李雯雯, 劉瑞志, 徐慧韜, 王麗平

中國環(huán)境科學研究院， 國家環(huán)境保護河口與海岸帶環(huán)境重點實驗室， 北京 100012

反硝化作用是指反硝化細菌在微氧或無氧條件下，經(jīng)過一系列酶(包括硝酸鹽還原酶、亞硝酸鹽還原酶、NO還原酶和N2O還原酶)催化反應將NO3-(或NO2-)還原為氣態(tài)氮(NO、N2O或N2)的過程[1]. 反硝化作用一方面減少了環(huán)境中過多的氮，進而減少大型和浮游植物對氮的利用，避免了因富營養(yǎng)化引起的環(huán)境問題[2]；另一方面，其過程還可產(chǎn)生溫室效應大于CO2的N2O氣體[3]. 隨著我國經(jīng)濟的發(fā)展，各種工業(yè)和農(nóng)業(yè)廢水、生活垃圾、農(nóng)藥化肥等排入水體，造成我國水體出現(xiàn)嚴重的富營養(yǎng)化[4]；此時，具有反硝化作用的反硝化細菌，在水體修復與凈化及氮素循環(huán)中扮演著重要的角色[5]. 因此，對于水體中微生物結構特別是與氮功能相關的功能菌的研究，已成當前環(huán)境科學研究的熱點問題之一，且開展水體中微生物反硝化作用的研究能夠為減少氮的污染、進行水體治理和保護提供技術支持.

隨著遼河口兩岸經(jīng)濟的發(fā)展，遼河水質污染越來越嚴重，大遼河作為遼河的下游也受到了污染，開展遼河口水質狀況的研究顯得尤為重要[6]. 目前流入遼河河口的氮素主要有亞硝態(tài)氮、硝態(tài)氮和氨氮等各種形式的氮，這些氮素均可通過硝化與反硝化作用去除[5]. 有研究[7]表明全球輸入到河口的氮中，約有一半的氮可通過反硝化作用去除. 目前對于遼河口反硝化作用的研究多集中在反硝化細菌數(shù)目、反硝化速率及其影響因素、硝氮和亞硝氮的含量等方面，如陳立廣等[8]在2007年開展了遼河口沉積物中硝化細菌數(shù)量的時空變化分析，發(fā)現(xiàn)使用MPN-PCR法測量硝化細菌數(shù)量比MPN-Griess法靈敏10～100倍；雷坤等[9]在2003年開展了大遼河N、P營養(yǎng)鹽的研究，發(fā)現(xiàn)遼河口附近海域水體和遠海水體分別呈富營養(yǎng)化和貧營養(yǎng)化狀態(tài)；樊景鳳等[10]在2007年利用MPN-Griess 和PCR-RFLP技術分別研究遼河口沉積物中反硝化細菌的數(shù)目和多樣性，發(fā)現(xiàn)春季最高，從遼河口下游到遠海區(qū)數(shù)目遞減. 以上研究距今時間較長，且多半研究介質為沉積物，仍然缺乏對遼河水體反硝化細菌與水環(huán)境因子之間的研究.

反硝化細菌是進行反硝化作用的功能菌群，反硝化作用中亞硝酸鹽轉化為NO的反應為反硝化過程中最關鍵的一步，此過程由具有不同結構形態(tài)但功能相似的nirK和nirS基因編碼的亞硝酸還原酶完成[11-12]. 很多研究均將nirK和nirS基因作為環(huán)境樣品中反硝化微生物的分子標識物[13-14]. 反硝化作用的最后一步是nosZ基因編碼的氧化亞氮還原酶將有害氣體N2O轉化為無害N2，這一步在反硝化路徑中起著重要作用[15]. 前人大多通過nosZ基因的多樣性來探討反硝化細菌的群落結構與多樣性[16-17]. 因此，nosZ、nirS和nirK基因通常被多數(shù)人選擇作為研究反硝化作用的目標基因. 實時熒光定量PCR技術是目前定量分析反硝化功能基因較為成熟的方法[18]，具有特異性強、靈敏度高、定量準等優(yōu)點[19]. 該文采用定量PCR對反硝化細菌3種主要功能基因nirK、nirS和nosZ的空間分布特征進行研究，獲取大遼河入海河段、大遼河口及其近岸海域中反硝化細菌的基因豐度，并用因子分析和冗余分析(RDA)探討了微生物基因數(shù)量與水環(huán)境因子的關系，以期為降低遼東灣陸源氮污染提供基礎數(shù)據(jù).

1 材料與方法

1.1 水樣采集

大遼河口位于我國東北地區(qū)南部遼寧省境內(nèi)，由渾河與太子河匯合后自營口市入海，全長95 km. 2017年《中國海洋生態(tài)環(huán)境狀況公報》中報道了大遼河攜帶氮素入海監(jiān)測結果，入海的氨氮(NH3-N)、硝酸鹽氮(NO3--N)、亞硝酸鹽氮(NO2--N)分別達到 4 434、44 765、5 295 t，水體受到嚴重污染. 2017年《遼寧省近岸海域水環(huán)境質量》中指出，大遼河河口是主要的GB 3097—1997《海水水質標準》劣四類海水集中地，綜合水質不理想.

根據(jù)大遼河口的環(huán)境特征，調查站位在大遼河入海河段和河口河段分別采取線狀站位與輻射條狀站位設置，共設站位18個，確保了所采集樣品區(qū)域的代表性. 所設站位中河口河段9個(L01～L09站位)、近海河段9個(EL1～EL3、EM1～EM3、ER1～ER3站位)，如圖1所示. 水體樣品于2017年5月進行采集，所采集水體為表層水. 水體溫度(T)、pH、鹽度、DO濃度等常規(guī)理化參數(shù)使用YSI便攜式多參數(shù)水質監(jiān)測儀(6600V2型，美國)現(xiàn)場測定. 采集水樣置于含冰盒的保溫箱中并盡快運回實驗室進行樣品分析：河口河流段與河口近海段水體硅酸鹽(SiO32-)、NO2-、NO3-、TN等營養(yǎng)鹽指標濃度分別按照GB 3838—2002《地表水環(huán)境質量標準》和GB 17378—2007《海洋監(jiān)測規(guī)范》有關要求進行測定；部分水樣經(jīng)0.45 μm的濾膜過濾后，用硝酸調節(jié)pH小于2，4 ℃保存后使用電感耦合等離子體質譜儀(ICP-MS，7500cx型，美國Agilent公司)測定重金屬含量；其余水樣經(jīng)0.22 μm的濾膜過濾后，將濾膜置于-20 ℃凍存，用于DNA提取.

圖1 大遼河口及其毗鄰區(qū)域采樣站位布設

1.2 DNA提取

取出-20 ℃保存的濾膜，使用PowerWater?DNA Isolation Kit試劑盒，根據(jù)試劑盒說明書提取水樣微生物DNA. 最后，將提取的DNA置于-80 ℃冰箱中保存待用.

1.3 定量PCR

經(jīng)過Q-PCR測試，采用表1中的引物和擴增條件對反硝化細菌nirS基因、norZ基因和nirK基因進行PCR擴增. PCR擴增體系包括0.25 μL TaKaRa和Taq(5 U/μL)、5 μL的10×Ex和buffer(Mg2+Plus)、4 μL的dNTP和Mixture(各2.5 mmol/L)、1 μL的模板DNA、1 μL 引物1(20 μmol/L)、1 μL引物2(20 μmol/L)，最后用滅菌蒸餾水補至50 μL. PCR產(chǎn)物采用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測；瓊脂凝膠PCR產(chǎn)物的回收采用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0，且嚴格根據(jù)說明書進行操作.

表1 該研究所使用的定量PCR(qPCR)引物

進行TA克隆以及采用TaKaRa Mini BEST Plasmid Purification Kit Ver.4.0提取質粒DNA. 鑒于pMD18-T Vector的特性采用M13-47和RV-M這對引物進行PCR鑒定. 采用染料為SYBR GREEEN，試劑盒為KAPA SYBR? FAST qPCR Kit Master Mix(2×) universal(北京閱微基因技術股份有限公司)進行Real-time PCR. Q-PCR反應條件見表2，并按表2中的程序進行擴增.

表2 Real-time PCR的反應條件

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)采用Excel 2019軟件進行整理，每個站位3個平行，取平均值和標準差. 運用ArcGIS 10.2和Origin 9.1軟件分別進行站位繪圖和各基因豐度的作圖. 使用SPSS 26.0軟件對基因和環(huán)境因子數(shù)據(jù)進行因子分析，分析調查水體的主要環(huán)境問題，同時對基因豐度進行正態(tài)分布檢驗和Pearson相關性分析. 采用Canoco 5生態(tài)學軟件對微生物基因數(shù)據(jù)作趨勢對應分析(DCA)，根據(jù)分析結果中樣品矩陣第一軸的梯度長度來確定分析環(huán)境因素對反硝化細菌基因數(shù)量影響的方法，梯度長度大于4，選擇典型相關分析(CCA)；梯度長度在3～4之間，選冗余分析(RDA)和CCA均可；梯度長度小于3，選擇RDA[23]. 最后，使用蒙特卡羅測試檢驗環(huán)境因素對基因數(shù)量的影響程度[24].

2 結果與討論

2.1 反硝化細菌功能基因定量分析

2.1.1水體中nirK和nirS基因的豐度

作為反硝化微生物中最為重要的2種功能基因，nirK和nirS基因均負責將NO2-轉化為NO. 圖2為大遼河口及其毗鄰區(qū)域5月水體中反硝化細菌nirK和nirS的基因豐度. 由圖2可知，nirS的基因豐度范圍為3.19×105～3.19×107copies/L(平均值為7.76×106copies/L)，L5站位nirS基因豐度最低，EL1站位的nirS基因濃度最高. L1、L2、EL1、EM1、ER1這5個站位的nirS基因豐度均高于平均值，其余站位均低于平均值. 前人在研究其他水體nirS基因豐度時也得到了相似的結果，如Zheng等[25]研究長江口nirS基因空間分布，發(fā)現(xiàn)其豐度范圍為1.77×105～1.42×108copies/L；陳玲[26]在研究淡水湖泊滇池與洱海水體nirS基因時，得出其豐度為1.13×105～3.66×107copies/L.

圖2 大遼河口及其毗鄰區(qū)域5月水體中反硝化細菌nirK和nirS的基因豐度

nirK的基因豐度范圍為7.73×105～2.54×108copies/L(平均值為2.5×107copies/L). L9站位的nirK基因豐度最低，L5站位的nirK基因豐度最高且明顯高于其他幾個站位. L2、L5、EL1、EM1和ER1這5個站位的nirK基因豐度均高于平均值，其余站位均低于平均值. Desnues等[27]研究發(fā)現(xiàn)，含有nirK的反硝化細菌分布在pH、O2和含硫量等環(huán)境因子波動較大的生境；Knapp等[28]研究發(fā)現(xiàn)，含有nirK基因的反硝化細菌在DO濃度隨晝夜變化較大的環(huán)境中和夜間硝酸鹽吸收率較高的生境中，豐度也較高. 這可能是L5站位nirK基因豐度較高的原因.

由圖2也可以看出，除L5站位nirK基因豐度較高、nirS基因豐度較低外，其他站位nirK和nirS基因豐度的站位變化趨勢基本相同且位點間差異不大.nirK和nirS基因均高于平均值的站位大多位于上游河流和河流的入?？谖恢? 這可能與上游河流人類活動密集，農(nóng)藥化肥、養(yǎng)殖廢水、居民生活污水等排入河流造成水體富營養(yǎng)化，為nirK和nirS反硝化細菌的生存提供了良好的環(huán)境有關；而河流下游靠近營口化工廠和造紙廠，水體受到嚴重污染，化學物質可能導致nirK和nirS反硝化細菌受到抑制[29]，因nirK型反硝化細菌耐污染能力比nirS型好，因此nirK型細菌豐度高于nirS型[30]；河口區(qū)域靠近污水處理廠，營養(yǎng)物質豐富造成nirK和nirS反硝化細菌增多，而由河口到近海由于受到海水的稀釋，營養(yǎng)物質變少、海水鹽度變大，導致nirK和nirS反硝化細菌減少[29]. 總體來看，nirK和nirS兩種基因在不同站位上有著相同的數(shù)量級，變化規(guī)律同步，這與Yin等[31]研究結果一致.nirK基因豐度波動大于nirS基因，這主要與nirK基因對環(huán)境的敏感程度要遠大于nirS基因有關[32].

2.1.2水體中nosZ基因的豐度

nosZ基因是反硝化過程中將NO還原為N2O的功能基因[33]. 圖3為大遼河口及其毗鄰區(qū)域5月水體中nosZ的基因豐度. 由圖3可知，nosZ的基因豐度范圍為3.22×103～4.92×105copies/L(平均值為1.13×105copies/L). L7站位的nosZ基因豐度最高，ER2站位最低. L2、L5、L6、L7、EL1、EL2和EM1站位的nosZ基因豐度均高于平均值，且不同站位間nosZ的基因豐度差別較大. 已有研究發(fā)現(xiàn)不同壓力深度、咸淡水及不同季節(jié)均會影響nosZ的基因豐度，如Barrett等[34]研究了愛爾蘭的農(nóng)用地下水，得出4處不同壓力深度下nosZ的基因豐度在1.03×102～9.4×102copis/L之間，比該研究結果高出1～3個數(shù)量級；陳玲[26]在研究淡水湖泊滇池與洱海水體nosZ基因時，得出其豐度為8.76×105～1.22×107copies/L，比該研究結果高出2個數(shù)量級；張健偉等[35]運用real-time PCR方法研究了豐水期和枯水期溫榆河中不同站位nosZ的基因豐度，分別為nd～2.37×108和2.0×106～3.04×109copies/L，比該研究結果高2～4個數(shù)量級. 總體來看，nosZ的基因豐度在河流河段由上游到河口站位逐漸增高，與nirK和nirS的基因豐度呈先升后降的變化趨勢有所不同，可能是因為不同基因對環(huán)境的響應程度和耐受性不同，河流段末端雖然污染嚴重，但總體污染程度未超過nosZ型反硝化細菌的耐受性；由河口到近海呈現(xiàn)降低的趨勢，可能同nirK和nirS基因一樣與河口到近海海水稀釋、鹽度變大有關.

圖3 大遼河口及其毗鄰區(qū)域5月水體中nosZ的基因豐度

2.1.3水體中nirK、nirS和nosZ基因的豐度對比

圖4為水體中反硝化細菌功能基因(nirK、nirS和nosZ基因)在不同站位的基因豐度和相對豐度. 由圖4可見，nirK、nirS和nosZ基因在不同站位基因豐度不同，說明這3種基因在大遼河口調查水體中普遍存在.nosZ基因豐度在不同站位較低，nirK基因和nirS基因在不同站位基因豐度大小相似且變化趨勢相同. 3種基因在所有采樣站位的平均豐度大小表現(xiàn)為nirK(2.5×107copies/L)>nirS(7.76×106copies/L)>nosZ(1.13×105copies/L). 總體來看，遼河口水樣中，反硝化細菌中占比最高的是nirK型細菌，nosZ型細菌的平均豐度最低，nirS基因的占比與nirK基因相近. 郭麗蕓[36]在研究江蘇省湖泊反硝化細菌群落結構時也得到了同樣的結論；毛鐵墻等[30]在研究湛江灣沉積物中反硝化和厭氧氨氧化細菌豐度時，發(fā)現(xiàn)nosZ型細菌豐度占比最低，nirS基因的占比最高，與該研究結果相似.

圖4 大遼河口及其毗鄰區(qū)域5月水體中反硝化細菌功能基因(nirK、nirS和nosZ)的基因豐度和相對豐度

2.2 大遼河口及其毗鄰區(qū)域水體中不同調查站位(nirK +nirS)/nosZ的變化

Szukics等[37]研究發(fā)現(xiàn)，(nirK+nirS)/nosZ的大小與N2O氣體的產(chǎn)生量有一定的關系，其值越大表明N2O氣體排放得越多. 由圖5可見，大遼河口及其毗鄰區(qū)域調查站位(nirK+nirS)/nosZ在28.3～1 760 之間(平均值為454.77)，其中河流段變化范圍為28.3～486(平均值為205)，而河口到近海段變化范圍為45.4～1 500(平均值為499). 總體看來，(nirK+nirS)/nosZ較大，存在較多N2O氣體排放[38]，并且河口到近海段N2O氣體排放大于河流段. 在河流段除L5站位因nirK基因豐度較大導致(nirK+nirS)/nosZ較大外，其余站位的(nirK+nirS)/nosZ變幅基本在一個數(shù)量級以內(nèi)且無明顯變化規(guī)律. 在河口近海區(qū)域，三條輻射條狀站位(EL1～EL3、EM1～EM3、ER1～ER3)中EL1～EL3站位線的(nirK+nirS)/nosZ由河口到近海輕微下降，由河口到近海區(qū)域nirK和nirS基因降幅大于nosZ基因，導致(nirK+nirS)/nosZ有所下降，另外兩條輻射條狀站位線則呈現(xiàn)相反的趨勢. 對比三條輻射條狀站位線和3種基因的豐度圖知，nosZ基因豐度顯著下降，導致(nirK+nirS)/nosZ由北到南(EL1—EM1—ER1、EL2—EM2—ER2、EL3—EM3—ER3)顯著上升，說明近海三條輻射站位南邊N2O氣體排放高于北邊. 可見，由河口到近海和由北到南的三條近海輻射線nosZ基因豐度均逐漸減少，導致不能將無機氮徹底還原為N2. 曹林樺等[38]研究發(fā)現(xiàn)，高濃度的硝態(tài)氮會使nosZ基因活性得到抑制，進而減慢N2O轉化為N2的速率，因此nosZ基因豐度的減少與硝態(tài)氮的積累有關. 總體看來，根據(jù)從河口到近海3種基因在站位線的變化情況，nosZ基因受到的影響大于nirK和nirS基因，說明大遼河河口及其毗鄰近海區(qū)域主要進行的反硝化為NO2-還原形成NO，因此N2O的產(chǎn)生較多.

圖5 大遼河口及其毗鄰區(qū)域5月水體中(nirK+nirS)/nosZ

2.3 反硝化功能基因與水環(huán)境因子的關系

根據(jù)影響水體細菌的非生物因素[39]，對所采集的大遼河口水體中12項環(huán)境因子進行了測定，結果如圖6所示. 鹽度作為影響反硝化細菌的非生物因素之一，可改變其生理方面特性進而影響其活性[40]，濃度越高活性越低，5月大遼河河口區(qū)鹽度變化范圍為0.27‰～21.87‰，其中河流段鹽度變化范圍為0.27‰～0.35‰，而近海段由于受到海水的輸入變化比較明顯，變化范圍為10.11‰～21.87‰. 溫度對反硝化作用所需酶的活性有一定影響，研究發(fā)現(xiàn)反硝化作用的最適溫度為30 ℃[41]. 采樣期間遼河河口區(qū)各站位水溫變化范圍為16.1～18.5 ℃，平均值為16.8 ℃，各站位間變化不明顯；pH變化范圍為7.04～8.07，平均值為7.68，各站位pH整體比較平穩(wěn)，并呈現(xiàn)中性偏堿性水平. 已有[42]研究發(fā)現(xiàn)，低pH可減慢反硝化速率，pH在7～8之間最有利于反硝化過程的進行. O2對反硝化作用的影響較大，高濃度的氧會促進好氧反硝化細菌反硝化作用的進行，減慢厭氧反硝化細菌反硝化作用的步伐[43]，該研究站位DO濃度的變化范圍為5.1～9.33 mg/L，平均值為6.56 mg/L，河口河流段DO濃度變化不明顯，河口近海段出現(xiàn)小幅波動. 大遼河河口區(qū)營養(yǎng)鹽的檢測中，SiO32-、NO2-、NO3-和TN濃度變化范圍分別為0.834～3.336、0.127～0.377、1.187～4.206和2.620～7.515 mg/L，平均值分別為2.2、0.221、2.816、5.391 mg/L，SiO32-、NO2-、NO3-濃度總體表現(xiàn)為河流段高于近海區(qū)，而TN濃度除L5站位較低外，總體呈現(xiàn)由河流上游到河口逐漸上升、由河口到近海逐漸降低的趨勢. 這主要是因為大遼河河流段受人為影響因素眾多，注入了豐富的營養(yǎng)鹽，而由河口到近海輸送的過程中營養(yǎng)鹽在多種生物化學過程中得到消耗. 已有[44]研究發(fā)現(xiàn)，重金屬對反硝化基因也有影響，因此該研究進行了大遼河河口區(qū)水體重金屬的研究. 重金屬檢測結果中，金屬Cu和Pb在調查區(qū)域均未檢出；金屬Zn在河口河流段被檢出，其含量由河流上游河段到河口逐漸升高，金屬As、Cr和Cd在河流段含量較低，且無明顯規(guī)律，Zn、As、Cr和Cd在近海段含量較大，且波動較明顯.

圖6 大遼河口及其毗鄰區(qū)域5月水體中水質參數(shù)的空間分布

因子分析是指研究從變量群中提取共性因子的統(tǒng)計技術，其根據(jù)眾多變量之間的內(nèi)部依賴關系，通過降維和簡化數(shù)據(jù)，使用少數(shù)幾個因子來表示基本的數(shù)據(jù)結構，反映出原來眾多變量的主要信息[45]. 該研究將上述12項環(huán)境指標進行因子分析，意圖推導出影響大遼河口及其毗鄰區(qū)域水環(huán)境狀況的主導因子. KMO檢驗得出其統(tǒng)計量為0.757(>0.7)，說明該研究環(huán)境因子適合做因子分析. Bartlett球形檢驗得出Sig.<0.01，進一步說明各環(huán)境變量間具有相關性，因子分析有效. 公因子方差中12項指標“提取”的值幾乎均大于0.5且多數(shù)在0.8以上，因此變量較好地得到了表達. 為盡量減少具有較大因子荷載量的變量個數(shù)，使用方差最大正交旋轉. 表3為特征值大于1的3個主成分，旋轉后累積方差貢獻率達80.893%，可以反映12項指標的整體水環(huán)境狀況. 表4為各因子旋轉后的載荷率，因子載荷率的絕對值大于0.75，說明二者相關性很好，由此得出主成分因子與水環(huán)境狀況之間的相關程度[46]. 由表4可知，與F1關系最為密切的因子是As、Cd、Cr、SiO32-、NO3-和鹽度；與F2關系最為密切的因子是pH，因此F2可以用pH來表征；與F3關系最為密切的是T，因此F3可以用T來表征. 綜上，As、Cd、Cr、SiO32-、NO3-、T、pH和鹽度主導了大遼河口及其毗鄰區(qū)域水環(huán)境的整體狀況. 前人也開展了水體中微生物與環(huán)境因子的研究，發(fā)現(xiàn)不同生境條件下影響微生物的主要環(huán)境因子有所不同[47]；孫海美等[48]研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)e是影響布吉河群落結構的主要水環(huán)境因子；Yan等[49]研究發(fā)現(xiàn)，SiO32-、DO和NO3-是影響三峽水庫細菌群落結構的主要水環(huán)境因子；張健偉等[35]研究溫榆河中硝化和反硝化基因數(shù)量變化時發(fā)現(xiàn)，T和總有機碳對微生物基因影響最大；呂明姬等[50]在進行滇池湖體浮游細菌與水環(huán)境因子的研究時發(fā)現(xiàn)，氮類無機營養(yǎng)物是影響浮游細菌分布的主要因子. 微生物基因豐度的改變反映了水環(huán)境質量的變化情況，但因影響微生物基因數(shù)量的因素很多，在實際河流污染治理時統(tǒng)籌考慮各環(huán)境因子的變化和影響，才能取得較好的治理效果.

表3 大遼河口及毗鄰區(qū)域水環(huán)境指標的因子特征值

表4 大遼河口及毗鄰區(qū)域水環(huán)境指標旋轉后因子載荷率

將該研究中3種基因的基因豐度數(shù)據(jù)做DCA分析，發(fā)現(xiàn)第一軸長度為0.16(小于3)，表明該研究的基因與環(huán)境因子之間存在線性相關，因此更加適合進行RDA分析[23]. 將反硝化細菌基因數(shù)量與12項水環(huán)境因子做RDA分析，意圖得出影響細菌數(shù)量的主要水環(huán)境因子. 根據(jù)RDA分析結果(見圖7)可知，第一、二排序軸的特征值分別為 0.859 1 和 0.015 4，兩排序軸共解釋了變異的87.45%，因此兩個排序軸可真實反映環(huán)境因子對反硝化功能基因豐度的影響程度. 第一、二排序軸基因豐度與環(huán)境因子的相關系數(shù)分別為 0.937 9 和 0.813 7，說明排序軸與環(huán)境因子相關性高，分析結果可靠. 從nirS基因與nosZ基因、nirK基因與nosZ基因的夾角可知，兩對基因間有一定相關性. 為了使各基因的豐度數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，將3種基因的豐度進行對數(shù)轉換后進行Pearson相關性分析，結果發(fā)現(xiàn)除nirK基因與nosZ基因呈顯著相關(P<0.05)外，其余基因間無顯著性相關，因此進一步研究環(huán)境因子與3種基因的相關性. 根據(jù)圖7中環(huán)境因子與基因之間的夾角可以看出，各環(huán)境因子均對nirK、nirS和nosZ基因豐度有一定程度影響，水環(huán)境因子對反硝化功能基因豐度影響程度表現(xiàn)為ρ(DO)>ρ(TN)>ρ(NO2-)>ρ(SiO32-)>ρ(Cd)>ρ(NO3-)>鹽度>ρ(As)>ρ(Cr)>T>ρ(Zn)>pH，且DO濃度對nirS基因的影響最大，NO3-濃度對nirK基因和nosZ基因的影響最大. 易能等[51]研究富氧灌溉池塘中反硝化細菌豐度時發(fā)現(xiàn)，nirK、nirS和nosZ基因均與DO濃度、pH和T呈顯著相關，而與NO3-濃度相關性不顯著，這與該研究結果有所不同，說明不同環(huán)境條件下反硝化基因對環(huán)境因子的響應不同. 由圖7中不同環(huán)境因子與反硝化功能基因之間的夾角不同可知，該研究中3種反硝化基因的微生物種群對環(huán)境因子變化的響應不同[52]. 將數(shù)據(jù)進行蒙特卡羅檢驗發(fā)現(xiàn)P均大于0.05，說明沒有顯著影響的因子大遼河口及毗鄰區(qū)域反硝化功能基因豐度是由各項環(huán)境因子相互作用、共同影響的結果.

注： TN、NO2-、NO3-、SiO32-、DO均表示其濃度；Zn、Cr、Cd、As均表示其含量.

2.4 不確定分析

該研究通過一系列全面的調查確定了一些最具代表性的采樣點，但由于人力、物力有限，只可反映調查時期所研究區(qū)域反硝化細菌的豐度變化. 另外，在進行反硝化細菌的研究時還存在一些不確定因素：除了該研究的環(huán)境因子，也還有其他環(huán)境因子對細菌和反硝化細菌產(chǎn)生影響；基因測定方法的不同對結果也會有一定影響；反硝化細菌群落的組成和分布的影響因素很多，不同功能基因型的反硝化細菌對環(huán)境因素的響應程度也不一樣. 因此，不同人為活動和污染的影響以及不同的環(huán)境條件都會對其分布產(chǎn)生影響. 在后續(xù)研究中，會進一步優(yōu)化基因測定方法、環(huán)境因子、監(jiān)測站位和監(jiān)測時間，完善海洋與河口水體中反硝化細菌的變化規(guī)律，為指導海灣污染治理和生態(tài)恢復提供更完整的功能微生物背景資料.

3 結論

a) 大遼河口水樣中反硝化功能基因nirK、nirS和nosZ基因的豐度變化范圍分別為7.73×105～2.54×108、3.19×105～3.19×107、3.22×103～4.92×105copies/L，平均值分別為2.5×107、7.76×106和1.13×105copies/L. 總體來看，大遼河口水體中反硝化細菌占比最高的是nirK型細菌，nosZ型細菌的平均豐度最低.nirK和nirS基因均高于平均值的站位大多位于調查河流的起始段和河流的入海口位置.nosZ基因豐度總體在河流河段由上游到河口逐漸增高，由河口到近海呈現(xiàn)降低的趨勢. 除nosZ基因豐度在不同站位較低外，nirK和nirS基因在不同站位基因豐度相似且具有相同趨勢.

b) 大遼河流域(nirK+nirS)/nosZ較大，存在較多N2O氣體排放，由河口到近海站位線上主要進行的反硝化為NO2-還原形成NO，因此N2O的產(chǎn)生較多.

c) As、Cd、Cr、SiO32-、T、NO3-、pH和鹽度主導了大遼河口及其毗鄰區(qū)域水環(huán)境的整體狀況，水環(huán)境因子對反硝化功能基因豐度影響程度表現(xiàn)為ρ(DO)>ρ(TN)>ρ(NO2-)>ρ(SiO32-)>ρ(Cd)>ρ(NO3-)>鹽度>ρ(As)>ρ(Cr)>T>ρ(Zn)>pH，且DO濃度對nirS基因的影響最大，NO3-濃度對nirK和nosZ基因的影響最大. 各環(huán)境因子對反硝化功能基因影響不顯著，大遼河口及其毗鄰區(qū)域反硝化功能基因豐度是由各項環(huán)境因子相互作用、共同影響的結果.