李 軍 王宏坤 萬(wàn)海玉 王 博 鄭繪霞

甲狀腺乳頭狀癌(papillary thyroid carcinoma，PTC)約占所有甲狀腺惡性腫瘤的85%[1,2]。經(jīng)外科手術(shù)和放射性碘治療后預(yù)后良好，10年生存率超過(guò)90%。但仍有部分患者表現(xiàn)出不良預(yù)后，例如疾病復(fù)發(fā)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移甚至死亡。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(lymph node metastasis, LNM)是PTC局部復(fù)發(fā)的主要因素，也是死亡的顯著危險(xiǎn)因素，其發(fā)生率為20%～50%，因此早期識(shí)別PTC頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯得尤為重要[3～7]。

環(huán)氧合酶-2(COX-2)是一種多效性酶，在惡性腫瘤細(xì)胞的癌變過(guò)程和對(duì)腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵作用[8]。核受體輔激活子5(NCOA5)是一種增強(qiáng)雌激素受體轉(zhuǎn)錄活性的獨(dú)特輔助激活因子，最近的研究表明，NCOA5缺乏導(dǎo)致了腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移[9]。但是這些抗體在甲狀腺腫瘤侵襲與轉(zhuǎn)移中的研究甚少。

對(duì)象與方法

1.一般資料：收集山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院2019年度因PTC進(jìn)行手術(shù)治療的患者，所有病例均由兩位高年資病理醫(yī)生重新閱片。納入標(biāo)準(zhǔn)：①術(shù)前行超聲影像學(xué)檢查；②術(shù)前未進(jìn)行放療、化療、內(nèi)分泌等其他治療；③既往無(wú)甲狀腺疾病手術(shù)史。排除標(biāo)準(zhǔn)：①排除同時(shí)患有其他惡性腫瘤的患者；②排除臨床病例資料不全的患者。最終共篩選出117例(其中頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者65例，未發(fā)生轉(zhuǎn)移的患者52例)，患者年齡為19～77歲，平均年齡43歲；腫瘤最大直徑為1～22mm；腫瘤分化程度：高分化49例，中分化+低分化68例；侵犯包膜58例，未侵犯包膜59例；采用第8版美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì)(American Joint Committee on Cancer，AJCC)TNM分期，Ⅰ～Ⅱ期57例，Ⅲ～Ⅳ期60例[10]。另選取癌旁組織66例作為對(duì)照。收集相應(yīng)患者頸部超聲資料：①是否出現(xiàn)鈣化;②高回聲;③周邊血流是否有異常信號(hào)。

2.實(shí)驗(yàn)試劑及方法：所有標(biāo)本均經(jīng)10%甲醛溶液固定、脫水機(jī)脫水、浸蠟，2μm厚石蠟組織連續(xù)切片，免疫組織化學(xué)染色采用Envision法。CK19、BRAFV600E、COX-2及DAB顯色試劑盒均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，NCOA5試劑盒購(gòu)自艾博抗(上海)貿(mào)易有限公司。

3.結(jié)果判讀：COX-2陽(yáng)性判讀標(biāo)準(zhǔn)：陽(yáng)性著色定位于細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)，CD31陽(yáng)性著色定位于細(xì)胞膜，NCOA5陽(yáng)性著色定位于細(xì)胞核，BRAFV600E陽(yáng)性著色定位于細(xì)胞質(zhì)，且均呈淡黃色至棕褐色粗顆粒。每張免疫組織化學(xué)切片均采用計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)百分比和陽(yáng)性細(xì)胞顯色程度的方式進(jìn)行表達(dá)結(jié)果評(píng)分[11]。(1)陽(yáng)性細(xì)胞百分比的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：<5%計(jì)0分，5%～25%計(jì)1分，25%～50%計(jì)2分，50%～75%計(jì)3分，>75%計(jì)4分。(2)陽(yáng)性細(xì)胞顯色程度評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：不顯色或顯色不清計(jì)0分，淺黃色計(jì)1分，棕黃色計(jì)2分，深褐色計(jì)3分。(3)陽(yáng)性結(jié)果判讀：采用Remmele半定量法，陽(yáng)性細(xì)胞百分比和顯色程度的乘積，0～1分計(jì)(-)，>1分計(jì)(+)。

4.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)，正態(tài)分布計(jì)量資料組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，偏態(tài)分布計(jì)量資料組間比較采用校正t檢驗(yàn)，多因素分析采用Logistic回歸分析，相關(guān)性采用Pearson相關(guān)性分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與臨床病理關(guān)系:對(duì)117例PTC患者一般資料中淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與臨床病理之間的關(guān)系進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果顯示，PTC中淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移與患者的年齡、性別、腫瘤發(fā)生的部位、腫瘤最大徑比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。PTC中淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶與腫瘤的分期、腫瘤的分化程度、腫瘤是否侵犯包膜比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，高分期(AJCC分期Ⅲ期+Ⅳ期)、中低分化的腫瘤、腫瘤侵犯包膜均為PTC頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的危險(xiǎn)因素。在超聲影像學(xué)中，頸部淋巴結(jié)周?chē)霈F(xiàn)異常血流信號(hào)為淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶的危險(xiǎn)因素，其他指標(biāo)如淋巴結(jié)中有鈣化灶及高回聲信號(hào)均不是淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶的危險(xiǎn)因素(表1、表2)。

表2 PTC頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與臨床病理之間的關(guān)系

2.免疫組織化學(xué)染色結(jié)果與臨床病理特征之間的關(guān)系:(1)NCOA5、COX-2陽(yáng)性表達(dá)與臨床病理特征之間的關(guān)系:在PTC中，NCOA5的免疫組織化學(xué)染色結(jié)果為陰性表達(dá)(圖1)，其陽(yáng)性表達(dá)率為31.6%(37/117)，顯著低于癌旁組織中的90.9%(60/66)，而COX-2在癌組織中為陽(yáng)性表達(dá)(圖2)，其陽(yáng)性表達(dá)率為73.5%(86/117)，顯著高于癌旁組織中的10.6%(7/66)，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。NCOA5和COX-2蛋白的表達(dá)情況與腫瘤的分期、分化程度、腫瘤侵犯包膜、頸部淋巴結(jié)是否有轉(zhuǎn)移灶、頸部超聲周邊是否有異常血流信號(hào)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表3)。(2)CD31血管陽(yáng)性及BRAFV600E陽(yáng)性表達(dá)與臨床病理特征之間的關(guān)系：在PTC中，BRAFV600E呈現(xiàn)陽(yáng)性表達(dá)(圖3)，其陽(yáng)性表達(dá)率為76.9%(90/117)，顯著高于癌旁組織中的9.1%(6/66)，CD31在癌組織周?chē)律苤斜憩F(xiàn)為血管陽(yáng)性(圖4)，其表達(dá)率為78.6%(92/117)，顯著高于癌旁組織中的12.1%(8/66)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。BRAFV600E蛋白的表達(dá)情況及CD31在癌組織周?chē)律苤械谋磉_(dá)情況與腫瘤的分期、分化程度、腫瘤侵犯包膜、頸部淋巴結(jié)是否有轉(zhuǎn)移灶、頸部超聲周邊是否有異常血流信號(hào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表4)。

圖1 NCOA5在甲狀腺癌組織中的表達(dá)(Envision法，×100)A.在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，為陰性表達(dá)；B.在無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，呈細(xì)胞膜及胞質(zhì)陽(yáng)性表達(dá)

圖2.COX-2在甲狀腺癌組織中的表達(dá)(Envision法，×100)A.在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，呈細(xì)胞膜及胞質(zhì)陽(yáng)性表達(dá)；B.在無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，為陰性表達(dá)

表3 NCOA5、COX-2蛋白表達(dá)與臨床病理特征之間的關(guān)系[n(%)]

圖3 BRAFV600E在甲狀腺癌組織中表達(dá)(Envision法，×100)A.在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，呈胞質(zhì)陽(yáng)性表達(dá)；B.在無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，為陰性表達(dá)

圖4 CD31在甲狀腺癌組織腫瘤周?chē)律苤械谋磉_(dá)(Envision法，×100)A.在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，可見(jiàn)大量新生血管內(nèi)皮細(xì)胞呈細(xì)胞膜陽(yáng)性表達(dá)；B.在無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，為陰性表達(dá)

表4 CD31、BRAFV600E蛋白表達(dá)與臨床病理特征之間的關(guān)系[n(%)]

3.CD31在癌組織中新生血管陽(yáng)性率與NCOA5、COX-2、BRAFV600E陽(yáng)性率一致性分析:CD31在癌組織中新生血管的陽(yáng)性率與COX-2和BRAFV600E的陽(yáng)性率呈正相關(guān)，與NCOA5的陽(yáng)性率呈負(fù)相關(guān)，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)有意義(P<0.05)。

4.PTC頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移多因素Logistics回歸分析:多元Logistics回歸分析模型檢驗(yàn)(χ2=42.767，P<0.05)，模型有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義且擬合程度較好。從多元Logistics回歸分析結(jié)果來(lái)看，頸部淋巴結(jié)超聲影像學(xué)中頸部淋巴結(jié)周邊血流信號(hào)異常、免疫組織化學(xué)染色結(jié)果NCOA5在癌組織陰性表達(dá)、COX-2在癌組織陽(yáng)性表達(dá)均為PTC頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。其中，超聲影像學(xué)中頸部淋巴結(jié)周邊血流信號(hào)異常征象的患者，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)增加2.484倍；免疫組織化學(xué)染色中，COX-2在癌組織中陽(yáng)性表達(dá)的患者有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)是無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的2.9倍，NCOA5在癌組織中陰性表達(dá)的患者有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)是無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的2.583倍(表5)。

表5 PTC頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移多因素Logistics回歸分析

討 論

本研究在對(duì)PTC患者頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與臨床病理特征之間的聯(lián)系中發(fā)現(xiàn)，頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與腫瘤的分期、分化程度以及是否侵犯包膜之間密切相關(guān)，然而，本研究中多元Logistics回歸分析表明，這些因素并不是頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，可能與收集的樣本量不足有關(guān)。頸部淋巴結(jié)超聲周邊血流異常信號(hào)為頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶超聲征象中的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)NCOA5蛋白表達(dá)在PTC高分期、中低分化、侵犯包膜、頸部有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶、頸部超聲周邊血流異常信號(hào)中的陽(yáng)性率低于低分期、高分化、未侵犯包膜、頸部無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶、頸部超聲周邊血流無(wú)異常信號(hào)中的陽(yáng)性率；而COX-2蛋白表達(dá)在PTC高分期、中低分化、侵犯包膜、頸部有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶、頸部超聲周邊血流異常信號(hào)中的陽(yáng)性率高于低分期、高分化、未侵犯包膜、頸部無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶、頸部超聲周邊血流無(wú)異常信號(hào)中的陽(yáng)性率，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

有研究表明NCOA5的弱表達(dá)能夠增加白細(xì)胞介素6的表達(dá)并增強(qiáng)肝細(xì)胞肝癌的易感性[12]。NCOA5作為一種隨機(jī)的腫瘤抑制因子，與鄰近的非癌組織比較，在40%肝細(xì)胞肝癌樣本中觀(guān)察到NCOA5的表達(dá)水平顯著降低，研究表明NCOA5能夠通過(guò)下調(diào)P27，激活PI3K/Akt信號(hào)通路，促進(jìn)腸癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[13,14]。因此NCOA5在直腸癌中可能發(fā)揮著促癌作用。同樣地，在骨肉瘤中，NCOA5在癌組織的表達(dá)相對(duì)正常組織較低[15]。

本研究中NCOA5在癌組織中的陰性表達(dá)與腫瘤的臨床分期、分化程度、侵犯包膜頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)，提示該蛋白與臨床病理特征及其在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著作用，但其表達(dá)降低的機(jī)制當(dāng)前并不明確，需進(jìn)一步加強(qiáng)相關(guān)研究。因此PTC的診療中，加強(qiáng)對(duì)NCOA5蛋白表達(dá)情況的研究，針對(duì)低表達(dá)采取對(duì)應(yīng)的處理措施，從而改善患者預(yù)后。

有研究表明COX-2數(shù)量的增加可激活腫瘤的免疫逃逸，在多發(fā)性骨髓瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要的作用，此外，研究表明在結(jié)直腸癌中COX-2、PI3K/Akt信號(hào)通路與腫瘤轉(zhuǎn)移等相關(guān)[16,17]。在結(jié)腸癌中IL-13可能調(diào)控COX-2和PI3K/Akt信號(hào)通路，影響結(jié)腸癌發(fā)生、發(fā)展。COX-2和PI3K/Akt信號(hào)通路隨著IL-13表達(dá)變化而變化，提示IL-13可能通過(guò)上調(diào)COX-2和PI3K/Akt信號(hào)通路相關(guān)基因表達(dá)從而促進(jìn)結(jié)腸癌侵襲轉(zhuǎn)移[17,18]。

本研究中COX-2在癌組織的高表達(dá)與臨床分期、腫瘤分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等之間密切相關(guān)，提示COX-2在促進(jìn)PTC的進(jìn)展。多元Logistics回歸分析結(jié)果表明，COX-2在癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)、NCOA5在癌組織中的陰性表達(dá)及頸部淋巴結(jié)超聲中的血流異常信號(hào)為淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，且Pearson相關(guān)性分析結(jié)果表明，CD31在癌組織中新生血管的陽(yáng)性率與COX-2和BRAFV600E的陽(yáng)性率之間呈正相關(guān)，與NCOA5的陽(yáng)性率呈負(fù)相關(guān)，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)有意義。PI3K家族是細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，參與調(diào)控多種信號(hào)通路[19]。

PI3K/Akt信號(hào)通路在人類(lèi)腫瘤譜中廣泛失調(diào)，PI3K和其下游分子Akt所組成的信號(hào)通路不僅調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增殖和存活，與腫瘤的血管新生過(guò)程、侵襲轉(zhuǎn)移行為也密切相關(guān)[20]。因此，可猜測(cè)，COX-2、NCOA5在PTC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中可能通過(guò)微血管的生成來(lái)促進(jìn)腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移，其具體的機(jī)制仍有待于進(jìn)一步研究證實(shí)。在后續(xù)的研究中，可以通過(guò)分子水平的研究，以及針對(duì)COX-2和NCOA5開(kāi)展分子靶向治療，為淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的具體分子機(jī)制揭示更多的循證醫(yī)學(xué)資料，為淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移這類(lèi)具有惡性生物學(xué)行為的患者提供更多的診療思路。

綜上所述，COX-2的陽(yáng)性表達(dá)和NCOA5的陰性表達(dá)模式與PTC的臨床病理特征及頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，可作為PTC臨床診療及評(píng)估頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的重要依據(jù)。