謝鵬，高愿軍，秦令祥，周婧琦

（1.漯河食品職業(yè)學(xué)院，河南漯河462300；2.鄭州輕工業(yè)大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，河南鄭州450002；3.漯河市食品研究院有限公司，河南漯河462300）

香菇，也被稱為花菇、香蘑等，屬擔(dān)子菌綱傘菌目口蘑科香菇屬[1]，起源于中國(guó)，是中國(guó)著名的食藥兩用食用菌[2]，也是全球第二大食用菌。它營(yíng)養(yǎng)豐富，口味獨(dú)特，食用和藥用價(jià)值很高[3]，有“菌菇皇后”、“菇中之王”之稱[4]。香菇多糖（lentinan，LNT）是香菇中重要生物活性成分。LNT 具有抗病毒[5]、抗腫瘤[6]、抗氧化[7]、增強(qiáng)免疫力[8]、抗輻射[9]、降血糖[10]、抗衰老[11]等功效，在食品、保健、生物醫(yī)藥和臨床等方面被廣泛應(yīng)用[12]。

目前，提取多糖的方法主要有熱水浸提、酶解[13]、微波輔助[14]、超聲波輔助[15]等，這些方法各有優(yōu)劣。表面活性劑提取是近年發(fā)展起來(lái)的一種先進(jìn)的提取方法，它利用其潤(rùn)濕、滲透和增溶的作用，來(lái)提高提取效率，它具有條件溫和、成本低、環(huán)保、安全的優(yōu)點(diǎn)，可工業(yè)化應(yīng)用[16-18]。雙頻超聲輔助提取是一種新的現(xiàn)代提取方法，該方法避免了單頻超聲聲場(chǎng)不均勻、空化效應(yīng)不完全而影響提取效率的問(wèn)題[19]。吐溫食品級(jí)表面活性劑具有經(jīng)濟(jì)、方便、低毒等優(yōu)點(diǎn)，越來(lái)越多地用于保健食品的提取[20]。本研究通過(guò)表面活性劑協(xié)同雙頻超聲波輔助提取LNT，來(lái)增強(qiáng)LNT提取效果，并對(duì)其抗氧化活性進(jìn)行研究，為后續(xù)LNT的開(kāi)發(fā)利用和工業(yè)化生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

香菇：西峽縣雷氏菇品購(gòu)銷有限公司；吐溫-80（Tw-80）、葡萄糖、苯酚、硫酸、無(wú)水乙醇、正丁醇、三氯甲烷（均為分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；聯(lián)苯雙酯、四氯化碳（均為分析純）：鄭州化學(xué)試劑廠；DPPH試劑：上海浩洋生物科技有限公司；維生素C：華北制藥股份有限公司；水楊酸、硫酸亞鐵、H2O2（均為分析純）：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

智能溫控雙頻超聲波萃取儀（BILON-2009）：上海比朗儀器制造有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（RE-3000A）：上海耀特儀器設(shè)備有限公司；紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（760CRT）：上海儀電分析儀器有限公司；電動(dòng)攪拌器（D2015W）：上海梅穎浦儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 LNT的提取

香菇→干燥→粉碎→過(guò)80目篩→密封保存?zhèn)溆谩Q取一定質(zhì)量的香菇粉末→加入一定濃度的吐溫-80溶液→雙頻超聲波輔助提取→提取液Sevag法[21]脫蛋白→離心（5 000 r/min，10 min）→上清液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮→3倍體積95%乙醇進(jìn)行沉淀→放入4℃冰箱，靜置24 h→離心（5 000 r/min，10 min）→真空冷凍干燥→香菇粗多糖。

1.3.2 LNT的測(cè)定

LNT的測(cè)定采用苯酚-硫酸法[22]。

1.3.3 LNT提取率的計(jì)算

LNT提取率的計(jì)算公式如下。

提取率/%=（提取的多糖量/提取的香菇粉樣品量）×100

1.3.4 LNT提取試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.4.1 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

按1.3.1的方法，稱取10 g香菇粉5份進(jìn)行表面活性劑協(xié)同雙頻超聲波輔助提取LNT，研究不同因素對(duì)LNT提取率的影響。固定條件：料液比1∶30（g/mL）、表面活性劑用量2.0%、超聲頻率（20+40）kHz，超聲時(shí)間 30 min。分別設(shè)定料液比為 1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50（g/mL），表面活性劑用量為 0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%，超聲頻率為（20+35）、（25+35）、（20+40）、（25+40）、（35+40）kHz，超聲時(shí)間為 20、25、30、35、40 min，進(jìn)行單因素試驗(yàn)。每組重復(fù)3次，取平均值。

1.3.4.2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在預(yù)試驗(yàn)和單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用L9（34）正交試驗(yàn)優(yōu)化提取工藝。試驗(yàn)水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

1.3.5 LNT的抗氧化活性試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.5.1 DPPH自由基清除率的測(cè)定

參照秦生華等[23]的方法，在517 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度。按下式計(jì)算DPPH自由基清除率。

式中：A0為空白組的吸光度；A1為樣品組或陽(yáng)性對(duì)照組的吸光度；A2為對(duì)照組吸光度。

1.3.5.2 羥基自由基清除率的測(cè)定

參照扈芷怡等[24]的方法，在510 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度。按下式計(jì)算羥基自由基自由基清除率。

式中：A3為空白組的吸光度；A4為樣品組或陽(yáng)性對(duì)照組的吸光度；A5為對(duì)照組吸光度。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel整理，數(shù)據(jù)分析采用正交設(shè)計(jì)助手進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 LNT提取工藝條件優(yōu)化

2.1.1 料液比對(duì)多糖提取率的影響

料液比對(duì)香菇多糖提取率的影響見(jiàn)圖1。

圖1 料液比對(duì)香菇多糖提取率的影響Fig.1 Effect of solid-liquid ration on the lentinan extraction rate

由圖1可知，隨著溶劑用量的增加，LNT提取率先升高后略微降低。這是因?yàn)樵黾尤軇┯昧?，溶液黏度?huì)減小，多糖擴(kuò)散和傳質(zhì)速率增加，利于多糖溶出和提取率升高。但料液比達(dá)到1∶30（g/mL）時(shí)，多糖基本完全溶出，再增加溶劑用量，其它雜質(zhì)也可能被溶出，影響提取率，使提取率略微下降。這與韓淑琴等[25]的研究結(jié)果趨勢(shì)相似。因此，取料液比1∶30（g/mL）為佳。

2.1.2 表面活性劑用量對(duì)多糖提取率的影響

表面活性劑用量對(duì)香菇多糖提取率的影響見(jiàn)圖2。

圖2 表面活性劑用量對(duì)香菇多糖提取率的影響Fig.2 Effect of surfactant dosage on the lentinan extraction rate

由圖2可知，隨表面活性劑用量的增大，LNT提取率先升高后降低。這是因?yàn)椋龃蟊砻婊钚詣┯昧?，多糖的增溶和擴(kuò)散作用增強(qiáng)，多糖溶出增多，提取率升高；當(dāng)表面活性劑達(dá)到2.0%時(shí)，其增溶和擴(kuò)散作用達(dá)到最大，再繼續(xù)增大用量，多糖溶出也不會(huì)明顯升高，而趨于穩(wěn)定。這與洪松彬等[26]的研究結(jié)果基本相似。因此，取表面活性劑用量2.0%為佳。

2.1.3 超聲頻率對(duì)多糖提取率的影響

超聲頻率對(duì)香菇多糖提取率的影響見(jiàn)圖3。

圖3 超聲頻率對(duì)香菇多糖提取率的影響Fig.3 Effect of ultrasonic frequency on the lentinan extraction rate

由圖3可知，隨著超聲頻率的變化，LNT提取率先升高再降低。這是因?yàn)樵黾映曨l率，其空化和機(jī)械作用增強(qiáng)，多糖的溶出增多，提取率升高。但當(dāng)超聲頻率超過(guò)（20+40）kHz時(shí)，再繼續(xù)增加超聲頻率，一是多糖的結(jié)構(gòu)會(huì)被部分破壞，二是其它雜質(zhì)也會(huì)溶出，影響了多糖的溶解，降低提取率。這與楊麗維等[27]的研究結(jié)果基本一致。因此，取超聲頻率（20+40）kHz為佳。

2.1.4 超聲時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響

超聲時(shí)間對(duì)香菇多糖提取率的影響見(jiàn)圖4。

圖4 超聲時(shí)間對(duì)香菇多糖提取率的影響Fig.4 Effect of ultrasonic time on the lentinan extraction rate

由圖4可知，隨著超聲時(shí)間的增加，LNT提取率先升高后緩慢下降。這是因?yàn)樵黾映晻r(shí)間，多糖受到表面活性劑增溶和超聲波空化作用的增強(qiáng)，多糖溶出加快，提取率升高。但當(dāng)超聲時(shí)間達(dá)到30 min時(shí)，增溶基本完全，再增加超聲時(shí)間，多糖的部分結(jié)構(gòu)會(huì)被不同程度的破壞，降低提取率。這與楊麗維等[27]的研究結(jié)果相近。因此，取提取時(shí)間30 min為佳。

2.1.5 LNT提取正交試驗(yàn)結(jié)果

LNT提取的正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2，LNT提取的方差分析結(jié)果見(jiàn)表3。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 The result of orthogonal experimental design

表3 方差分析結(jié)果Table 3 The variance analysis results

由表2、表3結(jié)果分析可知，各因素影響順序?yàn)锳＞B＞C＞D，最優(yōu)組合為 A3B3C3D1。料液比、表面活性劑用量和超聲頻率對(duì)LNT提取率的影響顯著，其它不顯著。通過(guò)K值的分析，確定最佳工藝參數(shù)為料液比1∶40（g/mL），表面活性劑用量 2.5%，超聲頻率（25+40）kHz和超聲時(shí)間25 min。在此最佳條件下做驗(yàn)證試驗(yàn)，重復(fù)5次，LNT提取率分別為14.13%、14.15%、14.18%、14.19%、14.17%，平均為14.16%（5次平均值），相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.17%（n=5），表明此優(yōu)化工藝方法穩(wěn)定可靠。

2.2 對(duì)比試驗(yàn)

為了對(duì)比表面活性劑協(xié)同雙頻超聲波輔助提取法與單一超聲輔助和單一表面活性劑法提取LNT不同，根據(jù)付麗娜等[28]超聲波提取條件略有改變和楊靜娟等[29]表面活性劑提取條件略有改變，研究不同提取方式對(duì)LNT提取率的影響見(jiàn)表4。

表4 不同提取方法對(duì)LNT提取率的影響Table 4 Effect of different extraction methods on the extraction rate of LNT

由表4可知，表面活性劑協(xié)同雙頻超聲波輔助提取LNT與其它兩種方法相比，所得LNT提取率明顯提高，并且提取時(shí)間比其它兩種方法更短，說(shuō)明表面活性劑協(xié)同雙頻超聲波輔助提取LNT更高效、省時(shí)。

2.3 抗氧化活性研究

2.3.1 LNT對(duì)DPPH自由基清除率的影響

LNT對(duì)DPPH自由基清除率的影響見(jiàn)圖5。

圖5 LNT對(duì)DPPH自由基清除率的影響Fig.5 Effect of LNT on the clearance rate of DPPH free radicals

由圖5可知，在試驗(yàn)測(cè)定的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，隨著LNT質(zhì)量濃度的增加，對(duì)DPPH自由基清除率逐漸增強(qiáng)。當(dāng)LNT質(zhì)量濃度為25 mg/mL時(shí)，清除率為78.51%，與相同質(zhì)量濃度的VC的清除率相近，表明其對(duì)DPPH自由基具有較強(qiáng)的清除能力。

2.3.2 LNT對(duì)羥基自由基的清除率的影響

LNT對(duì)羥基自由基清除率的影響見(jiàn)圖6。

圖6 LNT對(duì)羥基自由基清除率的影響Fig.6 Effect of LNT on the clearance rate of OH·free radicals

由圖6可知，在試驗(yàn)測(cè)定的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，隨著LNT濃度的增加，對(duì)羥基自由基的清除率逐漸增強(qiáng)，并呈現(xiàn)良好的正相關(guān)，當(dāng)LNT質(zhì)量濃度為25 mg/mL時(shí)，清除率為82.28%，其清除率和VC相近，表明其對(duì)羥基自由基具有較強(qiáng)的清除能力。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)工藝采用表面活性劑協(xié)同雙頻超聲波輔助提取 LNT，得到最優(yōu)工藝條件：料液比 1∶40（g/mL），表面活性劑用量2.5%，超聲頻率（25+40）kHz，超聲時(shí)間25 min。在此條件下，LNT提取率為14.16%。該方法高效、環(huán)保、易操作。LNT抗氧化活性研究表明，在一定的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，LNT對(duì)DPPH自由基和羥基自由基的清除率隨著質(zhì)量濃度的增加而升高，當(dāng)LNT質(zhì)量濃度為25 mg/mL時(shí)，其對(duì)DPPH自由基和羥基自由基的清除率分別為78.51%和82.28%，表明LNT具有較強(qiáng)的抗氧化活性。本試驗(yàn)工藝方法可為L(zhǎng)NT的提取與工業(yè)應(yīng)用提供一種參考，而對(duì)LNT結(jié)構(gòu)、組成及其生物活性的影響等，有待進(jìn)一步研究。