劉桂華，蘇 鳳，李 威，寇海娟*，眭 潔，李曉曼，羅世鵬*

（1．常州工業(yè)及消費(fèi)品檢驗(yàn)有限公司，江蘇 常州 213017；2．南京海關(guān)危險(xiǎn)貨物與包裝檢測(cè)中心，江蘇 常州 213022；3．江蘇理工學(xué)院 化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，江蘇 常州 213001）

苯酚、甲酚、二甲酚等酚類(lèi)物質(zhì)是生產(chǎn)酚醛樹(shù)脂、環(huán)氧樹(shù)脂、脲醛樹(shù)脂、密胺樹(shù)脂、聚碳酸酯（PC）等基礎(chǔ)樹(shù)脂的工業(yè)原料。這些樹(shù)脂常用于制造餐飲具、涂層罐等食品接觸材料。苯酚、甲酚、二甲酚等物質(zhì)對(duì)皮膚、粘膜有腐蝕作用，可抑制中樞神經(jīng)或損害肝、腎功能。誤服或經(jīng)皮膚吸收，可造成急性中毒，出現(xiàn)頭痛、惡心、乏力、視物模糊、肺水腫、昏迷等癥狀。以酚類(lèi)物質(zhì)為原料制成的食品接觸材料與食品接觸的過(guò)程中，殘留的游離酚類(lèi)物質(zhì)有遷移到食品中的風(fēng)險(xiǎn)，對(duì)食品安全和人體健康造成潛在危害。因此，國(guó)內(nèi)外相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)酚類(lèi)物質(zhì)制定了限制性要求。經(jīng)涂料生產(chǎn)企業(yè)調(diào)研得知，食品接觸用涂料中常用的酚類(lèi)物質(zhì)包括苯酚、鄰甲酚、間甲酚、對(duì)甲酚、2，6-二甲基苯酚、2，5-二甲基苯酚、2，3-二甲基苯酚、3，5-二甲基苯酚、3，4-二甲基苯酚。我國(guó) GB 9685－2016[1]中允許苯酚、2，6-二甲基苯酚、鄰甲酚、間甲酚、對(duì)甲酚在涂料中作為添加劑使用，其中2，6-二甲基苯酚的特定遷移限量（SML）為0．05 mg/kg，苯酚SML為3 mg/kg，鄰甲酚、間甲酚、對(duì)甲酚的SML均為60 mg/kg。除2，6-二甲基苯酚外的其他二甲酚均屬未授權(quán)的添加劑，依據(jù)我國(guó)GB 4806．1－2016標(biāo)準(zhǔn)[2]要求，對(duì)這類(lèi)未授權(quán)物質(zhì)的遷移量也需進(jìn)行控制。歐盟No．10/2011法規(guī)及其修訂法規(guī)[3]中對(duì)酚類(lèi)物質(zhì)的管理要求與我國(guó)GB 9685－2016管理要求相近。

目前，酚類(lèi)物質(zhì)的測(cè)定方法主要有滴定法[4]、顯色法[4－5]、液相色譜法[6－10]、液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法[11]、氣相色譜法[12]、氣相色譜－質(zhì)譜法[8－9，13－14]等。滴定法、顯色法可測(cè)定酚類(lèi)物質(zhì)的總量，簡(jiǎn)便易行，但無(wú)法分辨酚類(lèi)物質(zhì)的種類(lèi)；色譜法具有分離能力，可實(shí)現(xiàn)各酚類(lèi)物質(zhì)的定性和定量分析，相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道中以檢測(cè)雙酚 A[9，14]、壬基酚[14]、2，6-二甲基苯酚[8]等酚類(lèi)物質(zhì)遷移量方法為主，而對(duì)苯酚、甲酚、二甲酚等9種酚類(lèi)物質(zhì)同時(shí)測(cè)定的研究較少。

本文以涂料行業(yè)、塑料行業(yè)普遍使用的苯酚、鄰甲酚、間甲酚、對(duì)甲酚、2，6-二甲基苯酚、2，5-二甲基苯酚、2，3-二甲基苯酚、3，5-二甲基苯酚、3，4-二甲基苯酚共9種酚類(lèi)物質(zhì)為研究對(duì)象進(jìn)行方法開(kāi)發(fā)和優(yōu)化，以滿足我國(guó)食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的監(jiān)管要求為導(dǎo)向，建立一種準(zhǔn)確、可靠、便于推廣的檢測(cè)方法，為食品接觸材料生產(chǎn)企業(yè)對(duì)自身產(chǎn)品安全管控提供技術(shù)支持，同時(shí)為政府監(jiān)管部門(mén)對(duì)涂料產(chǎn)品的食品安全風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)提供技術(shù)保障。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與試劑

1.1.1 試劑及標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)冰乙酸、無(wú)水乙醇（分析純，江蘇強(qiáng)盛功能化學(xué)股份有限公司）；甲醇、乙腈、乙酸乙酯、異丙醇（色譜純，上海泰坦科技股份有限公司）；精制橄欖油（化學(xué)純，上海泰坦科技股份有限公司）；標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：苯酚（Phenol，純度99．0%）、鄰甲酚（o-Cresol，98．0%）、間甲酚（m-Cresol，98．0%）、對(duì)甲酚（p-Cresol，98．0%）、2，6-二甲基苯酚（2，6-Xylenol，98．0%）、2，5-二甲基苯酚（2，5?Xylenol，99．0%）、2，3-二甲基苯酚（2，3-Xylenol，99．0%）、3，5-二甲基苯酚（3，5-Xylenol，98．0%）、3，4-二甲基苯酚（3，4-Xylenol，99．0%）均購(gòu)自上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)耗材一次性針式注射器（5 mL）、親水PTFE微孔濾膜（25 mm，0．22μm）均購(gòu)自上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)樣品從市場(chǎng)隨機(jī)采購(gòu)15批PC塑料樣品（包括冷水壺、盎司杯、調(diào)酒器、杯子、運(yùn)動(dòng)水壺、巧克力模具），并從涂料生產(chǎn)企業(yè)征集15批涂層樣片，每個(gè)樣品平行采集2份。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 1200型高效液相色譜儀（安捷倫科技公司），配熒光檢測(cè)器；Agilent ZORBAX SB－Aq色譜柱（4．6 mm×150 mm，3．5μm，安捷倫科技公司）；XS104分析天平（梅特勒－托利多有限公司）；SIGNMA3－15離心機(jī)（北京勵(lì)行儀器有限公司）；Milli－Q Advantage純水儀（美國(guó)Millipore公司）；MVW－2500數(shù)顯型多管式渦旋混合器（上海泰坦科技股份有限公司）；SK8200HP超聲波清洗器（上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（1 000 mg/L）的配制分別精密稱(chēng)取0．05 g（精確至0．1 mg）各酚類(lèi)物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品于燒杯中，加入少量甲醇溶解后，轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度。

1.3.2 水基食品模擬物中系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制分別用水基食品模擬物為溶劑將混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液逐級(jí)稀釋成0、0．10、0．20、0．40、1．0、2．0、3．0、5．0 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。

其他水基食品模擬物，包括水、10%乙醇、20%乙醇、50%乙醇、4%乙酸。

1.3.3 含油脂類(lèi)食品模擬物系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制用異丙醇為溶劑將混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液逐級(jí)稀釋成5．0、10、20、30、40 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)中間液。分別稱(chēng)取5．0 g橄欖油（精確至0．01 g）至6個(gè)帶蓋的玻璃離心管，離心管中分別加入100μL系列混合標(biāo)準(zhǔn)中間液渦旋混勻，再分別加入2．0 mL 67%甲醇溶液渦旋混勻2 min，以4 000 r/min離心10 min，取下層溶液經(jīng)親水PTFE微孔濾膜過(guò)濾后待測(cè)。得到系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中酚類(lèi)物質(zhì)的含量分別為0．10、0．20、0．40、0．60、0．80 mg/kg。

1.3.4 遷移試驗(yàn)按GB 31604．1－2015[15]和GB 5009．156－2016[16]的要求，分別采用模擬酸性食品，以水、10%乙醇、20%乙醇、50%乙醇、4%乙酸、橄欖油為食品模擬物，對(duì)食品接觸材料及制品進(jìn)行遷移實(shí)驗(yàn)，遷移試驗(yàn)結(jié)束后，將所得模擬物充分混勻后待處理。

1.3.5 遷移試驗(yàn)所得浸泡液的處理取1～2 mL遷移試驗(yàn)所得水基食品模擬物，經(jīng)親水PTFE微孔濾膜過(guò)濾后待測(cè)。

準(zhǔn)確稱(chēng)取5．0 g（精確至0．01 g）遷移試驗(yàn)所得橄欖油至帶蓋玻璃離心管中，加入2．0 mL 67%甲醇溶液，渦旋提取2 min后，以4 000 r/min離心10 min，取上層甲醇溶液過(guò)親水PTFE微孔濾膜后待測(cè)。

1.3.6 液相色譜條件色譜柱為Agilent ZORBAX SB－Aq色譜柱（4．6 mm×150 mm，3．5μm）；流動(dòng)相：A為甲醇，B為水，梯度洗脫程序：0～5 min，5%～15%A；5～25 min，15%～22%A；25～30 min，22%～30%A；30～31 min，30%～5%A；31～35 min，5%A；流速：1．0 mL/min；柱溫：35℃；進(jìn)樣量：10μL。熒光檢測(cè)器的激發(fā)波長(zhǎng)為214 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為315 nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

2.1.1 液相色譜柱的選擇本研究的9種酚類(lèi)物質(zhì)均為強(qiáng)極性化合物，且結(jié)構(gòu)相似，還存在部分同分異構(gòu)體。通常強(qiáng)極性物質(zhì)在C18柱上的保留較弱，不易實(shí)現(xiàn)各物質(zhì)的有效分離，而氰基柱、改性的C18色譜柱更適合分離強(qiáng)極性物質(zhì)。因此，本研究分別考察了Phenomenex Kinetex C18（4．6 mm×150 mm，5μm）、Phenomenex ACE Excel 3 Aq（4．6 mm ×100 mm，3μm）、Phenomenex ACE Excel 5 CN（150 mm ×4．6 mm，5 μm）、Agilent ZORBAX SB－CN（4．6 mm × 250 mm，5 μm）、Agilent ZORBAX SB－Aq（4．6 mm×150 mm，3．5μm）5種液相色譜柱的分離效果。結(jié)果表明，C18柱、氰基柱上各酚類(lèi)物質(zhì)的色譜峰出現(xiàn)重疊，尤其是二甲酚的幾種同分異構(gòu)體，甚至通過(guò)改變流動(dòng)相的洗脫程序，部分同分異構(gòu)體的色譜峰仍無(wú)法實(shí)現(xiàn)基線分離，而采用Agilent ZORBAX SB－Aq（4．6 mm×150 mm，3．5μm）經(jīng)過(guò)流動(dòng)相洗脫程序優(yōu)化后，可實(shí)現(xiàn)9種酚類(lèi)物質(zhì)的有效分離，因此本研究最終選擇Agilent ZORBAX SB－Aq色譜柱進(jìn)行分離。

2.1.2 熒光檢測(cè)器檢測(cè)條件的優(yōu)化通過(guò)激發(fā)波長(zhǎng)掃描，確定9種酚類(lèi)物質(zhì)的最大激發(fā)波長(zhǎng)，并分別在各物質(zhì)的最大激發(fā)波長(zhǎng)下掃描發(fā)射波長(zhǎng)，得到各物質(zhì)的最大發(fā)射波長(zhǎng)。在各激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)條件下，以9種酚類(lèi)物質(zhì)的色譜峰形對(duì)稱(chēng)性良好、峰寬較寬、響應(yīng)強(qiáng)度較強(qiáng)為選擇原則，最終確定熒光檢測(cè)器的激發(fā)波長(zhǎng)為214 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為315 nm?；旌蠘?biāo)準(zhǔn)溶液的典型色譜圖如圖1所示。

圖1 9種酚類(lèi)物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖Fig．1 Chromatogram of 9 phenols standard solution

2.2 前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

水基食品模擬物中9種酚類(lèi)物質(zhì)可直接上機(jī)檢測(cè)。橄欖油中9種酚類(lèi)物質(zhì)需采取液液萃取，綜合考慮9種酚類(lèi)物質(zhì)的溶解性及與液相色譜柱的進(jìn)樣要求，采用極性溶劑進(jìn)行萃取。分別準(zhǔn)確稱(chēng)取5．0 g（精確至0．01 g）精制橄欖油于3個(gè)25 mL具塞離心管中，分別加入100μL 40 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（以異丙醇為溶劑），渦旋混勻后，得到加標(biāo)濃度為0．40 mg/kg的標(biāo)準(zhǔn)工作液，再分別加入2．0 mL提取溶劑，渦旋提取2 min，以4 000 r/min離心10 min使兩相分層，提取液層經(jīng)親水PTFE微孔濾膜過(guò)濾后，采用LC測(cè)定。各提取溶劑的提取效率見(jiàn)表1。

表1 橄欖油中9種酚類(lèi)物質(zhì)的提取效率Table 1 Extraction efficiencies of nine kinds of phenols in olive oil （%）

首先考察了水、甲醇、乙腈3種提取溶劑的提取效率。結(jié)果顯示，水提取液中3種甲酚類(lèi)物質(zhì)、5種二甲酚類(lèi)物質(zhì)的提取效率均低于20%，這是由于這8種酚類(lèi)物質(zhì)在水中的溶解性較苯酚差所致。甲醇、乙腈兩種提取液中除苯酚外，其他8種目標(biāo)物色譜峰峰形的對(duì)稱(chēng)性差，均出現(xiàn)前延現(xiàn)象，且峰形展寬導(dǎo)致分離度降低，從而造成定量困難，并以乙腈中此現(xiàn)象更為嚴(yán)重。可能原因是橄欖油中存在沒(méi)食子酸、丁香酸、咖啡酸等酚類(lèi)物質(zhì)對(duì)目標(biāo)物質(zhì)的檢測(cè)產(chǎn)生干擾，以及提取溶劑與初始流動(dòng)相的匹配性差。

綜合分析水、甲醇、乙腈3種溶劑的提取效果，采用在甲醇中加入少量水，降低橄欖油中成分在甲醇中的溶解度，改善色譜峰形。分別考察了50%甲醇、67%甲醇對(duì)9種酚類(lèi)物質(zhì)的提取效率。結(jié)果顯示，67%甲醇提取液中9種酚類(lèi)物質(zhì)的峰形對(duì)稱(chēng)，無(wú)共流出物，提取效率在80%～95%之間；50%甲醇提取液中每種目標(biāo)物質(zhì)的提取效率均低于67%甲醇的提取效率。因此，本研究確定采用67%甲醇溶液為提取溶劑。

2.3 方法學(xué)驗(yàn)證

2.3.1 線性范圍、檢出限及定量下限按本方法對(duì)各食品模擬物中9種酚類(lèi)物質(zhì)的系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作液進(jìn)行測(cè)定，以其中目標(biāo)物質(zhì)的峰面積（y）對(duì)其濃度（x）作圖，得到標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。5種水基食品模擬物中9種酚類(lèi)物質(zhì)在0．10～5．0 mg/L范圍內(nèi)，含油脂食品模擬物中9種酚類(lèi)物質(zhì)在0．10～0．80 mg/kg范圍內(nèi)，其線性方程的相關(guān)系數(shù)（r2）均高于0．999，說(shuō)明本方法具有良好的線性。分別以基線平均噪音的3倍和10倍對(duì)應(yīng)目標(biāo)物質(zhì)的濃度作為方法檢出限（LOD）和定量下限（LOQ），結(jié)果顯示，5種水基食品模擬物中9種酚類(lèi)物質(zhì)的檢出限為0．03～0．05 mg/L，定量下限為0．07～0．10 mg/L，含油脂食品模擬物中9種酚類(lèi)物質(zhì)的檢出限為0．05～0．08 mg/kg，定量下限為0．15～0．20 mg/kg，說(shuō)明方法具備較高靈敏度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2～3所示。

表2 水基食品模擬物中9種酚類(lèi)物質(zhì)的線性關(guān)系、檢出限及定量下限Table 2 Linear relations，LODs and LOQs for 9 phenols in aqueous food simulants

（續(xù)表2）

表3 含油脂類(lèi)食品模擬物中9種酚類(lèi)物質(zhì)的線性關(guān)系、檢出限及定量下限Table 3 Linear relations，LODs and LOQs for 9 phenols in fatty food simulants

2.3.2 回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差采用在陰性樣品浸泡液中分別添加低、中、高3個(gè)濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液驗(yàn)證方法的準(zhǔn)確度和精密度，每個(gè)加標(biāo)水平制備6個(gè)平行測(cè)試樣，根據(jù)本方法進(jìn)行前處理和儀器測(cè)定，計(jì)算其平均回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），結(jié)果見(jiàn)表4。從表4可見(jiàn)，在所有的加標(biāo)濃度下，各食品模擬物中9種酚類(lèi)物質(zhì)的平均回收率為90．7%～99．8%，RSD為0．06%～5．6%，說(shuō)明本方法具有良好的準(zhǔn)確度和精密度。

表4 不同食品模擬物中9種酚類(lèi)物質(zhì)的加標(biāo)回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）Table 4 Recoveries and RSDs for 9 phenols in different food simulants（n=6）

2.4 實(shí)際樣品的測(cè)試

市場(chǎng)隨機(jī)采購(gòu)的11批PC塑料樣品，涂料生產(chǎn)企業(yè)征集的15批涂層樣片，按照本方法進(jìn)行測(cè)定。測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表5，典型樣品譜圖見(jiàn)圖2。PC塑料樣品遷移量檢出物質(zhì)均為苯酚，且遷移量結(jié)果均符合GB 9685－2016中SML為3 mg/kg的要求。涂層樣片遷移量檢出物質(zhì)有鄰甲酚、間甲酚、2，6-二甲基苯酚，其中鄰甲酚、間甲酚的遷移量均符合GB 9685－2016中SML為60 mg/kg的要求，而2，6-二甲基苯酚的遷移量均超出了GB 9685－2016中SML為0．05 mg/kg的要求。所有樣品均未檢出其他二甲基苯酚類(lèi)物質(zhì)的遷移量，可能由于該類(lèi)物質(zhì)屬于未授權(quán)使用的物質(zhì)，因此涂料生產(chǎn)企業(yè)在配方設(shè)計(jì)時(shí)對(duì)該類(lèi)物質(zhì)的使用量較低，以保證這些二甲基苯酚類(lèi)物質(zhì)不會(huì)遷移到食品或食品模擬物中。

圖2 典型樣品的色譜圖Fig．2 Chromatograms of typical samples

表5 PC制品和涂層樣品中9種酚類(lèi)物質(zhì)遷移量的檢測(cè)結(jié)果Table 5 Detection results of 9 phenols migration from PC articles and coatings

（續(xù)表5）

3 結(jié) 論

本研究采用高效液相色譜建立了食品接觸用PC制品及酚醛樹(shù)脂涂層制品中9種酚類(lèi)物質(zhì)遷移量的檢測(cè)方法。經(jīng)方法驗(yàn)證及實(shí)際樣品檢測(cè)證實(shí)，本方法前處理操作簡(jiǎn)便易行，分析儀器在全國(guó)范圍普及率高，且各項(xiàng)技術(shù)參數(shù)均滿足定量方法相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)要求，可作為現(xiàn)行食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中對(duì)酚類(lèi)物質(zhì)遷移量管控要求的配套檢測(cè)方法，在全國(guó)各地的食品接觸材料檢測(cè)領(lǐng)域內(nèi)推廣使用。同時(shí)，本方法可為檢測(cè)機(jī)構(gòu)和相關(guān)監(jiān)管部門(mén)對(duì)食品接觸材料及制品中酚類(lèi)物質(zhì)的合規(guī)性評(píng)價(jià)及風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供技術(shù)支持。