張偉云，張鳳清

（長春工業(yè)大學化學與生命科學學院，吉林長春130012）

雞蛋殼膜，俗稱“鳳凰衣”[1]，含有90%以上的蛋白質，且氨基酸組成合理，是一種優(yōu)質蛋白[2]。其中，殼膜中的蛋白質主要有角蛋白（keratin）、膠原蛋白（collagen）、卵清蛋白（ovalbumin）、溶菌酶（lysozyme）、骨橋蛋白（osteopontin）等成分[3]。目前，在醫(yī)藥領域具有加速上皮形成[4-5]、消炎[6]及促進肌膚生長等功效，同時對臨床中褥瘡、皮膚燙傷[7]及外傷性鼓膜穿孔[8]等也有良好的治療效果。但大部分殼膜蛋白中存在大量的二硫鍵，使得殼膜蛋白性質相當穩(wěn)定，不溶于酸、堿等[9]。殼膜蛋白的難溶性，不易被人體吸收，限制了其加工和應用。因此，建立一種溫和、可行且安全的方法用于雞蛋殼膜中蛋白質的水解，增加其資源利用率顯得尤為重要。

蛋白酶酶解法，主要通過酶促反應將蛋白質中的二硫鍵打開，以獲得可溶性多肽[10]。研究發(fā)現(xiàn)，利用蛋白酶酶解法生產抗氧化性酶解液可以得到大量的具有免疫活性[11]、抗高血壓、抑制腫瘤、抗氧化[12]、抗高血脂等功能的生物活性肽[13]。

本研究采用酶解法，將雞蛋殼膜酶解成小分子肽，并對其酶解工藝進行優(yōu)化。通過測定雞蛋殼膜多肽不同抗氧化體系的清除效果，研究其體外抗氧化活性，旨在為雞蛋殼膜綜合利用提供科學依據，同時使雞蛋殼膜變廢為寶，可以改善環(huán)境，提高產品經濟附加值。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

雞蛋殼膜：市售；堿性蛋白酶（AP-200a）（20萬 U/g）：安琪酵母股份有限公司；胃蛋白酶（3萬U/g）、木瓜蛋白酶（10萬 U/g）、復合蛋白酶（50萬 U/g）（均為食品級）：河南萬邦實業(yè)有限公司；2，2－聯(lián)苯基－1－苦基肼基（DPPH）、2，2'－聯(lián)氨－雙（3－乙基苯并噻唑啉－6－磺酸）二銨鹽（ABTS）：上海麥克林生化科技有限公司；抗壞血酸（VC）：國藥集團化學試劑有限公司；鄰苯三酚：北京化工廠；pH精密試紙：上海三愛思試劑有限公司；海洋魚低聚肽校正曲線標準品：上海曦玉分析儀器科技有限公司；其它試劑均為分析純。

UV-5500紫外可見分光光度計：上海元析儀器有限公司；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋：金壇市江南儀器廠；TG16G型高速離心機：湖南凱達科學儀器有限公司；DYF-200C萬能粉碎機：上海皓莊儀器有限公司；FD-1A-50型冷凍干燥機：上海五久自動化設備有限公司；安捷倫1260型四元梯度液相色譜儀：美國安捷倫科技有限公司；TSKgel G2000 SWXL型凝膠柱：上海曦玉分析儀器科技有限公司；JA2003B型千分之一電子天平：上海越平科學儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 雞蛋殼膜多肽制備的工藝流程

雞蛋殼膜→預處理（粉碎）→加水溶解→用1.0mol/L的NaOH溶液或HCl調節(jié)pH值→調節(jié)水浴溫度→加一定量蛋白酶恒溫酶解→高溫滅活→離心（4000r/min，15 min）→取上清液→冷凍干燥→雞蛋殼膜多肽

1.2.2 酶解試驗

1.2.2.1 蛋白酶種類的確定

取雞蛋殼膜，粉碎至粉末，均分成4等份，加適量水攪勻，選用食品級胃蛋白酶、堿性蛋白酶（AP-200a）、木瓜蛋白酶和復合蛋白酶，在各自最適條件下酶解5 h，酶解后高溫滅活10 min，以4 000 r/min離心15 min，取上清液，冷凍干燥得雞蛋殼膜凍干粉。以水解度為指標，篩選最適蛋白酶。

1.2.2.2 雞蛋殼膜酶解工藝優(yōu)化

單因素試驗：分別研究酶解時間、料液比、酶添加量3個因素對水解度的影響。酶解時間取 3、4、5、6、7h；料液比取 1∶7、1∶8、1∶9、1∶10、1∶11（g/mL）；酶添加量取0.5%、1.0%、2.0%、3.0%、4.0%，依次將上述3個因素中的任意2個因素確定為定值，變化另外1個因素，考察其變化范圍對雞蛋殼膜酶解效果的影響。

響應面試驗：在上述單因素試驗的基礎上，以雞蛋殼膜多肽的水解度為響應值，考察酶解時間（A）、料液比（B）、酶添加量（C）3個因素對響應值的交互影響，根據Box-Behnken design（BBD）設計三因素三水平的響應面試驗。各因素水平如表1所示。

表1 響應面試驗因素水平Table 1 Factors and levels of response surface experiments

1.2.3 水解度的測定

總氮含量測定：采用GB 5009.5—2016《食品安全國家標準食品中蛋白質的測定》中的凱氏定氮法；氨基酸態(tài)氮含量測定：采用GB 5009.235—2016《食品安全國家標準食品中氨基酸態(tài)氮的測定》中的甲醛值法；水解度（DH）計算公式見公式1。

1.3 多肽分子量及分布范圍測定

為了探究本法得到的雞蛋殼膜肽粉中肽的分子量及其分布范圍，本法依據GB/T 22729—2008《海洋魚低聚肽粉》中的方法進行測定，通過高效凝膠過濾色譜對肽粉中肽的分子量分布情況進行檢測，以海洋魚低聚肽為校正曲線標準品。

1.4 雞蛋殼膜多肽的體外抗氧化活性測定

1.4.1 DPPH·清除率測定

參考王敏等[14]的方法，并作適當修改。分別取2.0 mL不同質量濃度（0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0 mg/mL）的樣品溶液與系列同等質量濃度的VC溶液，再分別加入等量的2.0mL DPPH溶液（0.1mmol/L，溶于無水乙醇）置于具塞試管中，搖勻反應30 min，在517 nm下測定吸光度為A（空白為等量的無水乙醇）。2.0mL乙醇溶液加入2.0mL樣品溶液，搖勻反應30 min后，在517 nm處測定吸光度值Aj。2.0 mL DPPH溶液加入2.0 mL蒸餾水在517 nm處測定其吸光度值A0。雞蛋殼膜多肽對DPPH·的清除能力以清除率R1表示。DPPH·清除率的計算公式見公式2。

1.4.2 ABTS+·清除率測定

參考姬晨曦等[15]的方法，并作適當修改。取適量體積7.4 mmol/L的ABTS溶液和等體積2.6 mmol/L的過硫酸鉀溶液，混合均勻后室溫（25℃）避光放置12 h～16 h，形成ABTS+儲備液備用。將ABTS+儲備液用無水乙醇稀釋至吸光度為0.70±0.002，即ABTS+工作液備用。分別取 600 μL 不同質量濃度（0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0 mg/mL） 的樣品溶液與系列同等質量濃度的VC溶液，再分別加入5.0 mL ABTS+工作液置于具塞試管中，搖勻反應15 min，在734 nm下測定吸光度為A（空白為等量的無水乙醇）。5.0 mL乙醇溶液加入600 μL樣品溶液，搖勻反應15 min后，在734 nm處測定吸光度值Aj。5.0 mL ABTS+工作液溶液加入600 μL蒸餾水在734 nm處測定其吸光度值A0。雞蛋殼膜多肽對ABTS+·的清除能力以清除率R2表示。ABTS+·清除率的計算公式見公式3。

1.4.3 ·OH清除率測定

參考綦蕾等[16]的方法，并作適當修改。分別取2.0mL不同質量濃度（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mg/mL）的樣品溶液與同等質量濃度的VC溶液，再依次加入1 mL 9 mmol/L FeSO4、1 mL 9 mmol/L水楊酸乙醇溶液，混勻后加入1 mL 9 mmol/L H2O2于具塞試管中，在37℃下水浴30 min后，在波長510 nm處測定吸光度值A（空白為等量的蒸餾水），用蒸餾水代替FeSO4、水楊酸乙醇溶液、H2O2，在37℃下水浴30 min后，在波長510 nm處測定吸光度值Aj。用蒸餾水代替樣品溶液，在37℃下水浴30 min后，在波長510 nm處測定吸光度值A0。雞蛋殼膜多肽對·OH的清除能力以清除率R3表示。·OH清除率的計算公式見公式4。

參考胡小軍等[17]的方法，并作適當修改。分別取50 mmol/L、pH8.2的Tris-HCl緩沖液4.5 mL于試管中，在25℃水浴中放置20 min后，再分別加入1.0 mL不同質量濃度（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mg/mL）的樣品溶液與系列同等質量濃度的VC溶液，然后加入0.4 mL 25.0 mmol/L的鄰苯三酚溶液、1.0 mL 8.0 mol/L的HCl溶液混勻后，在25℃水浴中放置5 min，在波長為325 nm處測定吸光度A（空白為等量的蒸餾水）。用蒸餾水代替Tris-HCl緩沖液、鄰苯三酚溶液、HCl溶液，在25℃水浴中放置5 min，在波長為325 nm處測定吸光度值Aj。用蒸餾水代替樣品溶液，在25℃水浴中放置5 min，在波長為325 nm處測定吸光度值A0。雞蛋殼膜多肽對的清除能力以清除率R4表示。清除率的計算公式見公式5。

1.4.5 酶的體外抗氧化驗證

根據1.4.2試驗方法，用確定的堿性蛋白酶（AP-200a）作為樣品，對ABTS+·的清除能力進行測定。

1.5 數(shù)據處理

采用Excel進行數(shù)據分析，試驗結果表示為平均值±標準差。采用Origin9.0軟件繪制圖表，通過Design-Expert.V 8.0.6.1軟件獲得響應面數(shù)據。

2 結果與分析

2.1 蛋白酶種類的確定

酶是具有生物活性的蛋白質，它具有高效性和專一性，酶種類是酶解過程中最重要的影響因素之一[18]。為了方便比較，在各個蛋白酶最適溫度和最適pH值下對雞蛋殼膜進行酶解，不同蛋白酶對水解度的影響如圖1所示。

圖1 酶種類對酶解效果的影響Fig.1 Effect of enzyme types on enzymatic hydrolysis

由圖1可知，堿性蛋白酶（AP-200a）對雞蛋殼膜的酶解效果最好，水解度達到（27.52±1.21）%，而另外3種蛋白酶相對較低。所以選擇堿性蛋白酶（AP-200a）作為最優(yōu)酶，進行后續(xù)酶解工藝的優(yōu)化。

2.2 雞蛋殼膜酶解單因素試驗

酶解時間、料液比、酶添加量對酶解效果的影響見圖2。

圖2 酶解時間、料液比、酶添加量分別對酶解效果的影響Fig.2 Effect of enzymatic hydrolysis time，material-liquid ratio，amount of enzyme on enzymatic hydrolysis effect

由圖2（A）可知，當酶解時間3 h～5 h時，水解度呈逐漸上升的趨勢。酶解時間5h時，水解度最大。隨著酶解時間的延長，水解度變化不大，故設定5 h為較優(yōu)的酶解時間。由圖 2（B）可知，當料液比1∶7（g/mL）～1∶9（g/mL）時，水解度呈逐漸上升趨勢，超過1∶9（g/mL）時，水解度趨于平穩(wěn)，故選 1∶9（g/mL）為較優(yōu)的料液比。由圖 2（C）可知，隨著酶添加量增加，水解度逐漸增大，當酶添加量超過2.0%時，水解度變化不大并趨于平穩(wěn)。因此，最佳的酶添加量為2.0%。

2.3 響應面設計結果

2.3.1 BBD模型建立

在最佳酶解條件下，按照表1設計進行試驗，以殼膜多肽水解度為響應值，共17組試驗，其中5組中心點，每組重復3次。對得到的數(shù)據進行擬合，得到的二次回歸方程為Y=27.21+1.38A+0.82B+0.81C+0.02AB+0.025AC-0.023BC-1.78C2-0.95B2-1.06C2。響應面分析結果見表2，響應面二次模型的ANOVA分析見表3。

表2 響應面分析結果Table 2 Analysis result for response surface

表3 響應面二次模型的ANOVA分析Table 3 ANOVA for response surface quadratic model

續(xù)表3 響應面二次模型的ANOVA分析Continue table 3 ANOVA for response surface quadratic model

由表3中ANOVA分析結果可知，該法所建模型極顯著（P模型＜0.000 1），且失擬項表現(xiàn)為不顯著（P失擬項=0.439 1），具有極好的相關矯正系數(shù)（R2adj=0.999 9），表明該模型建立成功，對現(xiàn)實試驗效果具有良好的預判效果，能很好地模擬現(xiàn)實試驗規(guī)律。

2.3.2 BBD分析

通過對BBD模型擬合結果進行分析，可以更好地判斷各個因素間的交互影響以及影響規(guī)律。各因素交互作用對水解度的影響見圖3。

圖3 各因素交互作用對水解度的影響Fig.3 Effect of interaction of various factors on hydrolysis degree

如圖3所示，三維圖中坡度的陡峭程度代表因素在交互影響中的顯著性，因素的三維圖越陡峭，顯著性越大；而二維等高線圖則是三維圖的投影，通過其疏密程度可判斷因素的顯著性，在變化區(qū)間內，因素的等高線越密集，顯著性越大，對響應值的影響也越大。由圖3a和圖3b可以看出，當固定料液比（B）和酶添加量（C），變化酶解時間（A）時，酶解時間對應響應值等高線的密度明顯高于料液比和酶添加量的等高線密度，表明酶解時間在取值范圍內變化時對響應值影響的顯著性要高于料液比和酶添加量，表3中A、B和C的F值分別為63 146.40、22 282.77和21 476.22，這與上述試驗規(guī)律相一致。造成這種現(xiàn)象的原因可能是由于酶解時間不足，蛋白酶與底物接觸不充分，導致酶促反應不充足，酶解過程不完全，所得多肽含量較低；當酶解時間過長時則會導致部分多肽進一步水解成氨基酸，使水解度稍微下降。此現(xiàn)象與圖3中二維等高線圖規(guī)律相符，當酶解時間、料液比和酶添加量處于低值時，殼膜蛋白水解度均低于20%，而當酶解時間、料液比和酶添加量高于 5 h、1∶9（g/mL）和 2%時，殼膜蛋白的水解度普遍高于27%。圖3c中可以看出，料液比與酶添加量的二維等高線變化趨勢相類似，但二維圖中等高線呈橢圓形，表明料液比對響應值影響的顯著性略高于酶添加量。引起這種結果的原因是當料液比過低時，雞蛋殼膜不易分散，易形成聚集體，殼膜與蛋白酶接觸面積降低，酶解效率下降，水解度降低；而料液比過高時，對蛋白酶和殼膜起到稀釋作用，使得兩者接觸幾率下降，水解度稍微下降。因此，BBD試驗結果表明，因素變化對響應值影響的顯著性規(guī)律為酶解時間（A）＞料液比（B）＞酶添加量（C），這與表3中的試驗數(shù)據相符。

2.3.3 最優(yōu)條件確定及回歸模型驗證

在設定的取值范圍內，以最大水解度為指標，對試驗預期結果進行最優(yōu)化擬合，選擇各個因素的最佳取值為酶解時間 5.39 h，料液比 1∶9.43（g/mL），酶添加量2.38%，此時殼膜蛋白水解度為27.81%。依據現(xiàn)實試驗可行性，將酶解條件調整為酶解時間5 h，料液比1∶9.5（g/mL），酶添加量 2.4%，在此條件下，重復進行6次驗證試驗，得到的平均水解度為27.15%。試驗結果表明，通過BBD設計結果建立的二次多元回歸模型可以很好的擬合現(xiàn)實試驗結果，對試驗結果具有較好的預測性。

2.4 雞蛋殼膜多肽的分子量分布

在BBD優(yōu)化后的最佳工藝條件下，通過高效凝膠色譜法對酶解后殼膜多肽中肽的相對分子質量大小及分布情況進行檢測。肽分子量分布餅狀圖見圖4。

圖4 肽分子量分布餅狀圖Fig.4 Molecular mass distribution of polypeptides in a pie chart

如圖4所示，酶解后的雞蛋殼膜多肽中分子量在5 000 Da以下的肽段占98.1%，其中小于1 000 Da的小分子肽占90.9%。該法得到的1 000 Da以下的分子肽所占比例較高，此類小分子肽更易被人體消化吸收，且具有大分子蛋白質所沒有的一些物理化學特性，尤其是分子量較小的肽段，具有一定的抗氧化性[19-20]，試驗預期效果良好，可用于雞蛋殼中殼膜蛋白的酶解。

2.5 雞蛋殼膜多肽體外抗氧化結果

2.5.1 雞蛋殼膜多肽對DPPH·清除能力

按照1.4.1試驗方法進行試驗，以雞蛋殼膜多肽質量濃度為橫坐標，以DPPH·清除率為縱坐標，雞蛋殼膜多肽的DPPH·清除能力見圖5。

圖5 雞蛋殼膜多肽清除DPPH·的效果Fig.5 Effect of eggshell membrane in removing DPPH·

DPPH·是一種穩(wěn)定的有機氮自由基，在乙醇溶液中顯深紫色，能吸收抗氧化物的電子而引起樣品顏色的改變，其褪色程度與接受電子數(shù)成正比[21]。VC是較好的抗氧化劑，將雞蛋殼膜多肽的抗氧化能力與VC的抗氧化能力進行比較。由圖5可知，雞蛋殼膜多肽對DPPH·清除率弱于VC，但是隨著質量濃度的增加，雞蛋殼膜多肽對DPPH·清除率逐漸增大。當雞蛋殼膜多肽質量濃度為0.4 mg/mL時，對DPPH·清除率為（93.03±0.51）%，同種質量濃度下VC的清除率為（95.63±0.97）%，與VC的效果相當。

2.5.2 雞蛋殼膜多肽對ABTS+·清除能力

按照1.4.2試驗方法進行試驗，以雞蛋殼膜多肽質量濃度為橫坐標，以ABTS+·清除率為縱坐標，雞蛋殼膜多肽的ABTS+·清除能力見圖6。

圖6 雞蛋殼膜多肽清除ABTS+·的效果Fig.6 Effect of eggshell membrane in removing ABTS+·

ABTS經氧化后會生成藍綠色ABTS+·，雞蛋殼膜多肽可清除ABTS+·，從而使ABTS+·母液在一定程度褪色。由圖6可看出，雞蛋殼膜多肽和VC都有清除ABTS+·的能力，雞蛋殼膜多肽對ABTS+·清除率弱于VC，但是隨著質量濃度的增加，雞蛋殼膜多肽對ABTS+·清除率逐漸增大。當雞蛋殼膜多肽質量濃度為0.9 mg/mL 時，對 ABTS+·清除率為（94.53±0.92）%，同種質量濃度下VC的清除率為（98.50±0.70）%，與VC的效果相當。說明雞蛋殼膜多肽也具有較好的清除ABTS+·的能力。

2.5.3 雞蛋殼膜多肽對·OH清除能力

按照1.4.3試驗方法進行試驗，以雞蛋殼膜多肽質量濃度為橫坐標，以·OH清除率為縱坐標，雞蛋殼膜多肽的·OH清除能力見圖7。

圖7 雞蛋殼膜多肽清除·OH的效果Fig.7 Effect of eggshell membrane in removing·OH

由圖7可知，雞蛋殼膜多肽和VC都有清除·OH的能力，雞蛋殼膜多肽對·OH清除率較弱于VC，但是隨著質量濃度的增加，雞蛋殼膜多肽對·OH清除率逐漸增大。當雞蛋殼膜多肽質量濃度為3.0 mg/mL時，對·OH清除率為（43.33±1.10）%，同種質量濃度下VC的清除率為（99.07±0.25）%，在相同質量濃度下，·OH清除率為VC的43.74%，較VC有一定差距。

按照1.4.4試驗方法進行試驗，以雞蛋殼膜多肽質量濃度為橫坐標，以清除率為縱坐標，雞蛋殼膜多肽的清除能力見圖8。

圖8 雞蛋殼膜多肽對清除能力Fig.8 Effect of eggshell membrane in removing

由圖8可知，雞蛋殼膜多肽和VC都有清除的能力，雞蛋殼膜多肽對清除率較弱于VC，但是隨著質量濃度的增加，雞蛋殼膜多肽對清除率逐漸增大。當雞蛋殼膜多肽質量濃度為3.0 mg/mL時，對清除率為（53.40±0.70）%，同種質量濃度下 VC的清除率為（99.20±0.44）%，在相同質量濃度下，清除率為VC的53.83%，較VC有一定差距。

2.5.5 堿性蛋白酶對ABTS+·清除能力

按照1.4.2試驗方法進行試驗，以堿性蛋白酶（AP-200a）質量濃度為橫坐標，以ABTS+·清除率為縱坐標，堿性蛋白酶（AP-200a）對ABTS+·清除能力見圖9。

由圖 9可知，堿性蛋白酶（AP-200a）對 ABTS+·清除能力很弱，當濃度達到1.0 mg/mL時，對ABTS+·的清除率為（7.11±0.54）%，而雞蛋殼膜多肽和VC的清除能力都接近100%。結果表明，雞蛋殼膜凍干粉中雖然含有的少量酶，但是堿性蛋白酶（AP-200a）本身無明顯抗氧化活性。因此，說明雞蛋殼膜多肽具有很好的抗氧化活性。

3 結果與討論

目前，對各種肽的研究越來越多，活性肽抗氧化活性的研究已取得一定成果，大豆低聚肽已被列為新資源產品。還有小麥肽、玉米肽等，也被大家所關注。而對蛋殼膜類研究較少，雞蛋殼膜具有致密的纖維結構特點，不易被分解。本試驗以水解度為指標，篩選出堿性蛋白酶（AP-200a）酶解效果最佳，通過單因素考察和響應面分析優(yōu)化了雞蛋殼膜的酶解工藝，確定采用酶添加量 2.4%，料液比 1∶9.5（g/mL），酶解時間 5 h，在此條件下，殼膜多肽水解度為27.15%，與預測值27.81%接近，表明該方法可行。水解后相對分子質量小于1 000 Da的小分子肽所占比例為90.9%；且殼膜多肽對DPPH·、ABTS+·的清除率分別為（93.03±0.51）%、（94.53±0.92）%，與 VC的效果相當；但對·OH 和 O2-的清除率分別為（43.33±1.10）%和（53.40±0.70）%。劉文穎等[22]測得大豆低聚肽的分子量小于1000Da的組分高達83.54%。有研究報道，分子量小的組分比分子量過大的組分抗氧化性更強[23]。楊珊珊等[24]發(fā)現(xiàn)，當濃度為4 mg/mL時，蛋清多肽對DPPH·清除率可達到65.7%。梁盈等[25]發(fā)現(xiàn)大米活性肽具有較好的抗氧化活性，對DPPH·和·OH的清除能力分別達46.70%、68.23%。還有研究發(fā)現(xiàn)，大豆低聚肽、小麥低聚肽、海洋生物小分子肽、洋蔥多肽等都同樣具有抗氧化效果[26-28]。但是大多研究中沒有驗證酶解液或是得到的肽粉中所含的蛋白酶是否具有抗氧化活性，本試驗在做殼膜多肽對ABTS+·的清除能力的同時，驗證了堿性蛋白酶（AP-200a）對ABTS+·的清除能力，結果表明，堿性蛋白酶（AP-200a）沒有明顯的抗氧化活性。因此，通過該方法酶解后的雞蛋殼膜多肽具有一定抗氧化活性。

因此，試驗以雞蛋殼膜為原料，對其進行制備小分子肽的研究，得到了分子量組分較小的雞蛋殼膜多肽，創(chuàng)新了雞蛋殼膜酶解工藝的試驗優(yōu)化方法，并對其進行了一系列的體外抗氧化活性研究，研究結果表明雞蛋殼膜多肽具有良好的抗氧化活性。同時，本研究為雞蛋殼膜綜合再利用、變廢為寶提供了理論基礎，既可以達到保護環(huán)境以及資源化利用的目的，也為今后的蛋類產品研究奠定了研究基礎。