陳嘉寧 李 尤 高玉元 聶 坤 王麗娟

帕金森病(Parkinson′s disease, PD)，目前是僅次于阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease, AD)的第二大神經退行性疾病。然而，除了典型的三大運動癥狀——運動遲緩、肌肉強直和靜止性震顫外，PD的非運動癥狀也會嚴重影響患者的生活質量，其中認知功能障礙(cognitive impairment, CI)發(fā)生率高，且嚴重影響患者生活質量[1～3]。帕金森病認知功能障礙(PD-CI)分為帕金森病輕度認知功能障礙及帕金森病癡呆。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，在PD體外模型中過表達巨噬細胞游走抑制因子(macrophage migration inhibitory factor, MIF)可以保護多巴胺能神經元，并且減少神經元神經炎癥，而AD小鼠模型中敲除MIF會損傷小鼠認知功能，提示MIF可能參與PD甚至PD-CI的疾病過程[4，5]。miRNA-451作為MIF表達的上游通路，負性調控MIF表達[6，7]。研究發(fā)現(xiàn)，與健康對照比較，PD-MCI和帕金森病不伴認知障礙患者血清中的miRNA-451表達上調，但miRNA-451/MIF通路在PD-CI中的具體作用和機制尚不明確[8]。本研究通過體內干預PD小鼠模型腦組織中miRNA-451表達，以探究miRNA-451/MIF通路在PD-CI中的作用。

材料與方法

1.動物與耗材、試劑：SPF級C57BL/6小鼠共56只，6～8周齡，體質量約25～30g，由南方醫(yī)科大學動物實驗中心提供。本實驗已通過動物倫理審批(倫理號：GDREC2016095A)。1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶(1-Methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine，MPTP)購自美國西格瑪奧德里奇公司；miRNA-451 antagomir和miR-451 antagomir control購自廣州銳博生物有限公司；酪氨酸羥化酶(TH)抗體購自德國默克密理博公司；微型手持顱鉆、桌面數(shù)顯腦立體定位儀、單通道微量注射泵購自深圳市瑞沃德生命科技有限公司。

2.實驗動物的分組及疾病模型的構建：本研究采用亞急性帕金森病小鼠模型。將小鼠分為6組，分別為正常對照組(control組，n=14)、陰性對照組(NC組，n=6)、MPTP組(n=12)、假手術組(sham組，n=8)、miRNA-451 antagomir組(miR-in組，n=8)和miRNA-451 antagomir control組(miR-con組，n=8)。參考Gibrat等[9]的研究，對MPTP組、sham組、miR-in組和miR-con組腹腔注射MPTP，每天注射劑量為25mg/kg，連續(xù)注射7天。control組不做任何處理，NC組腹腔注射等劑量的0.9%氯化鈉溶液。sham組、miR-in組和miR-con組皆在第1次腹腔注射MPTP后當天，進行側腦室立體定向注射，共注射1次。注射方法：將小鼠固定在小鼠腦立體定位儀上，暴露顱骨前囟，根據(jù)腦圖譜在側腦室區(qū)(AP：-0.3mm，ML：-1mm，DV：-2.5mm)鉆孔，注射流量為0.5μl/min，共注射10min。sham組注射5μl的滅菌0.9%氯化鈉溶液，miR-in組注射miRNA-451 antagomir(1nmol/μl，共5μl)，miR-con組注射miRNA-451 antagomir control(1nmol/μl，共5μl)。

3.小鼠認知功能評估：末次腹腔注射MPTP后第14天進行Morris水迷宮評估小鼠的認知功能。Morris水迷宮為一圓形、白色池底的水池，直徑100cm，高50cm，水深30cm，水溫保持在23±2℃。在水池壁上均勻選取4個點作為起始點，將水池平均地分為4個象限。準備另一白色平臺，置于第三象限使平臺與池壁圓心距離相等，平臺直徑12cm，高29cm，高度在水下1cm，使平臺不可見。實驗分為定向航行實驗和空間探索實驗。(1)定向航行實驗：將小鼠順時針依次延第一、二、三、四象限池壁的正中位置、面向池壁輕輕放入水中，記錄60s內小鼠尋找平臺的活動。如果小鼠找到平臺的時間<60s，則該時間即為小鼠的逃逸潛伏期；如小鼠找到平臺的時間≥60s，則將逃逸潛伏期記錄為60s。實驗持續(xù)3天。逃逸潛伏期的長短可用于評價小鼠空間學習能力。(2)空間探索實驗：定向航行實驗結束后第2天，將第三象限平臺撤去，進行空間探索實驗。將小鼠于第一象限池壁正中、面向池壁輕輕放入水中，記錄小鼠60s內在原平臺象限游泳時間，可用于評價小鼠空間記憶儲存及提取再現(xiàn)的能力。

4.免疫組織化學檢測：行為學檢測后當天將小鼠斷頸、處死、取腦，將全腦組織固定、脫水、浸蠟、包埋等，制備組織蠟塊，進行黑質區(qū)冠狀位石蠟切片，每組取相同位置切片，進行脫蠟、脫水、熱修復，過氧化氫孵育，封閉液封閉1h，滴加TH抗體(1∶100)后4℃孵育過夜，用合適的二抗室溫孵育1h，滴加DAB顯色后PBS沖洗，遞增梯度乙醇脫水，二甲苯固定后封片，顯微鏡觀察。用Image-Pro Plus 6.0.0.260分析，比較各組黑質區(qū)TH染色的平均吸光度值[MOD，MOD(%)=積分吸光度值(IOD)/面積(area)×100%]。

5.尼氏染色：切片前步驟同免疫組化。石蠟切片脫蠟水化后，在室溫條件將切片浸入1%焦油紫水溶液中浸沒約5～10min(視溫度和各切片情況而定)。取出切片，蒸餾水沖洗10～20min，95%乙醇分色，鏡檢至神經元尼氏體清晰。同免疫組化遞增梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。

6.qRT-PCR檢測miRNA-451及MIF mRNA的表達：行為學檢測后當天將小鼠斷頸、處死、取腦，加入Trizol裂解液，經氯仿-異丙醇體系提取腦組織總mRNA，反轉錄合成相應的cDNA后進行qRT-PCR檢測。以U6為內參，采用2-ΔΔct法計算miRAN-451的相對表達量[10]；以GAPDH為內參，采用2-ΔΔct法計算MIF mRNA的相對表達量。

結 果

1.miRNA-451在不同認知功能的PD小鼠模型中的表達差異：連續(xù)3天的定向航行訓練中，MPTP組根據(jù)第3天定向航行訓練的潛伏期長短遞增排序，潛伏期較短的前6只小鼠為MPTP-1組，后6只為MPTP-2組。在第3天control組與NC組都表現(xiàn)出了空間學習能力，而腹腔注射MPTP組潛伏期較control組、NC組明顯延長(P<0.01)，其中，MPTP-2組較MPTP-1組潛伏期曲線更為平緩(圖1A)?？臻g探索實驗結果提示，腹腔注射MPTP組在原平臺象限游泳的時間較control組顯著減少(P<0.05，圖1B)。由于MPTP耗竭小鼠黑質紋狀體的多巴胺能細胞會引起運動遲緩或姿勢不穩(wěn)，對小鼠的運動能力和游泳速度有影響從而影響潛伏期結果，因此筆者比較了第3天定向航行實驗過程中各組小鼠游泳時的最大速度，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05，圖1C)。

圖1 小鼠Morris水迷宮結果A.小鼠平均潛伏期變化曲線，與control組比較，*P<0.01，**P=0.000；與NC組比較，#P<0.05，##P<0.01；B.小鼠空間探索實驗在原平臺象限時間；C.小鼠最大游泳速度比較

免疫組化對各組小鼠黑質區(qū)進行TH染色提示，MPTP腹腔注射會引起小鼠黑質區(qū)多巴胺能神經元細胞減少，其中MPTP-2組小鼠比MPTP-1組更少(P<0.01，圖2中A、B)；qPCR結果表明，PD組小鼠腦組織miRNA-451表達增多(P<0.01)，且MPTP-2組小鼠腦組織中miRNA-451表達較MPTP-1組增多，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，圖2C)。

圖2 各組小鼠中腦黑質部TH染色及miRNA-451表達A.小鼠黑質部酪氨酸羥化酶(TH)免疫組化染色結果(×1000)；B.TH免疫組化染色平均吸光度；C.小鼠腦組織miRNA-451表達qPCR結果

2.miRNA-451表達水平變化對PD小鼠認知功能的影響：qRT-PCR檢測結果表明，與sham組比較，側腦室立體定向注射miRNA-451 antagomir會降低MPTP腹腔注射小鼠腦組織內miRNA-451表達，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01，圖3A)，增加下游分子MIF mRNA的表達(P<0.01，圖3B)，并且可以緩解腹腔注射MPTP所致的認知功能的受損(P<0.05，圖4中A、B)，且結果不受小鼠運動能力和游泳速度的影響(圖4C)。

圖3 各組小鼠腦組織miRNA-451及MIF表達A.miRNA-451表達；B.MIF mRNA表達

圖4 小鼠Morris水迷宮結果A.平均潛伏期變化曲線，與miR-in組比較，*P<0.05；與control組比較，#P<0.05；B.小鼠空間探索實驗原平臺區(qū)域時間；C.小鼠最大游泳速度比較

免疫組化對各組小鼠黑質區(qū)進行TH染色(圖5)，sham組TH的MOD值較control組減少，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，而miR-in組MOD值明顯比sham組和miR-con組高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

圖5 各組小鼠中腦黑質部TH染色結果A.小鼠黑質部酪氨酸羥化酶(TH)免疫組化染色結果(×500)；B.酪氮酸羥化酶(TH)免疫組化染色平均吸光度

3.miRNA-451表達水平變化對PD小鼠海馬的影響：對各組小鼠海馬CA3區(qū)進行尼氏染色(圖6)可見，control組神經元排列均勻，形態(tài)規(guī)整，尼氏小體清晰可見。miR-in組神經元排列較均勻，稍有紊亂，細胞形態(tài)歸整，但尼氏小體較少，染色稍淺。sham組神經細胞有少量的神經細胞脫失，細胞間隙增大，排列稍有松散，未見尼氏小體。miR-con組神經元胞體腫脹明顯，尼氏體稍淡染，細胞間隙增大，神經元部分排列紊亂、稀疏，細胞間隙增寬，且整體著色較淡。miR-in組受損較sham組與miR-con組輕。

圖6 各組小鼠海馬CA3區(qū)尼氏染色情況比較(×1000)A.control組；B.sham組；C.miR-in組；D.miR-con組

討 論

帕金森病患者除了典型的運動癥狀外，在疾病早期即可出現(xiàn)認知功能障礙，并且先于運動癥狀的出現(xiàn)[11，12]。目前關于PD-CI的發(fā)生機制言論不一，目前主要認為與神經病理改變和神經化學遞質改變相關，病理改變主要涉及蛋白錯誤折疊、神經炎癥、小膠質和星形膠質細胞改變等，神經化學遞質改變則主要與多巴胺和乙酰膽堿相關[13]。本研究發(fā)現(xiàn)的認知改善可能由于下調miRNA-451后，增加了MIF的表達，從而產生了對多巴胺能神經元和海馬區(qū)細胞的保護作用。

miRNA屬于非編碼RNA，與mRNA結合后可以使其降解或抑制其翻譯過程，調控細胞代謝活動，許多miRNA可直接或間接調控與PD相關的基因或分子[14，15]。miRNA-451首次在人垂體中被發(fā)現(xiàn)，參與多種生理過程，其表達水平上調可以在體外增加膠質瘤細胞的凋亡，下調miRNA-451可以通過激活AMPK途徑產生促進細胞生存的作用，保護內皮細胞在糖氧剝奪條件下的程序性壞死[16，17]。在癲癇小鼠模型中下調miRNA-451可以保護海馬神經元細胞的凋亡，增加膠質細胞源性神經營養(yǎng)因子，減輕癲癇發(fā)作對腦組織的損傷[18]。而其在PD及PD認知障礙中的作用及機制鮮有報道，本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)miRNA-451的升高可能參與PD甚至PD認知障礙的發(fā)生及發(fā)展[8]。

本研究結果發(fā)現(xiàn)，miRNA-451在PD模型小鼠中表達增加，且伴有認知障礙的小鼠中增加更明顯，結合既往研究結果，認為可能與miRNA-451的抑制生長、促進凋亡作用相關。miRNA作為一種調控手段，行使生物功能還需依賴下游的分子蛋白。其中MIF受miRNA-451的負性調控，廣泛表達于各種細胞。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)，在PD體外模型中過表達MIF可以通過增加線粒體膜電位而抑制神經元細胞的凋亡，并且減少神經炎癥[4]。

Aβ淀粉樣蛋白會引起神經元細胞分泌MIF，且MIF分泌增加可以保護神經元免受Aβ誘導的細胞毒性作用，可能因其可以抑制p53的激活，從而減少Aβ誘導的神經元細胞凋亡[5，19]。由于MPTP也可通過激活p53引起細胞凋亡，本研究下調miRNA-451引起MIF表達增加后，可能通過抑制該通路而減少了多巴胺能神經元和海馬區(qū)神經元的凋亡，起到保護作用[20]。此外，由于神經炎癥也是PD及PD-CI的發(fā)病機制之一，抑制神經炎癥也是治療PD及PD-CI的策略之一。有研究發(fā)現(xiàn)，MIF在視網膜神經節(jié)細胞中可以抑制小膠質細胞的活化，可以減少小膠質細胞TNF-α的表達，說明MIF表達增加可以緩解神經炎癥起到保護作用，這可能也是本研究中PD小鼠認知障礙得以改善的原因之一[21，22]。

綜上所述，miRNA-451/MIF通路與PD及PD-CI的發(fā)生和發(fā)展密切相關，靶向下調miRNA-451或上調MIF表達可能對PD及PD-CI有保護作用，可以為PD及PD-CI的治療提供新的思路和方法，而其具體機制仍需進一步研究。