龔建明 林 琪

卵巢癌是女性生殖器官常見的惡性腫瘤之一，病死率占各類婦科腫瘤的首位，由于缺乏有效的早期診斷方法，卵巢癌患者確診時(shí)約2/3已為晚期。現(xiàn)臨床上出現(xiàn)耐藥的患者日益增多，且化療藥不良反應(yīng)較多，對(duì)于晚期卵巢癌患者難以取得滿意的療效。

告達(dá)庭是一類傳統(tǒng)中藥具有悠久歷史，現(xiàn)已被證明具有較強(qiáng)的抗腫瘤活性，其對(duì)宮頸癌、肺癌、肝癌等多種惡性腫瘤均有較明顯的抑制作用，其可通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的表達(dá)抑制腫瘤的生長(zhǎng)與擴(kuò)散[1，2]。但其具體作用機(jī)制尚不明確。本實(shí)驗(yàn)探討告達(dá)庭對(duì)卵巢癌增殖凋亡的影響及其作用機(jī)制，為告達(dá)庭應(yīng)用于臨床治療卵巢癌提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

材料與方法

1.材料：人卵巢癌細(xì)胞株SKOV3購自中科院上海細(xì)胞庫。告達(dá)庭標(biāo)準(zhǔn)品(純度大于98%)購自深圳美荷生物科技有限公司；CCK-8試劑盒、檢測(cè)凋亡ELISA試劑盒購自美國Sigma公司；胎牛血清、RPMI1640、核蛋白提取試劑盒購自上海索萊寶生物科技有限公司；DNMT1、Axin、Bcl-2、cyclinD1抗體購自美國Sigma公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、定量PCR試劑盒購自美國Thermo Fisher Scientific公司。

2.細(xì)胞培養(yǎng)及分組：用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，置37℃、5%的CO2、相對(duì)飽和濕度下培養(yǎng)。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分為兩組，即對(duì)照組(未予藥物干預(yù))和告達(dá)庭組(30μmol/L告達(dá)庭作用SKOV3細(xì)胞24h)。

3.CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖：收集處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SKOV3細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，接種到96孔板，各孔細(xì)胞均勻，每孔細(xì)胞數(shù)約5×103，過夜貼壁后，分別加入不同濃度告達(dá)庭(7.5、15、30、60μmol/L)，每組3孔，置37℃培養(yǎng)箱作用24h，同時(shí)設(shè)置空白調(diào)零組(不加細(xì)胞加入等量的培養(yǎng)液)，以及對(duì)照組(加等量的0.9%氯化鈉溶液)，藥物作用結(jié)束前1h，各孔加入CCK-8溶液10μl，繼續(xù)培養(yǎng)1h，酶標(biāo)儀測(cè)A450值，細(xì)胞活力=(實(shí)驗(yàn)組A450值-空白調(diào)零組A450值)/(對(duì)照組A450值-空白調(diào)零組A450值)×100%。

4.ELISA法檢測(cè)細(xì)胞凋亡：各組細(xì)胞離心后，用200μl溶細(xì)胞緩沖液重新懸浮，作用30min。取上述樣品，1200r/min離心10min后，吸取20μl上清液，加入培養(yǎng)板孔中。另加入80μl免疫反應(yīng)試劑，置搖床上孵育2h。取上清，加入100μl底物緩沖液，室溫下孵育使顏色變化至適合。盡快做比色分析，用底物緩沖液作空白對(duì)照，以檢測(cè)波長(zhǎng)405nm，參考波長(zhǎng)492nm進(jìn)行檢測(cè)。

5.Western blot法檢測(cè)卵巢癌SKOV3細(xì)胞內(nèi)蛋白的表達(dá)：收集各組細(xì)胞，加入含有PMSF的細(xì)胞裂解液，提取上清液為細(xì)胞總蛋白。按試劑盒說明書提取細(xì)胞質(zhì)蛋白、細(xì)胞核蛋白。測(cè)定蛋白濃度后取等量蛋白質(zhì)樣品上樣，于12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳2h，轉(zhuǎn)膜，用10%脫脂奶粉封閉后加入一抗，4℃過夜，再度洗膜，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育2h，ECL顯色，X線膠片曝光，用軟件Quantity One分析條帶灰度值。

6.實(shí)時(shí)熒光定量PCR：引物由TaKaRa公司設(shè)計(jì)合成。取移植瘤標(biāo)本組織，按試劑盒說明書提取組織總RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA。反應(yīng)條件：預(yù)變性93℃ 20s，變性92℃ 18s，退火58℃ 26s，延伸70℃ 15s，共43個(gè)循環(huán)。實(shí)時(shí)PCR結(jié)果以達(dá)到閾值的最低循環(huán)數(shù)Ct值表示。目的基因的相對(duì)表達(dá)量fold=2-△△Ct?！鳌鰿t表示告達(dá)庭組和對(duì)照組間的△Ct值差異。引物序列詳見表1。

7.裸鼠卵巢癌皮下移植瘤的建立：選擇8～10周齡雌性BALB/c裸鼠，體質(zhì)量18～20g，將3×106個(gè)SKOV3細(xì)胞懸浮于0.2ml培養(yǎng)基中，注射到裸鼠腋下皮膚內(nèi)建立裸鼠卵巢癌皮下移植瘤模型，接種2周后，待移植瘤直徑長(zhǎng)至約10mm。再將這些裸鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、告達(dá)庭小、中、大劑量組，每組8只。對(duì)照組：灌胃予0.9%氯化鈉溶液1毫升/只；小劑量組：灌胃予告達(dá)庭10mg/kg；中劑量組：灌胃予告達(dá)庭20mg/kg；大劑量組：灌胃予告達(dá)庭40mg/kg。隔日給藥1次，共2周。第8周處死裸鼠留取皮下移植瘤組織。

結(jié) 果

1.告達(dá)庭對(duì)卵巢癌SKOV3細(xì)胞增殖的影響:卵巢癌SKOV3細(xì)胞經(jīng)不同濃度告達(dá)庭(7.5、15、30、60μmol/L)作用24h后，細(xì)胞存活率分別為91.73%±4.67%、83.12%±7.56%、59.48%±5.37%、41.63%±3.48%。與對(duì)照組100.00%±0比較，均明顯下調(diào)(P均<0.01)。告達(dá)庭可抑制卵巢癌SKOV3細(xì)胞增殖，呈濃度依賴性，IC50為38μmol/L，故選30μmol/L作為本實(shí)驗(yàn)的基本藥物濃度，選15、60μmol/L為小劑量、大劑量藥物濃度。

2.告達(dá)庭對(duì)卵巢癌SKOV3細(xì)胞凋亡的影響：不同濃度告達(dá)庭(15、30、60μmol/L)作用SKOV3細(xì)胞24h后，分別誘導(dǎo)9.35%±0.71%、14.37%±0.96%和18.54%±1.02%的SKOV3細(xì)胞凋亡，與對(duì)照組5.51%±0.38%比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

3.告達(dá)庭對(duì)卵巢癌SKOV3細(xì)胞內(nèi)Bcl-2、CyclinD1蛋白表達(dá)的影響：與對(duì)照組比較，告達(dá)庭組Bcl-2、CyclinD1蛋白的表達(dá)均下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表明告達(dá)庭可抑制SKOV3細(xì)胞內(nèi)Bcl-2、CyclinD1蛋白的表達(dá)(圖1)。

圖1 告達(dá)庭對(duì)卵巢癌SKOV3細(xì)胞內(nèi)Bcl-2、CyclinD1蛋白表達(dá)的影響1.對(duì)照組；2.告達(dá)庭組

4.告達(dá)庭對(duì)卵巢癌SKOV3細(xì)胞內(nèi)DNMT1、Axin、Nuclear β-catenin蛋白表達(dá)的影響:與對(duì)照組比較，告達(dá)庭組DNMT1、Nuclear β-catenin蛋白的表達(dá)均下降，Axin蛋白表達(dá)上調(diào)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,圖2)。

圖2 告達(dá)庭對(duì)卵巢癌SKOV3細(xì)胞內(nèi)DNMT1、Axin、Nuclear β-catenin蛋白表達(dá)的影響1.對(duì)照組；2.告達(dá)庭組

5.告達(dá)庭對(duì)裸鼠卵巢癌皮下移植瘤生長(zhǎng)的抑制作用：與對(duì)照組比較，告達(dá)庭組小劑量組、中劑量組、大劑量組瘤重均減輕，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。告達(dá)庭大劑量組與中劑量組、小劑量組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，中劑量組與小劑量組比較差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,表2)。

表2 告達(dá)庭對(duì)裸鼠卵巢癌皮下移植瘤生長(zhǎng)的抑制作用

6.告達(dá)庭對(duì)裸鼠腫瘤組織中DNMT1、Axin、Bcl-2和cyclinD1 mRNA表達(dá)的影響:與對(duì)照組比較，告達(dá)庭組裸鼠腫瘤組織內(nèi)DNMT1、Bcl-2和cyclinD1 mRNA表達(dá)均下降，Axin mRNA表達(dá)升高(表3)。

表3 告達(dá)庭對(duì)裸鼠腫瘤組織中DNMT1、Axin、Bcl-2和cyclinD1 mRNA表達(dá)的影響

討 論

白首烏是具有強(qiáng)筋骨、黑發(fā)、補(bǔ)肝腎及延年益壽等功效的傳統(tǒng)補(bǔ)益中藥，現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)白首烏具有抗腫瘤、抗衰老、增強(qiáng)免疫等藥理活性。告達(dá)庭是從白首烏中提取純化的一種C-21甾體苷元，體外研究表明告達(dá)庭對(duì)人胃癌、結(jié)腸癌、肝癌、肺癌等多種腫瘤均有明顯抑制作用。

本實(shí)驗(yàn)證明，與對(duì)照組比較，告達(dá)庭組卵巢癌SKOV3細(xì)胞增殖率均明顯下調(diào)，而凋亡率升高，且呈劑量依賴性；在裸鼠移植瘤實(shí)驗(yàn)中，亦觀察到告達(dá)庭抑制卵巢癌移植瘤的生長(zhǎng)。細(xì)胞及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均表明告達(dá)庭能抑制卵巢癌生長(zhǎng)。已有相關(guān)的研究報(bào)道，告知庭的抗腫瘤機(jī)制可能與Wnt/β-catenin信號(hào)通路有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究顯示告達(dá)庭抗卵巢癌機(jī)制可能與此通路相關(guān)。

Wnt/β-catenin信號(hào)通路可調(diào)控細(xì)胞分化、增殖和凋亡等生理過程，與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[3]。細(xì)胞質(zhì)中β-catenin轉(zhuǎn)錄到核內(nèi)與TCF/LEF結(jié)合而激活下游靶基因(CyclinD1、Bcl-2、MMP-7、c-myc等癌基因)的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)細(xì)胞增殖，癌變[4]。近年來發(fā)現(xiàn)許多抗癌研究以β-catenin為靶點(diǎn)[5，6]。本實(shí)驗(yàn)證明告達(dá)庭可抑制Nuclear β-catenin表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)接下來闡述告達(dá)庭對(duì)β-catenin下游靶基因的影響，及下調(diào)β-catenin表達(dá)可能機(jī)制。

CyclinD1蛋白為原癌基因是細(xì)胞周期蛋白家族中的重要成員。CyclinD1通過與細(xì)胞周期依賴激酶形成復(fù)合物，在細(xì)胞周期的G1早期起重要調(diào)控作用。CyclinD1在絲裂原刺激下持續(xù)表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞增生，與細(xì)胞癌變及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。有研究顯示，與正常及良性腫瘤組織比較，卵巢癌組織中CyclinD1陽性表達(dá)率高，并隨卵巢癌惡性程度升高而表達(dá)增加[7]。

Bcl-2基因是從B細(xì)胞濾泡性淋巴瘤染色體斷裂點(diǎn)發(fā)現(xiàn)的凋亡抑制基因，可抑制多種組織細(xì)胞的凋亡。Bcl-2在宮頸、乳腺、卵巢等腫瘤組織中均有不同程度的表達(dá)，且與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后有關(guān)。有研究表明，在良性卵巢腫物中Bcl-2的表達(dá)低于交界性、惡性腫瘤，且Bcl-2過表達(dá)與腫瘤轉(zhuǎn)移、進(jìn)展密切相關(guān)[8]。

本實(shí)驗(yàn)證明，在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中與對(duì)照組比較，告達(dá)庭組CyclinD1、Bcl-2蛋白表達(dá)均下降；在體外移植瘤實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)告達(dá)庭組CyclinD1、Bcl-2 mRNA表達(dá)亦下調(diào)，且CyclinD1、Bcl-2與卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。表明告達(dá)庭可通過抑制CyclinD1、Bcl-2在卵巢癌細(xì)胞及組織中表達(dá)，促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞凋亡，發(fā)揮抗癌作用。

DNMT1是DNA甲基轉(zhuǎn)移酶家族重要成員。DNMT1是可調(diào)節(jié)DNA甲基化，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展也有密切關(guān)系。抑癌基因的甲基化會(huì)引起抑癌基因失活，使其對(duì)腫瘤的抑制喪失，促進(jìn)癌細(xì)胞增殖。原癌基因的低甲基化會(huì)使癌細(xì)胞不斷增殖形成腫瘤[9，10]。相關(guān)的研究顯示，與正常卵巢組織比較，DNMT1在卵巢癌組織中的陽性率明顯升高，且分期越晚、病理分級(jí)越高，DNMT1陽性率越高[11]。

Axin又稱軸蛋白，其基因定位于第16條染色體的長(zhǎng)臂上。Axin 作為一種抑癌基因，影響著腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。卵巢癌組織中Axin陽性表達(dá)率明顯低于卵巢良性腫瘤，且與卵巢癌組織的轉(zhuǎn)移和浸潤(rùn)有一定的相關(guān)性[12，13]。

Axin 是Wnt/β-catenin信號(hào)通路的重要組成部分，作為 Wnt 信號(hào)通路的抑制因子而被廣泛研究。在Wnt/β-catenin信號(hào)途徑中，胞質(zhì)中的β-catenin與APC、Axin等降解復(fù)合物結(jié)合，進(jìn)一步被泛素化降解。當(dāng)Axin蛋白表達(dá)異常，β-catenin降解被阻斷，導(dǎo)致其在胞質(zhì)蓄積進(jìn)入核內(nèi)，促進(jìn)下游癌基因CyclinD1、Bcl-2表達(dá)[14]。另有文獻(xiàn)報(bào)道DNMT1可通過甲基化Axin基因，使Axin蛋白失活，減少β-catenin降解，促進(jìn)β-catenin核轉(zhuǎn)入，促進(jìn)癌細(xì)胞生長(zhǎng)[15]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與對(duì)照組比較，告達(dá)庭組DNMT1、Nuclear β-catenin蛋白表達(dá)均下降，Axin蛋白表達(dá)上升。表明告達(dá)庭可抑制DNMT1、Nuclear β-catenin蛋白表達(dá)，而上調(diào)Axin蛋白。其機(jī)制可能是告達(dá)庭抑制DNMT1表達(dá)后，Axin蛋白甲基化減少，Axin蛋白表達(dá)增加，促進(jìn)β-catenin降解，減少β-catenin核轉(zhuǎn)入，進(jìn)而降低下游癌基因CyclinD1、Bcl-2表達(dá)。

綜上所述，告達(dá)庭可能通過抑制DNMT1，減少DNA甲基化，上調(diào)Axin蛋白，進(jìn)而減少β-catenin核轉(zhuǎn)入，抑制下游癌基因表達(dá)，促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞凋亡。本研究為告達(dá)庭應(yīng)用于臨床治療提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，但告達(dá)庭具體的作用機(jī)制還需開展深入研究。