付曉燕，劉蓮蓮

(遼寧省大連生態(tài)環(huán)境監(jiān)測(cè)中心，遼寧 大連 116023)

1 引言

喹諾酮類(4-quinolones)，又稱吡酮酸類或吡啶酮酸類，是人工合成的含4-喹諾酮基本結(jié)構(gòu)的抗菌藥。喹諾酮類以細(xì)菌的脫氧核糖核酸(DNA)為靶，妨礙DNA回旋酶，進(jìn)一步造成細(xì)菌DNA的不可逆損害，達(dá)到抗菌效果。喹諾酮類是應(yīng)用比較廣泛的一類抗生素藥物，被廣泛應(yīng)用于養(yǎng)殖業(yè)中。喹諾酮類藥物在動(dòng)物機(jī)體組織中的殘留，人類食用動(dòng)物組織后，喹諾酮類抗生素就在人體內(nèi)殘留蓄積，極易造成人體疾病對(duì)該藥物的耐藥性，影響人體疾病的治療。一旦釋放進(jìn)入環(huán)境中，便會(huì)分布到水、土壤和空氣中，產(chǎn)生一系列代謝及降解產(chǎn)物，而這些產(chǎn)物往往具有更大的毒性。由于喹諾酮類藥物具有強(qiáng)極性及在環(huán)境樣品中含量低的特點(diǎn)，導(dǎo)致對(duì)其分析檢測(cè)難度增加[2,3]。

檢測(cè)水環(huán)境中殘留抗生素，分析方法靈敏、準(zhǔn)確、快速是其環(huán)境行為和生態(tài)效應(yīng)研究的必要手段。傳統(tǒng)的微生物檢測(cè)方法是利用抗菌藥物敏感的菌株作為指示生物體，再根據(jù)最低抑菌濃度推算出提取液中的藥物濃度，但是該方法十分繁瑣。高效液相色譜-紫外檢測(cè)方法的選擇性不強(qiáng)，對(duì)于某些抗生素靈敏度不高，不能快速準(zhǔn)確分析。液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法具有選擇性強(qiáng)、靈敏度高、簡(jiǎn)便快速和應(yīng)用范圍廣等特點(diǎn)，成為當(dāng)前水環(huán)境中檢測(cè)痕量抗生素殘留方法的發(fā)展趨勢(shì)。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

ACQUITY UPLC 液相色譜儀，Waters TQ Detector 新型離子源加熱型質(zhì)譜儀；色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18(2.1 mm×100 mm, 1.7μm )；ACQUITY UPLC HSS T3 (2.1 mm×50 mm, 1.8 μm )；：ACQUITY UPLC BEH C18(2.1 mm×50 mm, 1.7μm )；Milli-Q超純水器；固相萃取柱：填料為二乙烯苯和N-乙烯基吡咯烷酮共聚物；0.22 μm有機(jī)相針筒式微孔濾膜過濾器，材質(zhì)為玻璃纖維、親水性聚丙烯、親水性聚四氟乙烯(PTFE)等。

甲醇為HPLC級(jí)(美國(guó)J. T. Baker公司)；甲酸為HPLC級(jí)(美國(guó)Sigma公司)；實(shí)驗(yàn)用水為經(jīng)Milli-Q凈化系統(tǒng)制備的超純水(經(jīng)0.22 μm過濾膜)；氮?dú)?、氬?純度≥ 99.999%)；其他試劑均為分析純；磺胺嘧啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺甲惡唑及磺胺甲基嘧啶-13C6標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：純度均≥99%(百靈威公司)；

2.2 色譜條件

ACQUITY UPLC BEH C18(2.1 mm×100 mm, 1.7 μm )，流動(dòng)相為甲醇-0.1% 的甲酸水溶液 。時(shí)間分別為：0、0.5、5.0、7.0、7.5、8.5、9.0、10.0 min，甲醇濃度分別為：5%、5%、30%、30%、90%、90%、5%、5%，甲醛水溶液濃度分別為：95%、95%、70%、70%、10%、10%、95%、95%。流速0.2 mL/min，柱溫40 ℃，進(jìn)樣量10 μL。

2.3 質(zhì)譜條件

電離方式為電噴霧電離ESI( + )，檢測(cè)方式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(Multiple Reaction Monitor, MRM)方式，利用保留時(shí)間和碎片信號(hào)比值判斷定性結(jié)果；電噴霧電壓3 kV；離子源溫度120 ℃；去溶劑溫度350 ℃。

2.4 樣品制備

準(zhǔn)確移取100 mL水樣，用0.45 μm濾膜過濾，HLB固相萃取柱進(jìn)行萃取。萃取柱應(yīng)先進(jìn)行活化，活化方法為：分別用10 mL 甲醇、10 mL超純水活化HLB 萃取柱。水樣以小于5 mL/min的流速通過固相萃取柱，完成后用10 mL超純水淋洗小柱，再用氮?dú)獯蹈尚≈?，最后?0 mL甲醇洗脫富集固相萃取柱，并用接收管接收甲醇洗脫液，氮吹濃縮至近干，加甲酸溶液定容到1.0 mL，最后加入內(nèi)標(biāo)使用液10.0 μL，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾，置于進(jìn)樣瓶中，等待進(jìn)樣。

3 結(jié)果與討論

3.1 濾膜的選擇

由于選擇的色譜柱填料粒徑為1.7 μm比較小，因此選擇了0.22 μm的四種不同材質(zhì)濾膜作比較：玻璃纖維、尼龍、親水性PTFE和聚丙烯濾膜，使用針式過濾器過濾，對(duì)空白加標(biāo)樣品進(jìn)行分析，5種喹諾酮類抗生素加標(biāo)濃度為10 μg/L，發(fā)現(xiàn)濾膜樣品通過率為57%～98%，按照通過率高低順序，選擇通過率大于90%的0.22 μm的玻璃纖維濾膜、親水性聚丙烯濾膜、親水性PTFE濾膜。

3.2 液相色譜條件的優(yōu)化

喹諾酮類抗生素分子具有較強(qiáng)的極性，在大部分反相色譜柱上,即使以純水作流動(dòng)相，依然只有很弱的保留[5]，因此選擇合適的色譜柱對(duì)喹諾酮類抗生素的分析測(cè)定至關(guān)重要，本研究分別比較了ACQUITY UPLC BEH C18(2.1 mm×100 mm, 1.7 μm )、ACQUITY UPLC BEH C18(2.1 mm×50 mm, 1.7 μm )和ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱(2.1 mm×50 mm,1.8 μm)兩種類型的色譜柱對(duì)目標(biāo)化合物的分離效果。結(jié)果表明ACQUITY UPLC BEH C18(2.1 mm×100 mm, 1.7 μm )色譜柱對(duì)目標(biāo)物具有最佳的色譜分離效果，且在10 min內(nèi)目標(biāo)物完全分離。

流動(dòng)相的組成不僅影響目標(biāo)化合物的色譜峰形和分離效果，還會(huì)影響其離子化效率和質(zhì)譜檢測(cè)靈敏度。本研究考察了不同比例有機(jī)相(30%、50%及60%) 的分離效果，最終確認(rèn)甲醇-水(30∶70，V/V)為主要洗脫梯度，含0.1%的甲酸體系，具有最佳的電離效果和質(zhì)譜特征。

3.3 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

根據(jù)喹諾酮類抗生素的分子結(jié)構(gòu)的特征和化學(xué)電離性質(zhì)，實(shí)驗(yàn)選擇了ESI(+)作為離子化模式。為了獲得最佳的靈敏度和分離效果，首先，采用連續(xù)直接進(jìn)樣，掃描范圍為m/z 10～300，分別對(duì)電噴霧電壓、離子源溫度、去溶劑溫度、錐孔氣流量、錐孔電壓，碰撞電壓等條件進(jìn)行優(yōu)化，使調(diào)諧液中喹諾酮類抗生素的離子化效率達(dá)到最佳。

4 結(jié)論

本方法建立了液相色譜-串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用儀，對(duì)水中喹諾酮類抗生素分析快速，著重研究了液相色譜-串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用儀對(duì)水中喹諾酮類抗生素的快速測(cè)定。該方法通過固相萃取法進(jìn)樣分析，節(jié)省了水樣前處理過程中需要消耗的大量有機(jī)溶劑及衍生試劑，并縮短了檢測(cè)時(shí)間，方法檢測(cè)限低至0.015 μg/L，是一種分析速度快、定性準(zhǔn)確、靈敏度高、穩(wěn)定性好的分析方法[10，11]。