒng)的實驗室檢查時間較長，不能立即獲得，因此血小板功能的點治療也被研究進入臨床使用。血小板功能的點治療可以隨時、立即提醒臨床醫(yī)生注意血小板過度活化的風險并測量抗血小板治療的療效。不斷發(fā)展血小板功能檢測新的方法和應用應被臨床重視。