李姍姍 裴陽 張威 孫立影 姜淼 尚國印 牛思佳 馬志斌

結(jié)直腸癌是常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，在全球癌癥發(fā)病率及死亡率中均高居第三位［1?2］。在我國，結(jié)直腸癌在近年來也成為發(fā)病率增長最快的惡性腫瘤之一，死亡率亦逐年遞增［3］。早期預(yù)測和發(fā)現(xiàn)對改善結(jié)直腸癌患者預(yù)后至關(guān)重要，因此學(xué)者們不斷試圖從結(jié)直腸癌的發(fā)病機(jī)制中尋找靶點，以在始動環(huán)節(jié)中斷其發(fā)生。miRNA屬于單鏈?zhǔn)降姆蔷幋aRNA，長度為18～25個核苷酸，其在腫瘤發(fā)生發(fā)展和分子靶向治療中的研究備受關(guān)注［4?5］。在結(jié)直腸癌中，目前也已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了幾十種異常表達(dá)的相關(guān)miRNA，miRNA可以作用于細(xì)胞成瘤性，從而促進(jìn)或抑制癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移和增殖［6?7］。本研究在前期的甲基化芯片檢測中發(fā)現(xiàn)miR?429在甲基化前后數(shù)值差異顯著，提示miR?429可能是一種抑癌基因［8］。本研究進(jìn)一步通過Targetscan軟件篩選出miR?429與細(xì)胞增殖密切相關(guān)的靶向基因SIAH1，構(gòu)建含SIAH1基因3′?UTR重組雙熒光素酶報告質(zhì)粒，探討miR?429是否通過靶向調(diào)控SIAH1表達(dá)而影響結(jié)直腸癌細(xì)胞LOVO增殖。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

人正常結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞NCM460和結(jié)直腸癌細(xì)胞系SW480、LOVO、HT?29購自ATCC細(xì)胞庫；miR?429 mimic及陰性對照（NC）由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成；LipofectamineTM2000試劑盒、TRIzol試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒以及qRT?PCR試劑盒、BCA試劑盒、紫外分光光度計均購自美國Thermo Fisher公司；雙熒光素酶檢測試劑盒購自Promega公司；雙熒光素酶報告基因?qū)嶒炥D(zhuǎn)染質(zhì)粒購自南京博恩生物技術(shù)有限公司；倒置顯微鏡購自麥克奧迪實業(yè)集團(tuán)有限公司；F12K培養(yǎng)基、胰酶、EDTA購自美國Sigma公司；一抗SIAH1抗體、二抗山羊抗體IgG購自英國Abcam公司；熒光定量PCR儀購自韓國Bioneer公司。

1.2 細(xì)胞分組和轉(zhuǎn)染

將人正常結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞NCM460和結(jié)直腸癌細(xì)胞系SW480、LOVO、HT?29培養(yǎng)于RPMI?1640培養(yǎng)基中。qRT?PCR檢測miR?429表達(dá)量并選取miR?429表達(dá)最低的細(xì)胞系納入后續(xù)實驗。取對數(shù)生長期細(xì)胞，以4×105/mL濃度接種于6孔板中。實驗分組：轉(zhuǎn)染過表達(dá)質(zhì)粒miR?429 mimic（miR?429 mimic組）和轉(zhuǎn)染miR?429陰性對照序列（NC組），以不做任何處理的細(xì)胞作為空白對照組（Control組）。轉(zhuǎn)染步驟依據(jù)Li?pofectamineTM2000試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3 靶向關(guān)系預(yù)測和雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?/h3>

采用Targetscan軟件在線分析預(yù)測miR?429特異性靶向基因。將miR?429作為檢索詞輸入Targetscan（www.targetscan.org）在線分析軟件中預(yù)測與miR?429存在特異性結(jié)合位點的靶基因，然后通過雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞CmiR?429和SIAH1的靶向關(guān)系。首先將含有miR?429結(jié)合位點的SIAH1序列進(jìn)行擴(kuò)增并克隆至pmirGLO雙熒光素酶報告載體，該序列命名為SIAH1?3′UTR?WT，同時構(gòu)建突變型對照（SIAH1?3′UTR?MUT）。將上述2種序列分別與NC和miR?429 mimic共轉(zhuǎn)染至HEK?293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染過程按照LipofectamineTM2000試劑盒說明書進(jìn)行。48 h后，使用雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒測定各組細(xì)胞的熒光素酶活性，熒光素酶活性以螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶活性的比值進(jìn)行計算。

1.4 qRT?PCR檢測 miR?429 mRNA的表達(dá)

采用TRIzol試劑盒提取LOVO細(xì)胞中總RNA，依據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA，然后按照qRT?PCR試劑盒說明進(jìn)行反應(yīng)。PCR反應(yīng)條件：95℃變性10 min，60℃退火30 s、72℃延伸40 min，共40個循環(huán)。引物序列如下：miR?429 上游為 5′?ACTGCTC?GATGCTCGATCGTAGCA?3′，下游為5′?CTAGCTAGT?GCTCGATAACGTCCA?3′；U6上游為5′?GCTCGAAC?GTAGCAGCGATGCAGT?3′，下游為 5′?GTGCAACGC?GAGGCCTGGTGCAAC?3′。使用2-△△Ct法計算miR?429的相對表達(dá)量。

1.5 Western blot檢測SIAH1蛋白表達(dá)

收集各組細(xì)胞，加入RIPA裂解液裂解細(xì)胞，提取總蛋白，用BCA試劑盒測定蛋白濃度。取30 μg蛋白上樣，之后行SDS?PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉，然后加入以1∶2 000稀釋的SIAH1抗體作為一抗，4℃條件下孵育過夜；次日加入1∶2 500稀釋的山羊抗兔IgG作為二抗，室溫條件下孵育1 h；然后用ECL顯影液顯影，拍照。以GAPDH為內(nèi)參，采用Image J軟件測定蛋白灰度值。

1.6 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期

收集各組細(xì)胞，用胰酶消化后以1%胎牛血清洗滌，0.5%乙醇固定30 min。然后用PBS沖洗，RNase水浴細(xì)胞30 min后，加入50 μL濃度為10 μg/mL的PI染液，室溫下染色30 min。上流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期的情況并分析。

1.7 MTT法檢測細(xì)胞增殖

各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染36 h后，用胰蛋白酶消化，然后收集各組細(xì)胞并接種于96孔板，每孔接種5×103個細(xì)胞。分別在轉(zhuǎn)染第1天、2天、3天、4天、5天、6天時向各孔中加入20 μL的MTT溶液，4 h后上酶標(biāo)儀檢測490 nm處各組細(xì)胞的吸光度（OD）值，并繪制細(xì)胞生長曲線。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組均數(shù)比較采用獨立樣本t檢驗，多組均數(shù)比較采用單因素方差分析，若組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義，采用Bonferroni檢驗進(jìn)行多重比較。本研究以雙側(cè)P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR?429在結(jié)直腸癌細(xì)胞系中的表達(dá)

qRT?PCR檢測結(jié)果顯示，與NCM460細(xì)胞相比，結(jié)直腸癌細(xì)胞系 SW480、LOVO、HT?29中 miR?429的表達(dá)均降低（均P＜0.001），其中LOVO細(xì)胞系中miR?429的表達(dá)最低，因此選擇LOVO細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實驗。見圖1。

2.2 miR?429和SIAH1的靶向關(guān)系驗證

Targetscan靶向關(guān)系預(yù)測網(wǎng)站分析顯示，miR?429和SIAH1存在特異性結(jié)合位點，見圖2A。雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞C二者之間的靶向關(guān)系，結(jié)果顯示，在LOVO細(xì)胞中，相對于NC組，SIAH1?3′UTR?WT與miR?429 mimic共轉(zhuǎn)染組的熒光素酶活性顯著降低（t=7.861，P=0.001），見圖2B。

2.3 成功構(gòu)建過表達(dá)miR?429的結(jié)直腸癌細(xì)胞LOVO

qRT?PCR檢測結(jié)果顯示，LOVO細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后，miR?429 mimic組中miR?429的表達(dá)顯著高于NC組（3.948±0.382vs0.913±0.075，t=13.501，P＜0.001），見圖3。說明轉(zhuǎn)染成功。

圖3 miR?429轉(zhuǎn)染效率驗證Fig.3 Verification of miR?429 transfection efficiency

2.4 過表達(dá)miR?429對結(jié)直腸癌細(xì)胞LOVO中SIAH1蛋白表達(dá)的影響

Western blot檢測結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染72 h后，miR?429 mimic組細(xì)胞中SIAH1蛋白表達(dá)水平較NC組顯著降低（0.415±0.046vs1.012±0.093，t=9.966，P＜0.001），見圖4。說明過表達(dá)miR?429能抑制SIAH1蛋白的表達(dá)。

圖4 過表達(dá)miR?429對LOVO細(xì)胞中SIAH1蛋白表達(dá)的影響Fig.4 Effect of miR?429 overexpression on the expression of SIAH1 protein in LOVO cells

2.5 過表達(dá)miR?429對結(jié)直腸癌細(xì)胞LOVO周期的影響

流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期結(jié)果顯示，相對于NC組和Control組，miR?429 mimic組細(xì)胞LOVO在G0G1期、S期、G2M期細(xì)胞所占百分比減少（均P＜0.05），見圖5。說明過表達(dá)miR?429能使細(xì)胞阻滯在G0G1期。

圖5 過表達(dá)miR?429對LOVO細(xì)胞周期的影響Fig.5 Effect of miR?429 overexpression on cell cycle of LOVO cells

2.6 過表達(dá)miR?429對結(jié)直腸癌細(xì)胞LOVO增殖的影響

MTT法檢測結(jié)果顯示，從4～6 d開始，miR?429 mimic組中細(xì)胞增殖能力較Control組和NC組顯著降低（均P＜0.001），見圖6。說明過表達(dá)miR?429能抑制LOVO細(xì)胞增殖。

圖6 過表達(dá)miR?429對LOVO細(xì)胞增殖的影響Fig.6 Effect of miR?429 overexpression on the proliferation of LOVO cells

3 討論

miRNAs是一種較小的內(nèi)源性非編碼RNA分子，普遍存在于單核原始生物及復(fù)雜的真核生物中，并在進(jìn)化過程中表現(xiàn)保守，因此得以保證其功能的特殊性［9］。研究發(fā)現(xiàn)miRNA在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要作用，對癌性基因有一定促進(jìn)功能，甚至可以直接促進(jìn)癌細(xì)胞分化、轉(zhuǎn)移、增殖，最終形成惡性腫瘤［10］。但是miRNA發(fā)揮抑癌或者促癌作用都直接受細(xì)胞表達(dá)方式和細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的影響［11］。

miR?429屬于miR?200家族，具有高度保守、基因簇集現(xiàn)象、時序性和組織特異性等生物學(xué)特性［12］。該家族在部分腫瘤（肝癌、腎細(xì)胞癌）中呈低表達(dá)，而在一些腫瘤（膀胱癌、宮頸癌）中呈高表達(dá)［13］。關(guān)于miR?429，常靚等［14］在胃癌組織中發(fā)現(xiàn)miR?429表達(dá)顯著低于癌旁正常組織，提示其在胃癌中可能起抑癌基因作用。呂桂帥等［15］報道m(xù)iR?429可以調(diào)節(jié)肝細(xì)胞癌的炎性微環(huán)境、分化及增殖。LI等［16］在過表達(dá)miR?429的子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中觀察到了細(xì)胞增殖抑制和凋亡增加，而在乳腺癌中miR?429則促進(jìn)細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移［17］。但是目前miR?429在結(jié)直腸癌中的作用鮮有研究。

SIAH家族蛋白與果蠅屬SINA蛋白屬于同系物，其中SINA屬于人體中的高度保守蛋白，與SIAH1和SIAH2同源。SIAH1在人體16q12號染色體中表達(dá)水平比較高，其編碼長度可達(dá)282個氨基酸，與果蠅屬SINA的序列機(jī)構(gòu)有76%的相似度，與SIAH1有77%的同一性［18］。然而SIAH1和SIAH2蛋白在N端有顯著差別。SIAH1蛋白具有E3泛素連接酶的活性，作為泛素連接酶之一，能夠在細(xì)胞正常發(fā)展及人類疾病過程中發(fā)揮調(diào)節(jié)蛋白穩(wěn)定、復(fù)雜蛋白的組裝的功能［19］。這些蛋白包括β?catenin、c?myb、APC和SIAH1本身。目前認(rèn)為SIAH1屬于抑制腫瘤發(fā)生的重要蛋白，在肝癌患者細(xì)胞系中發(fā)現(xiàn)SIAH1表達(dá)存在高活躍性，其水平越高，肝癌細(xì)胞凋亡數(shù)目越多，從而發(fā)揮抑癌作用［20］。同時，也有研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌患者中SIAH1表達(dá)可作用于有絲分裂細(xì)胞，從而抑制細(xì)胞增殖和生長，逐漸促進(jìn)癌細(xì)胞走向凋亡［21］。另有研究表明，SIAH1依附或獨立存在于p53細(xì)胞中，可促進(jìn)細(xì)胞凋亡，產(chǎn)生抑制惡性腫瘤進(jìn)展的作用［22］?？梢?，SIAH1在腫瘤發(fā)生、進(jìn)展、凋亡中敏感性較高，在多種惡性腫瘤中表達(dá)異常。但是，關(guān)于SIAH1在結(jié)直腸癌中的表達(dá)研究有限。

miRNA主要通過與靶基因3′?UTR區(qū)的互補序列完全或不完全結(jié)合，導(dǎo)致靶基因的降解而發(fā)揮負(fù)性調(diào)控作用［23］。本研究利用雙熒光素酶報告基因?qū)嶒炞C實SIAH1基因的3′?UTR區(qū)有miR?429的結(jié)合位點，提供了miR?429靶向調(diào)控SIAH1基因的結(jié)構(gòu)學(xué)證據(jù)。然后進(jìn)一步將SIAH1 3′?UTR區(qū)序列經(jīng)PCR擴(kuò)增后連接入雙熒光素酶報告載體，并將突變的SIAH1的3′?UTR區(qū)（mutUTR）設(shè)置為對照，用 miR?429 mimic與上述重組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染LOVO細(xì)胞，結(jié)果證實了miR?429通過與SIAH1基因3′?UTRs區(qū)的結(jié)合位點相結(jié)合來發(fā)揮負(fù)性調(diào)控作用。而既往研究顯示miRNA調(diào)控基因表達(dá)的主要方式是通過一種未知方式誘發(fā)蛋白質(zhì)翻譯抑制從而抑制蛋白質(zhì)合成［24?25］。因此，本研究再利用免疫印跡方法對各處理組的SIAH1基因蛋白質(zhì)水平進(jìn)行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)過表達(dá)miR?429的LOVO細(xì)胞中SIAH1蛋白表達(dá)水平明顯降低，說明miR?429可能通過負(fù)向調(diào)控SIAH1基因的降解發(fā)揮作用，為miR?429調(diào)控SIAH1提供了功能學(xué)證據(jù)。本研究的MTT實驗和流式細(xì)胞儀檢測還發(fā)現(xiàn)過表達(dá)miR?429后，LOVO細(xì)胞的增殖速度明顯減慢，對細(xì)胞的S～G2M期阻滯也證明了能抑制細(xì)胞增殖，說明miR?429負(fù)向調(diào)控SIAH1基因后抑制了結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖。

綜上所述，本研究初步證實了miR?429可以靶向調(diào)控SIAH1基因的表達(dá)而抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的過度生長、增殖。由此推測，當(dāng)正常的結(jié)直腸癌細(xì)胞由于甲基化等原因使miR?429表達(dá)沉默，導(dǎo)致其抑癌功能喪失，從而可能促進(jìn)結(jié)直腸癌的形成。但是miR?429的確切作用機(jī)制以及同細(xì)胞調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的相互作用等仍有待進(jìn)一步研究。本研究結(jié)果對進(jìn)一步揭示miRNA功能，以及結(jié)直腸癌發(fā)生的分子生物學(xué)機(jī)制研究及早期腫瘤診斷和治療提供了新的方向。