李西波，李澤瑞，米全鳳，沈悅萌，劉穎，張晉平，張繼

（1.西北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，甘肅蘭州730070；2.甘肅特色植物有效成分制品工程技術(shù)研究中心，甘肅蘭州730070）

紅樹莓（Rubus idaeus L.）屬于薔薇科懸鉤子屬灌木、半灌木或匍匐草本植物，又名懸鉤子、覆盆子，是目前世界上稀缺的、純天然綠色可食用漿果，因其富含各種營養(yǎng)和功能活性成分，享有“黃金水果”的聲譽(yù)[1]。紅樹莓柔軟多汁，風(fēng)味獨(dú)特，富含維生素、礦物質(zhì)等成分，尤其是花色苷、超氧化物歧化酶和鞣花酸[2-4]，越來越受到人們歡迎[5]。已有研究表明，紅樹莓花色苷安全、無毒，具有較強(qiáng)的抗氧化、抗衰老、保護(hù)心腦血管健康等功能[6-10]，因此提高紅樹莓花色苷的提取和純化效率，是目前亟需解決的問題。

紅樹莓花色苷既溶于水，也溶于極性有機(jī)溶劑，且在酸性溶液中穩(wěn)定性較高，因此常用酸性有機(jī)溶劑提取花色苷。肖軍霞等[11]和王煜偉等[12]分別采用酸化乙醇和酸化甲醇等單一提取法，而萬山等[13]采用超聲波輔助酸化乙醇法提取紅樹莓花色苷，通過對比發(fā)現(xiàn)，單一有機(jī)溶劑法提取花色苷的提取率遠(yuǎn)不及超聲輔助法，這是由于超聲波振蕩破壞了植物細(xì)胞壁，進(jìn)而使提取劑進(jìn)入胞內(nèi)部分離了結(jié)合態(tài)花色苷從而提高了花色苷提取率[10，14]。由于AB-8型大孔樹脂吸附層析具有吸附性、解吸附性強(qiáng)，設(shè)備簡單且成本低等特點(diǎn)，成為常用的純化花色苷方法。譚佳琪等[15]和汪禮洋等[16]對比不同大孔樹脂純化紅樹莓花色苷，發(fā)現(xiàn)采用AB-8型大孔樹脂純化花色苷純度提高最多。當(dāng)前研究紅樹莓花色苷抑菌活性的較少，孫希云等[17]分別采用濾紙片法和菌落計(jì)數(shù)法初步研究了樹莓葉、果的體外抑菌性，并未得到有效結(jié)果。

本研究以酸化乙醇作為提取劑，利用超聲輔助法和AB-8型大孔樹脂純化法精制紅樹莓花色苷，結(jié)合單因素和正交試驗(yàn)優(yōu)化工藝，并研究純化花色苷的抑菌活性，為提升紅樹莓的高值化利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紅樹莓凍果：酒泉金碩元生物科技有限公司；果膠酶（食品級）：浙江一諾生物科技有限公司；AB-8型大孔樹脂：青島海洋化工廠；黑曲霉（Aspergillus niger）、大腸桿菌（Escherichia coli）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、啤酒酵母菌（Saccharomycete cerevisiae）：西北師范大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室保存；PDA培養(yǎng)基、LB肉湯培養(yǎng)基：上海博微生物科技有限公司；其它所用試劑均為分析純。

V-5000紫外-可見分光光度計(jì)：上海元析儀器有限公司；H1850R高速離心機(jī)：長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；PHS-3C pH計(jì)：上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；KQ-250DE型超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；RE-3000旋轉(zhuǎn)發(fā)生器：上海亞榮生化儀器廠。

1.2 溶液配制

1）pH1.0鹽酸-氯化鈉緩沖液：分別配制0.20 mol/L鹽酸和氯化鈉溶液，按體積比25∶67將上述兩種溶液混勻。

2）pH4.5醋酸-醋酸鈉緩沖液：分別配制0.20 mol/L醋酸和醋酸鈉溶液，等體積量取上述兩種溶液混勻。

3）pH3.0檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液：分別配制0.6 mol/L Na2HPO4·12H2O（準(zhǔn)確稱取53.72 g定容于250 mL容量瓶）和0.3 mol/L檸檬酸（準(zhǔn)確稱取14.41 g定容于250 mL容量瓶），按照體積比100∶127將上述兩種溶液混勻。

1.3 培養(yǎng)基的配制

1.3.1 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基

精確稱取牛肉膏3.0 g、蛋白胨10.0 g、NaCl 5.0 g、瓊脂 20 g、溶解于 1 000 mL水中，調(diào)節(jié) pH7.4～7.6，滅菌備用。

1.3.2 LB液體培養(yǎng)基

精確稱取25.0 g LB肉湯，溶解于1 000 mL蒸餾水中，121℃滅菌15 min備用。

1.3.3 馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基

精確稱取馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基39.0 g，溶解于1 000 mL蒸餾水，121℃滅菌15 min備用。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 超聲波輔助法提取紅樹莓花色苷單因素試驗(yàn)

參考徐俐等[18]的文獻(xiàn)報(bào)道，花色苷濃度與吸光值呈線性關(guān)系，對提取劑中花色苷的含量進(jìn)行衡量，花色苷含量以吸光度表示，分別考察超聲溫度、提取劑濃度、提取劑pH值、料液比、超聲時(shí)間對花色苷吸光值的影響，從而確定超聲波輔助法提取花色苷的最佳單因素條件。紅樹莓凍果在25℃～28℃下，避光解凍30 min，組織搗碎制成勻漿，準(zhǔn)確稱取一定量解凍的紅樹莓凍果，超聲溫度30、40、50、60℃，超聲時(shí)間60、90、120、150 min，料液比 1∶4、1∶6、1∶8、1∶10（g/mL），以及濃度和 pH 值分別為 30%、50%、70%、90%和 1、2、3、4的乙醇提取劑，在510 nm測定吸光值，重復(fù)3次，確定最佳提取條件。

1.4.2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

超聲輔助法正交試驗(yàn)可以確定提取過程中各因素對提取結(jié)果影響的大小和最佳提取工藝，根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取超聲溫度、提取劑濃度、超聲時(shí)間、提取pH值和料液比進(jìn)行五因素四水平正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，采用L16（45）正交表進(jìn)行試驗(yàn)，確定最佳工藝參數(shù)，見表1。

表1 L16（45）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 1 Orthogonal test condition factor level

1.4.3 pH示差法測定花色苷提取率

利用分光光度法分別在510 nm和710 nm下測定花色苷吸光值，按如下公式計(jì)算紅樹莓花色苷提取率[19]。

花色苷提取率/（mg/g）=（A×Mt×DF×V）/（e×b×m）

式中：A510為510 nm下待測液的吸光值；A710為710 nm下待測液的吸光值；Mt為錦葵色素-3，5-二葡萄糖苷的摩爾質(zhì)量，655.2 g/mol；DF為稀釋因子；e為錦葵色素-3，5-二葡萄糖苷的消光系數(shù)，20 500 L/（mol×cm）；V 為提取液的總體積，mL；b為比色杯厚度，1 cm；m為樣品質(zhì)量，g。

1.4.4 紅樹莓花色苷純化工藝研究

1.4.4.1 花色苷粗提物的制備

按最佳提取工藝提取花色苷，4 000 r/min離心10 min，取上清液，50℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮得到花色苷粗提物。

1.4.4.2 樹脂預(yù)處理

超純水沖洗除去破碎或細(xì)小的樹脂，用無水乙醇浸泡24 h，并用無水乙醇多次洗滌，以洗出液中加適量水未出現(xiàn)白色渾濁作為洗滌終點(diǎn)，最后用超純水反復(fù)沖洗除去乙醇，將處理好的樹脂浸泡于超純水中備用。

1.4.4.3 花色苷純化工藝研究

1）繪制靜態(tài)吸附曲線和解吸曲線

取粗提液10 mL，稀釋至100 mL，稱取預(yù)處理的AB-8型大孔樹脂5.0 g置于三角瓶中，分別于0、30、60、90、120、150、180、210 min 在 510 nm 測定吸光值，繪制靜態(tài)吸附曲線。取上述飽和吸附的大孔樹脂置入錐形瓶中，加入50%乙醇，每隔30 min在510 nm測定吸光值，繪制靜態(tài)解吸曲線。

2）上樣液和洗脫劑對解吸的影響

分別稱取1 g預(yù)處理后的AB-8型大孔樹脂加入錐形瓶中，分別調(diào)整花色苷粗提液 pH1、2、3、4、5、6，并分別用不同濃度（50%、60%、70%、80%、90%）和pH值（1、2、3、4）的乙醇為洗脫劑洗脫，pH示差法計(jì)算花色苷吸附量，研究上樣液pH值、洗脫劑濃度和洗脫劑pH值對解吸的影響。

3）色價(jià)的測定

色價(jià)是一種表示色素含量的方法，指全部發(fā)色物質(zhì)占樣品質(zhì)量的百分率。方法如下：分別取2 mL樣品和溶劑加入18 mL pH3.0檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液中，于510 nm下測吸光值，按如下公式計(jì)算其色價(jià)。

式中：E為色價(jià)；A為510 nm下吸光值；W為取樣量，mL；a為樣品稀釋倍數(shù)。

1.4.5 抑菌活性研究

1.4.5.1 敏感性試驗(yàn)

在培養(yǎng)皿（10 cm）內(nèi)倒入20 mL對應(yīng)的固體培養(yǎng)基，將活化的0.10 mL大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、黑曲霉、啤酒酵母菌液（105CFU/mL）均勻涂布在固體培養(yǎng)基上。將滅菌的牛津杯置于培養(yǎng)基上，每個(gè)培養(yǎng)基均勻放置4個(gè)牛津杯，其中3個(gè)牛津杯中加入不同濃度的花色苷溶液0.10 mL，第4個(gè)牛津杯加入0.10 mL無菌水作對照。大腸桿菌和金黃色葡萄球菌置于37℃恒溫培養(yǎng)72 h，黑曲霉和啤酒酵母置于28℃恒溫培養(yǎng)36 h，通過觀察抑菌圈大小判斷是否具有抑菌活性。

1.4.5.2 最小抑菌濃度的確定

將精制紅樹莓花色苷用無菌水按照二倍稀釋法稀釋并分別加入到LB液體培養(yǎng)基中，并接入不同被抑制的菌株，恒溫?fù)u床上培養(yǎng)觀察生長情況，以完全不長菌的稀釋液的濃度作為最小抑菌濃度（minimal inhibit concentration，MIC）探討紅樹莓花色苷的抑菌能力。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

超聲輔助法提取紅樹莓花色苷的單因素試驗(yàn)結(jié)果見圖1。

圖1 單因素試驗(yàn)結(jié)果Fig.1 Single factor test results

由圖1可知，隨著溫度的升高和提取劑濃度的增加，吸光值都呈現(xiàn)先升高再降低的趨勢，當(dāng)超聲溫度40℃時(shí)吸光值最高（圖1A），當(dāng)濃度達(dá)到70%時(shí)變化趨于平緩（圖1B），這是由于溫度的升高促進(jìn)了花色苷的分解，影響了其穩(wěn)定性[20]，同時(shí)乙醇對于果膠具有沉淀作用，降低了對花色苷提取的干擾作用[21]。在pH1時(shí)花色苷吸光值達(dá)到最大（圖1C），這和文獻(xiàn)報(bào)道的花色苷在pH1時(shí)穩(wěn)定性最好一致[22]。料液比和超聲時(shí)間對花色苷吸光值的影響也是先升高后下降，當(dāng)料液比1∶8（g/mL）和超聲時(shí)間120 min時(shí)達(dá)到最大（圖1D和圖1E），這是由于提取溶劑增大到一定程度，降低了超聲波對細(xì)胞的作用，而使得吸光值下降，同時(shí)超聲時(shí)間過長導(dǎo)致花色苷分解而使其含量降低[23]。通過單因素試驗(yàn)，確定紅樹莓花色苷最適反應(yīng)條件為超聲溫度40℃、提取劑濃度70%、提取劑pH1、料液比1∶8（g/mL）、超聲時(shí)間 120 min。

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

正交試驗(yàn)和多因素方差分析結(jié)果分別見表2和表3。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Orthogonal test results

續(xù)表2 正交試驗(yàn)結(jié)果Continue table 2 Orthogonal test results

表3 多因素方差分析結(jié)果Table 3 Multi-factor analysis of variance results

由表2可知，不同因素對花色苷提率影響的大小依次為超聲溫度＞料液比＞超聲時(shí)間＞提取劑濃度＞提取劑pH值。由表3方差分析可知，各因素對紅樹莓花色苷提取率影響差異不顯著。綜合考慮紅樹莓花色苷提取效果，影響因素的最優(yōu)組合為超聲溫度30℃，提取劑濃度 90%，pH4，超聲時(shí)間 150min，料液比 1∶10（g/mL），此時(shí)花色苷提取率達(dá)到了1.15 mg/g，與正交試驗(yàn)結(jié)果一致。

2.3 紅樹莓花色苷純化工藝研究

2.3.1 靜態(tài)吸附和解吸曲線的繪制

利用AB-8型大孔樹脂的靜態(tài)吸附試驗(yàn)，繪制靜態(tài)吸附曲線和解吸曲線見圖2。

圖2 靜態(tài)吸附曲線和解吸曲線Fig.2 Static adsorption curve and desorption curve

由圖2（A）可知，紅樹莓花色苷吸光值隨著試驗(yàn)進(jìn)行逐漸減小，大孔樹脂吸附從未飽和到飽和狀態(tài)，在150 min后變化越來越小。取飽和吸附紅樹莓花色苷的大孔樹脂AB-8置入錐形瓶中，加入50%乙醇，每隔30 min在510 nm測定吸光值，繪制靜態(tài)解吸曲線，結(jié)果見圖2（B），溶液吸光值先快速上升，而后解吸趨于平衡，在30 min時(shí)花色苷含量最高，因此表明AB-8型大孔樹脂的靜態(tài)吸附在150 min時(shí)，樹脂達(dá)到了最佳的飽和溶脹狀態(tài)，而解吸時(shí)間為30 min。

2.3.2 上樣液和洗脫劑對解吸的影響

上樣液pH值對吸附量、洗脫劑濃度及pH值對解吸率的影響見圖3。

圖3 上樣液pH值對吸附量、洗脫劑濃度及pH值對解吸率的影響Fig.3 The influence of the pH value of the sample solution on the adsorption capacity，eluent concentration and pH value on the desorption rate

將AB-8型大孔樹脂和不同pH值的紅樹莓花色苷粗提液吸附達(dá)到平衡，采用pH示差法計(jì)算其吸附量，得到不同pH值上樣液對吸附量影響的結(jié)果（圖3A）。當(dāng)pH值為1時(shí)其吸附率最高，高達(dá)0.68 mg/g，而后隨著pH值增大，吸附量逐漸降低。這是由于隨著酸性降低，花色苷結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，減弱了樹脂對花色苷吸附能力，進(jìn)而降低了AB-8型大孔樹脂對花色苷的吸附量。

由圖3B和圖3C可知，隨著洗脫劑濃度逐漸升高，解吸率逐漸上升，當(dāng)乙醇濃度達(dá)到90%時(shí)，解吸率達(dá)到最大值88.76%，而不同pH值洗脫劑對解吸率的影響不明顯，考慮到花色苷在酸性條件下比較穩(wěn)定，因此確定濃度90%、pH2的乙醇溶液為最佳洗脫劑。

2.4 色價(jià)測定

通過測定純化前后紅樹莓花色苷的吸光值，并計(jì)算其色價(jià)，結(jié)果顯示純化后花色苷純度較純化前提高了1.68倍，顯著提高，說明利用AB-8型大孔樹脂純化紅樹莓花色苷效果較好。

2.5 花色苷抑菌活性研究

紅樹莓花色苷敏感性研究結(jié)果見表4。

表4 紅樹莓花色苷對不同菌種的抑菌活性Table 4 Antibacterial activity of red raspberry anthocyanins against different strains

紅樹莓花色苷對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌具有較好的抑制作用，抑菌圈大小分別為（22.91±0.47）mm和（47.24±9.43）mm；但花色苷對啤酒酵母和黑曲霉無明顯抑制作用，且加入花色苷的黑曲霉生長比蒸餾水對照組處理后生長效果更好，表明紅樹莓花色苷黑曲霉的生長具有促進(jìn)作用[24]。

紅樹莓花色苷的最小抑菌濃度的研究結(jié)果見表5。

表5 紅樹莓花色苷最小抑菌濃度的測定結(jié)果Table 5 Determination results of the minimum inhibitory concentration of red raspberry anthocyanins

花色苷對于大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度分別為1 600 μg/mL和400 μg/mL，抑菌效果明顯。大腸桿菌與金黃色葡萄球菌分屬革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌，說明花色苷對細(xì)菌有廣泛的抑制作用[25]。

3 討論與結(jié)論

通過單因素及正交試驗(yàn)，得到紅樹莓花色苷提取的最佳工藝為超聲溫度30℃、提取劑濃度90%、提取劑 pH4、超聲時(shí)間 150 min、料液比 1∶10（g/mL），在此條件下提取率為1.15 mg/g，較單一使用酸化乙醇法提取率高1.58倍[11]。主要是由于超聲波破壞植物細(xì)胞壁，使有機(jī)溶劑易于進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，進(jìn)一步提高了提取效率，減少了提取時(shí)間和有機(jī)溶劑的浪費(fèi)[26]。通過對紅樹莓花色苷純化工藝研究，確定最佳純化條件：上樣液pH2、靜態(tài)吸附時(shí)間150 min、洗脫劑濃度90%、洗脫劑pH2、解吸時(shí)間30 min，純化后花色苷純度為純化前的1.68倍，明顯優(yōu)于采用單一的酸化乙醇純化工藝。純化后的紅樹莓花色苷對于大腸桿菌和金黃色葡萄球菌具有明顯抑制生長的作用，而對于啤酒酵母菌及黑曲霉則無抑制作用。通過對紅樹莓花色苷提取、純化工藝的優(yōu)化以及抑菌活性研究，期望對紅樹莓花色苷的開發(fā)利用提供參考依據(jù)。