王路海，王錚，胡偉

【摘要】 目的：制備一種適用于熒光POCT儀器光路校準(zhǔn)的熒光微球校準(zhǔn)卡。方法：通過偶聯(lián)羧基熒光素和氨基聚苯乙烯微球制備熒光微球校準(zhǔn)卡，在熒光POCT儀器上進(jìn)行光路校準(zhǔn)應(yīng)用。結(jié)果：制備的熒光微球校準(zhǔn)卡精密度CV<4%，測值重復(fù)性CV<10%，具備較好的檢測性能;在避光、常溫和干燥的環(huán)境中，保存期限≥1年;應(yīng)用在熒光POCT儀器光路校準(zhǔn)的相對偏差<4%，滿足校準(zhǔn)要求。結(jié)論：制備了一種穩(wěn)定性好、時效性長、便攜的熒光微球校準(zhǔn)卡。

【關(guān)鍵詞】 熒光POCT儀器;熒光微球校準(zhǔn)卡;穩(wěn)定性;光路校準(zhǔn)

【DOI編碼】 10.3969/j.issn.1674-4977.2021.06.025

Preparation and Application of Fluorescence Microsphere

Calibration Card

WANG Lu-hai，WANG Zheng，HU Wei

（Getein Biotech，Inc.，Nanjing 210000，China）

Abstract： Abstract：To prepare a fluorescence microsphere calibration card suitable for optical path calibration of fluorescence POCT instrument. Methods： The calibration card of fluorescence microsphere was prepared by coupling carboxycellulose and amino polystyrene for precision. Results：The fluorescent microsphere calibration card precision is CV<4% and repeated CV<10%，with good detection performance;suitable for preservation in light avoidance，normal temperature and dry environment and ≥1 year;the relative deviation of optical path calibration of fluorescent POCT instrument <4%，meeting the calibration requirements. Conclusion：It prepared a good stability，long timeliness and portable accurate，simple and fast calibration of fluorescent POCT instrument.

Key words： fluorescent POCT instrument;fluorescent microsphere calibration card;stability;optical and road calibration

1 引言

熒光POCT儀器是常用于家庭健康監(jiān)測[1]和急診搶救[2]的一款快速檢測儀器，其檢測準(zhǔn)確性具有重要意義，但不同廠家儀器光路結(jié)構(gòu)、組件型號、裝配工藝等差異都會影響儀器檢測的客觀性，必須對其進(jìn)行校準(zhǔn)以期符合臨床檢測水平。此外，目前企業(yè)常用的光路校準(zhǔn)方法為滴加試劑條，存在展板時間長、測值時效短等問題，不利于企業(yè)量產(chǎn)儀器和市場儀器的校準(zhǔn)與維護(hù)。而熒光微球[3]是能激發(fā)高強度、穩(wěn)定熒光的材料[4-5]，在生命科學(xué)與醫(yī)學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用廣泛[6]。因此，本研究制備了一種適用于熒光POCT儀器光路校準(zhǔn)的熒光微球校準(zhǔn)卡，用于儀器的準(zhǔn)確、簡便、快速校準(zhǔn)。

2 材料與方法

2.1 材料與設(shè)備

10%氨基聚苯乙烯微球（東莞漢諾生物），蔗糖、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、EDC（1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽）等（阿拉丁試劑）、635 nm羧基熒光素、硝酸纖維素膜（NC膜）、干燥劑等（基蛋生物）。

加熱磁力攪拌器（濟南來寶醫(yī)療），HGS101全自動劃膜儀（杭州峰航科技），Getein 1600全自動熒光免疫定量分析儀（基蛋生物），電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（南京五和試驗設(shè)備）。

2.2 實驗方法

2.2.1 熒光微球校準(zhǔn)卡的制備

在50 mL圓底燒瓶中倒入30 mL 20 mM PB緩沖液（pH 7.4），依次加入5 mL 10%氨基微球和10 mg羧化熒光素，30 [℃]攪拌反應(yīng)30 min，再加入50 mg EDC，繼續(xù)攪拌反應(yīng)1 h。反應(yīng)結(jié)束后離心清洗3遍，純化水復(fù)溶得到熒光微球溶液。用含1%蔗糖的PBS依次稀釋熒光微球溶液至20倍、40倍、80倍、2000倍，使用全自動劃膜儀噴膜劃線，C線為稀釋40倍的熒光微球溶液，T線分別為稀釋20倍、80倍、2000倍的熒光微球溶液，干燥后切割成長條，干燥、避光保存。

2.2.2 校準(zhǔn)卡性能評價

1）精密度

從同一批次分別挑選低、中、高熒光微球校準(zhǔn)卡各20個，在Getein 1600熒光免疫定量分析儀（以下簡稱：儀器）測定電壓值，計算其均值及變異系數(shù)（CV，%），以此作為批內(nèi)和批次精密度。要求精密度CV≤10%。

2）重復(fù)性

從同一批次中隨機挑選低、中、高校準(zhǔn)卡各6個，連續(xù)測值20次，計算變異系數(shù)（CV，%），要求不超過10%。

3）穩(wěn)定性影響因素

①光照的影響

隨機挑選低、中、高校準(zhǔn)卡各3個，保存至含有干燥劑的透明袋中，放置在室溫（25 [℃]）下，每3天測定電壓，平行測定3次。設(shè)置保存在錫箔密封袋中的校準(zhǔn)卡作對照組，記錄測定數(shù)據(jù)，計算相對偏差。

②溫度的影響

操作同步驟a，溫度條件設(shè)置為低溫（4 [℃]）和高溫（45 [℃]），室溫（25 [℃]）結(jié)果作為對照，計算相對偏差。

③濕度的影響

操作同步驟①，濕度條件為高濕（60%～80%），干燥結(jié)果做對照，計算相對偏差。

④保存期限的確定

隨機挑選低、中、高三種校準(zhǔn)卡各5個，每隔45天測定電壓，平行測定3次，計算變異系數(shù)（CV，%），要求不超過5%，以此確定保存期限。

⑤線性相關(guān)性

按等比例稀釋高值濃度的熒光微球溶液至4860倍，制備6個梯度校準(zhǔn)卡。以5次重復(fù)檢測電壓值的平均值（Yi）為因變量，以稀釋倍數(shù)（Xi）的倒數(shù)作為自變量，求出線性回歸方程，計算線性相關(guān)系數(shù)R，要求R≥0.95。

2.2.3 光路校準(zhǔn)應(yīng)用

采用5套低、中、高值熒光微球校準(zhǔn)卡分別在標(biāo)準(zhǔn)機和5臺待測機測試電壓，平行測定3次，以標(biāo)準(zhǔn)機檢測電壓的平均值作為靶值，與待測機電壓平均值擬合曲線，自動計算校準(zhǔn)系數(shù)，完成光路校準(zhǔn)。然后用校準(zhǔn)品復(fù)測標(biāo)準(zhǔn)機和待測機，計算相對偏差，要求不超過4%。

3 結(jié)果

3.1 精密度

對同批次和不同批次制備的熒光微球校準(zhǔn)卡進(jìn)行精密度檢測，結(jié)果如表1所示。同一批次和不同批次制備的低、中、高三種電壓值的熒光微球校準(zhǔn)卡C.V均小于4%，滿足制備校準(zhǔn)卡精密度小于10%的要求，表明使用該方法制備的熒光微球校準(zhǔn)卡精密度較好。

3.2 重復(fù)性

結(jié)果如表2所示，低、中、高三種熒光微球校準(zhǔn)卡的重復(fù)性檢測CV均小于10%，滿足檢測要求。其中，中、高值的重復(fù)性CV相較于低值偏小，分析原因是熒光微球校準(zhǔn)卡存在少量熒光猝滅現(xiàn)象，隨著儀器激發(fā)光源的照射，校準(zhǔn)卡發(fā)射熒光的強度會慢慢減弱，而低值電壓基數(shù)過小，導(dǎo)致通過計算得到CV相較于中、高值偏大，但仍在可接受范圍內(nèi)。

3.3 穩(wěn)定性

3.3.1 穩(wěn)定性影響因素

將校準(zhǔn)卡分別在光照、高溫、低溫和高濕等儲存環(huán)境下連續(xù)測值，結(jié)果如表3所示。由于光線中含有能使熒光猝滅的光譜波段，長期暴露會導(dǎo)致熒光強度降低，校準(zhǔn)卡在暴露光線5天后實驗組測值偏差相較于對照組降低約20%～40%，30天后約降低40%～60%;低溫和高濕的儲存環(huán)境對低電壓值的校準(zhǔn)卡測值影響較大，分別在儲存20天和30天后測值偏差超過10%，說明低值校準(zhǔn)卡在這兩種環(huán)境下穩(wěn)定性較差，不符合存儲要求;而校準(zhǔn)卡在45[℃]的高溫環(huán)境下存儲較穩(wěn)定，存放1月后的測值偏差仍與對照組接近，具備較好的高溫存儲性能?？紤]到存儲的環(huán)保性與便捷性，熒光微球校準(zhǔn)卡最適合保存在避光、常溫和干燥的環(huán)境中，即選擇含干燥劑的錫箔袋密封包裝，常溫放置。

3.3.2 保存期限

表3結(jié)果表明，隨著保存天數(shù)的增加，熒光微球校準(zhǔn)卡的CV逐漸增大，是由于激光照射下發(fā)生少量的熒光猝滅，而保存360天的校準(zhǔn)卡電壓CV仍在5%以內(nèi)，滿足其使用要求，說明該校準(zhǔn)卡的存儲穩(wěn)定性較好，在常溫、干燥、避光環(huán)境下可至少保存一年。

3.3.3 線性相關(guān)性

以熒光微球20倍稀釋液為初始液，按3倍的比例依次稀釋至4860倍，以稀釋倍數(shù)的倒數(shù)為橫坐標(biāo)（Xi）、檢測電壓值（Yi）為縱坐標(biāo)，建立線性回歸曲線，如圖1所示，線性方程y=12648x+61.11顯示在稀釋濃度20～4860倍內(nèi)呈良好線性，線性相關(guān)系數(shù)R2=0.9999，檢測平均值與估算值的相對偏差均<±5%，呈現(xiàn)較好的線性。

3.3.4 光路校準(zhǔn)應(yīng)用

表5結(jié)果表明，使用熒光微球校準(zhǔn)卡校準(zhǔn)光路后，標(biāo)準(zhǔn)機與待測機的相對偏差從最初的60%～200%全部降低至3%以內(nèi)，滿足儀器光路檢測相對偏差在4%以內(nèi)的要求，且待測值與靶值的線性相關(guān)性≥0.9999，具備較高的校準(zhǔn)可行性。

4 結(jié)論

本研究通過偶聯(lián)羧基熒光素和氨基聚苯乙烯微球制備了一種穩(wěn)定性好、時效性長、便攜的熒光微球校準(zhǔn)卡，消除了各廠家儀器間測值差異，實現(xiàn)了各儀器檢測結(jié)果的可比性，提高和保證了儀器檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性;而且該校準(zhǔn)卡具有存儲環(huán)境簡單、存儲期限長、攜帶方便、脫離試劑可直接上機檢測等優(yōu)勢，為企業(yè)制造的和市場上大量使用的熒光POCT儀器光路校準(zhǔn)提供簡便性、快速性，為其檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性、穩(wěn)定性和可比性提供良好的保障，為企業(yè)校準(zhǔn)熒光POCT出廠儀器和規(guī)范熒光POCT市場儀器提供了有力的技術(shù)支持，具有廣闊的應(yīng)用前景。

【參考文獻(xiàn)】

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【作者簡介】

王路海，男，1984年出生，工程師，學(xué)士，研究方向為產(chǎn)品質(zhì)量控制與質(zhì)量管理。