加夢還 張彩榮 馮龍飛

1.宜春學院化學與生物工程學院，江西宜春 336000；2.南京中醫(yī)藥大學附屬南京中醫(yī)院針灸科，江蘇南京 210000；3.宜春學院美容醫(yī)學院，江西宜春 336000

哮喘是呼吸系統(tǒng)常見的慢性疾病，以喘息、胸悶、咳嗽、呼吸短促等癥狀為主要臨床表現(xiàn)，其病因復雜，涉及遺傳、環(huán)境等多種因素[1]。當前，哮喘的藥物治療主要使用支氣管擴張劑和糖皮質(zhì)激素，感染期合并應用抗生素，雖取得一定的效果，病情暫時得到控制，但遠期效果不甚理想。麻黃附子細辛湯出自《注解傷寒論》，麻黃、附子、細辛可化痰宣肺、止咳平喘，現(xiàn)代臨床研究表明，麻黃附子細辛湯治療哮喘具有顯著效果[2]。為進一步明確麻黃附子細辛湯對哮喘的具體作用機制，本研究運用網(wǎng)絡藥理學方法，整合多項藥物與疾病數(shù)據(jù)庫，以期為臨床研究提供新思路。

1 資料與方法

1.1 資料來源

本研究使用的數(shù)據(jù)庫及軟件有：通用蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（www.uniprot.org）、毒性與基因比較數(shù)據(jù)庫（ctdbase.org）、中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺（tcmspw.com）、STRING 數(shù)據(jù)庫（string-db.org）、網(wǎng)絡圖形拓撲分析與編輯軟件（Cytoscape3.7.2）、人類基因組注釋數(shù)據(jù)庫(david.ncifcrf.gov)、微生信分析平臺（www.bioinformatics.com.cn）、Venny2.1.0（bioinfogp.cnb.csic.es）。

1.2 麻黃附子細辛湯中活性成分及靶點的篩選

通過中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺檢索中藥麻黃、附子、細辛，以口服生物利用度≥30%，類藥性≥0.18 為條件，篩選其中的活性成分并獲取相關靶點。

1.3 疾病靶基因的篩選

在毒性與基因比較數(shù)據(jù)庫中，通過關鍵詞“Asthma”篩選出哮喘相關靶基因。

1.4 麻黃附子細辛湯靶基因的篩選

將“1.2”中藥物靶點錄入Uniprot 數(shù)據(jù)庫中，進行基因標準化處理。

1.5 麻黃附子細辛湯治療哮喘靶點

將藥物活性成分靶點與疾病靶點通過維恩圖取交集，從而初步獲取麻黃附子細辛湯作用于哮喘的治療靶點。

1.6 麻黃附子細辛湯-哮喘關鍵靶點的篩選及蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（proteinprotein interaction，PPI）網(wǎng)絡構建

將上述得到的交集靶點導入String 數(shù)據(jù)庫，利用Cytoscape 3.7.2 計算進行網(wǎng)絡拓撲屬性分析，構建PPI網(wǎng)絡圖。

1.7 KEGG 通路富集和GO 生物過程分析

將上述關鍵靶點導入DAVID 數(shù)據(jù)庫中，以FDR＜0.01 為篩選條件，其結(jié)果分別以條形圖和氣泡圖予以顯示。

1.8 麻黃附子細辛湯關鍵活性成分-哮喘靶點的KEGG 通路

將通過文獻分析獲取的與KEGG 有關的信號通路及關鍵活性成分，導入Cytoscape 3.7.2，構建麻黃附子細辛湯關鍵活性成分-哮喘靶點的KEGG 通路。

2 結(jié)果

2.1 活性成分

篩選得到麻黃、附子、細辛中的活性成分，包括共有成分，共32 種，口服生物利用度排名前5 位的主要活性成分為槲皮素、木犀草素、山柰酚、β-谷甾醇、柚皮素。

2.2 藥物與疾病靶點維恩圖建立

將“2.1”中活性成分經(jīng)標準化處理后得到234 個靶基因。將在毒性與基因比較數(shù)據(jù)庫中檢索篩選到的486 個哮喘靶基因與麻黃附子細辛湯的靶基因構建維恩圖，獲得110 個麻黃附子細辛湯治療哮喘的共同靶基因。見圖1。

圖1 麻黃附子細辛湯-哮喘靶基因維恩圖

2.3 關鍵靶點的篩選及PPI 分析

取度值、中介中心性、接近中心性平均值以上的靶基因作為關鍵靶點，在110 個靶點中得到TP53、腫瘤壞死因子等30 個靶點，預測這些靶點是麻黃附子細辛湯治療哮喘的關鍵靶基因。將藥物與疾病的共同治療靶點導入STRING 數(shù)據(jù)庫中，得到藥物-疾病靶點PPI 網(wǎng)絡圖。見圖2。

圖2 藥物-疾病靶點蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡圖

2.4 KEGG 信號通路分析與GO 富集分析

將30 個關鍵靶點導入人類基因組注釋數(shù)據(jù)庫中，得到15 條與哮喘相關的KEGG 信號通路，并繪制氣泡圖。見圖3。GO 富集顯示生物過程124 個，分子功能24 個，細胞組成12 個。富集結(jié)果以數(shù)量值前5 位予以展示，見圖4。

圖4 GO 富集分析條形圖

2.5 麻黃附子細辛湯關鍵活性成分-核心靶點-疾病信號通路

利用Cytoscape 3.7.2 以槲皮素、木犀草素、山奈酚、柚皮素、β-谷甾醇為主要成分構建麻黃附子細辛湯關鍵活性成分-核心靶點-疾病信號通路圖，見圖5。圖中長方形代表核心靶點，箭頭代表活性成分，橢圓形代表信號通路，菱形代表疾病。

圖5 麻黃附子細辛湯關鍵活性成分-核心靶點-疾病信號通路

3 討論

3.1 關鍵活性成分分析

中醫(yī)理論認為，哮喘的發(fā)生與脾、肺、腎之間的關系最為密切。在肺虛中，患者表現(xiàn)出營衛(wèi)不固，御外無力，易感外邪，免疫力下降；脾虛則表現(xiàn)出免疫系統(tǒng)的功能紊亂和低下；腎虛中，患者表現(xiàn)出下丘腦、垂體、腎上腺和內(nèi)分泌的功能發(fā)生紊亂或者低下[3]。中醫(yī)認為補虛固本，理氣祛痰是治療哮喘的關鍵[4]。槲皮素是一種植物衍生的黃酮類化合物，具有廣泛的抗炎、抗氧化應激以及免疫調(diào)節(jié)作用[5]。Park 等[6]發(fā)現(xiàn)槲皮素可通過調(diào)節(jié)哮喘小鼠的T-bet 和GATA-3 基因的表達，抑制Th2 型細胞因子表達，促進Th1 型細胞因子γ 干擾素的表達，從而減輕哮喘小鼠氣道高反應性。木犀草素屬于天然的黃酮類化合物，可抑制Th2 型細胞因子的合成[7]，故其具有抗氧化、抗過敏、免疫調(diào)節(jié)等作用。Jang 等[8]研究證實，通過抑制Th2 細胞因子，木犀草素可以對過敏性哮喘發(fā)揮治療作用。山柰酚同樣屬于黃酮類化合物，也具有抗癌、抗炎、抗病毒等功能。柚皮素屬于二氫黃酮類化合物，史瑩等[9]在細胞實驗中研究證明，柚皮素在體外可以抑制與哮喘病理發(fā)生有關的炎癥因子。β-谷甾醇是植物甾醇類成分之一，研究表明，β-谷甾醇具有抗哮喘作用[10]。

3.2 關鍵靶基因分析

為深入研究麻黃附子細辛湯治療哮喘的作用機制，本研究篩選出30 個關鍵靶基因。其中TP53 對促進凋亡[11]和抗炎應答[12]起到調(diào)節(jié)作用，從而參與哮喘發(fā)生和全過程，基質(zhì)金屬蛋白酶2、9 是參與哮喘炎癥反應的過程，與哮喘的氣道重塑有關[13-14]。腫瘤壞死因子基因可激活單核巨噬細胞，產(chǎn)生炎癥介質(zhì)[15]，白細胞介素-6 為重要的炎癥因子，主要由上皮細胞，T、B 細胞，單核巨噬細胞等產(chǎn)生[16-17]，在發(fā)生哮喘時增高，病情緩解后漸漸恢復到正常水平，參與哮喘的全過程[18-19]。Lee 等[20]實驗證明，CCL2 基因在小鼠過敏哮喘模型的支氣管上皮細胞中表達顯著。AKT1 是通過影響炎癥因子白細胞介素-1β 的表達，從而參與哮喘的過程[21]。PPARG 可通過調(diào)節(jié)炎癥在哮喘中起作用[22]。FOS 和JUN 可促進哮喘中黏附分子的增值[23-24]。

3.3 KEGG 通路分析

對核心靶點進行KEGG 通路富集分析，進一步研究麻黃附子細辛湯治療哮喘的作用機制，與哮喘密切相關KEGG 信號通路有：腫瘤壞死因子信號通路、Toll樣受體信號通路等15 個信號通路。Zhang 等[25]研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤壞死因子通過負反饋調(diào)節(jié)Th2 細胞功能，介導細胞免疫、炎癥反應等過程，在治療哮喘的過程中發(fā)揮作用。哮喘的易感性也可能與先天免疫成分編碼基因的變異有關，病原體通過Toll 樣受體激活氣道上皮的先天性免疫反應,誘發(fā)氣道炎癥，繼而導致哮喘急性加重，使其成為哮喘的生物學候選基因[26]。FoxO信號通路是氧化還原的重要轉(zhuǎn)錄通路，參與細胞的氧化、還原、凋亡的全過程，但少有文獻報道其與哮喘之間的關系。磷脂酰肌醇3 激酶主要表現(xiàn)在細胞增殖方面，Akt 激酶可以調(diào)節(jié)細胞的增殖和代謝，阻斷該信號通路可以改變氣道結(jié)構，減輕氣道重塑，調(diào)節(jié)細胞分化及炎癥因子的產(chǎn)生，從而治愈哮喘[27]。

綜上，本研究通過網(wǎng)絡藥理學的方法對麻黃附子細辛湯治療哮喘的作用機制進行初步討論，為臨床實驗提供了理論依據(jù)，為進一步的試驗提供了可能性。