趙麗君，董 曉，李曉娜，黃 棣，張全有，侯晉川，陳維毅

(1.太原理工大學(xué) a.生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程系，納米生物材料與再生醫(yī)學(xué)研究中心，b.生物醫(yī)學(xué)工程研究所，材料強度與結(jié)構(gòu)沖擊山西省重點實驗室, c.數(shù)學(xué)學(xué)院，太原 030024；2.北京大學(xué) 微電子研究所，北京 100871)

細(xì)胞在黏附、鋪展和遷移過程中通過肌動蛋白和肌球蛋白等細(xì)胞骨架體系產(chǎn)生牽引力，在炎癥、傷口愈合、血管再生和腫瘤轉(zhuǎn)移等諸多生物學(xué)過程中發(fā)揮重要作用[1-2]。在二維平面培養(yǎng)體系中，可根據(jù)細(xì)胞在遷移或鋪展過程中硅膠膜基底產(chǎn)生的褶皺，或未起皺硅膠膜彈性膜上包被的微米級乳膠小球的位置變化，大致估算細(xì)胞所產(chǎn)生的牽引力的大小，但褶皺變形和小球的位移與細(xì)胞牽引力之間的關(guān)系為非線性，不能采用經(jīng)典的彈性理論進(jìn)行分析[3-6]。細(xì)胞在軟的凝膠或高分子聚合物彈性基底表面局部黏附產(chǎn)生的牽引力，可采用線彈性連續(xù)介質(zhì)理論進(jìn)行分析，但細(xì)胞產(chǎn)生牽引力的同時會在一定范圍內(nèi)引起基底發(fā)生形變，無法真正獲得局部某個黏附點的牽引力[7]。

鑒于原位生長在組織的細(xì)胞，通過黏附與周圍具有三維空間的細(xì)胞外基質(zhì)之間發(fā)生相互作用，發(fā)展可直接測量并分析三維空間的細(xì)胞牽引力方法，將進(jìn)一步拓展對細(xì)胞-細(xì)胞以及細(xì)胞-微環(huán)境之間相互作用等的理解。有學(xué)者探索了在細(xì)胞上下表面均鋪有包埋熒光粒子的軟凝膠，結(jié)合顯微成像技術(shù)[8]、在微柱上包被纖連蛋白，通過彈性微柱的形變[9]可檢測細(xì)胞在2.5維空間微環(huán)境中所產(chǎn)生的牽引力。但真正實現(xiàn)細(xì)胞在三維微環(huán)境中牽引力的測量仍是一個挑戰(zhàn)。

為解決上述困難，本文將設(shè)計并加工一種Parylene-C微板用于細(xì)胞的培養(yǎng)與細(xì)胞在三維微環(huán)境中牽引力的測量研究。 Parylene-C是一種具有保型性淀積特性、化學(xué)惰性以及透光性的聚合物[10]，因其具有良好的生物兼容性而開始越來越多地應(yīng)用于生物研究領(lǐng)域[11]，如作為生物電極的包裹層[12-13]、液體藥物的存儲容器[14-15]以及視網(wǎng)膜移植手術(shù)中的輔助材料[16-18]等。2012年日本東京大學(xué)研究人員利用細(xì)胞牽引力將Parylene-C薄膜折成了很好的立體三維結(jié)構(gòu)，細(xì)胞可通過牽張力使薄膜折疊，制備出各種不同形狀的空管結(jié)構(gòu)，主要應(yīng)用于諸如具有管狀結(jié)構(gòu)的人工血管支架和細(xì)胞三維生長環(huán)境的構(gòu)建[19]。該研究為實現(xiàn)三維細(xì)胞牽張力的測量提供了很好的啟示，但要應(yīng)用于單細(xì)胞牽張力的測試，在微板的結(jié)構(gòu)和加工工藝上仍需要進(jìn)一步改進(jìn)。

本文所設(shè)計的Parylene-C微板將采用MEMS微加工方法，通過Parylene-C薄膜的淀積與刻蝕進(jìn)行制備。本文的Parylene-C微板涉及兩個厚度的Parylene-C組成部分：一對3 μm厚的方形主體部分以及它們之間100 nm厚的連接部分。該連接通?？梢酝ㄟ^對3 μm厚的Parylene-C主體部分之間剩余Parylene-C進(jìn)行第二次刻蝕得到，但由于受限于Parylene-C刻蝕工藝的刻蝕精度與刻蝕均勻性，很難精確控制第二次刻蝕的厚度。本文通過合理的方案設(shè)計和技術(shù)路線，在第一次刻蝕時將方形區(qū)域之間的3 μm厚Parylene-C完全刻蝕掉，然后再淀積一層100 nm厚Parylene-C薄膜并刻蝕出方形區(qū)域之間的連接。由于Parylene-C淀積對厚度控制精確度更高，因此可通過該方法精確得到厚度為100 nm的連接區(qū)域。通過該方法，本文制備了一種可用于測量單細(xì)胞牽張力的Parylene-C微板。

1 微板設(shè)計

為實現(xiàn)單細(xì)胞空間折疊，微板結(jié)構(gòu)設(shè)計如圖1所示。硬度較大的玻璃作為底層，便于微折疊板向培養(yǎng)皿中轉(zhuǎn)移。中間犧牲層Gelatin(明膠)在37 ℃水中能夠溶解，從而釋放上層Parylene-C微板。上層Parylene-C微板兩側(cè)是厚度和邊長分別為3 μm和50 μm的方形Parylene-C區(qū)域。Parylene-C微板中間連接處的厚度為100 nm，寬度為5 μm，為兩側(cè)板折疊起到柔性連接的作用。

圖1 微板結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1 Schematic of microplate structure

2 實驗過程

2.1 微板加工

首先通過第一次刻蝕得到左右兩個間距為5 μm、 厚度為3 μm的方形Parylene-C區(qū)域；然后，再淀積一層100 nm厚的Parylene-C，并通過刻蝕所設(shè)計微板圖形之外的該層Parylene-C，完成方形區(qū)域之間的連接，刻蝕示意圖如圖2所示。

圖2 優(yōu)化后Parylene-C微板兩次刻蝕示意圖Fig.2 Schematic of the two-step etching of Parylene-C microplate after optimization

優(yōu)化后的工藝流程如圖3所示。本文使用厚度為450 μm的4英寸玻璃片(型號：BF33)作為微加工基底。采用2 000 r/min轉(zhuǎn)速在玻片表面旋涂Gelatin，旋涂后需要在95 ℃真空烘箱中加熱40 s.旋涂后，使用真空氣相淀積系統(tǒng)(型號：SCS PDS2010)沉積淀積3 μm厚Parylene-C.第一次旋涂光刻膠使用正性光刻膠(型號：RZJ-304-50)，旋涂采用轉(zhuǎn)速為2 000 r/min，時間為30 s.旋涂后，需要在95 ℃真空烘箱中加熱40 s.本實驗使用光刻機(jī)(型號：SUSS MA-6)對光刻膠進(jìn)行曝光處理以得到所需圖形，曝光時間為60 s.曝光后進(jìn)行顯影(顯影液型號：RZX-3038)，顯影時間為80 s.本實驗使用等離子體刻蝕機(jī)(型號：ME-6A)刻蝕Parylene-C.刻蝕所用氣體O2，流量為60 mL/min；射頻功率為250 W，刻蝕時間為600 s.刻蝕結(jié)束后，使用丙酮浸泡5 min，去除Parylene-C表面殘留的光刻膠。使用真空氣相淀積系統(tǒng)(型號：SCS PDS2010)第二次沉積Parylene-C.為得到100 nm厚的Parylene-C薄膜，需要加入0.16 g原料。第二次旋涂光刻膠使用正性光刻膠(型號：RZJ-304-25)，旋涂采用轉(zhuǎn)速為3 000 r/min，時間為60 s.旋涂后需要在95 ℃真空烘箱中加熱30 s.本實驗使用光刻機(jī)(型號：SUSS MA-6)對光刻膠進(jìn)行曝光處理以得到所需圖形，曝光時間為7 s.曝光后進(jìn)行顯影(顯影液型號：RZX-3038)，顯影時間為45 s.本實驗使用等離子體刻蝕機(jī)(型號：ME-6A)刻蝕Parylene-C.刻蝕所用氣體為O2，流量為60 mL/min；射頻功率為250 W，刻蝕時間為60 s.刻蝕結(jié)束后，使用丙酮浸泡5 min，去除Parylene-C表面殘留的光刻膠，然后用無水乙醇與去離子水清洗，氮氣吹干，得到目標(biāo)形狀和尺寸的Parylene-C微板。

圖3 微板加工流程圖Fig.3 Fabrication process of microplate

2.2 細(xì)胞實驗

在微折疊板上接種細(xì)胞之前，先通過光刻膠的剝離工藝在玻璃片上非Parylene-C區(qū)域進(jìn)行MPC聚合物修飾，以阻止細(xì)胞在Parylene-C區(qū)域之外發(fā)生黏附。在光刻膠剝離之后，對微板表面修飾Ⅰ型膠原，以增強其與目標(biāo)細(xì)胞的黏附。成纖維細(xì)胞培養(yǎng)采用DMEM培養(yǎng)基(含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清、10 mg/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素)。將細(xì)胞接種于Parylene-C微板上，控制細(xì)胞濃度，使得每對微板上只生長一個細(xì)胞。37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5% CO2條件下培養(yǎng)4 h后換液，培養(yǎng)24 h后進(jìn)行細(xì)胞折疊實驗。

3 結(jié)果與討論

3.1 微板加工結(jié)果與討論

采用MEMS微加工方法制備的Parylene-C微板如圖4所示，其中圖4(a)是加工后的整體玻璃片，其表面制備有Parylene-C微板陣列；圖4(b)是顯微鏡明場下的微板陣列。

圖4 微板陣列Fig.4 Photo of microplate array

微板中Parylene-C的厚度通過測量與玻璃片一起淀積的硅片上的Parylene-C厚度得到。測量使用設(shè)備為膜厚儀(型號：K-MAC ST2000)，設(shè)計厚度為3 μm的Parylene-C膜實際測量厚度為(3.32±0.05)μm，設(shè)計厚度為100 nm的Parylene-C膜實際測量厚度為(124.3±4.6) nm.

通過該測量結(jié)果可知，第二次Parylene-C淀積時，Parylene-C的厚度可以控制在100 nm左右，而第二次刻蝕并未對方形區(qū)域之間的Parylene-C進(jìn)行刻蝕，因此保證了微板設(shè)計中3 μm厚方形Parylene-C區(qū)域之間100 nm厚Parylene-C柔性連接的實現(xiàn)。

微板中圖形尺寸由掃描電鏡(型號：HITACHI UHR FE-SEM SU8200)拍照并測量得到。測量結(jié)果如圖5所示。方形Parylene-C實際測量邊長為(50.9±0.8)μm(設(shè)計尺寸為50 μm)，方形Parylene-C對之間實際測量間隔為4.64 μm(設(shè)計尺寸為5 μm).

圖5 微板掃描電鏡圖片F(xiàn)ig.5 SEM image of microplate

長度的尺寸誤差是由光刻的曝光與顯影以及Parylene-C刻蝕引入的，成品可以滿足實驗需求。另外，從圖5中可以看出，方形區(qū)域之間100 nm厚的Parylene-C柔性連接并未完全與第一次刻蝕后的Parylene-C方形區(qū)域之間的凹槽吻合，存在左右偏差，這是由于第二次光刻時與第一次光刻圖形存在2 μm的系統(tǒng)對準(zhǔn)精度所致。

3.2 細(xì)胞實驗結(jié)果與討論

成纖維細(xì)胞接種于Parylene-C微板上后，37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2條件下培養(yǎng)24 h，細(xì)胞鋪展?fàn)顟B(tài)良好，經(jīng)顯微操縱器觸發(fā)微板后，能成功引起微板折疊，如圖6所示。

圖6 細(xì)胞牽引力折疊微板Fig.6 CTFs fold microplate

細(xì)胞接種于微板上，能否實現(xiàn)細(xì)胞只生長在微板區(qū)且每個微板上只有一個細(xì)胞生長的效果，主要取決于兩個方面的因素。一是MPC聚合物涂層的修飾是否成功，MPC聚合物的修飾若不均勻或根本未嫁接到非微板區(qū)，會導(dǎo)致整個玻片基底上不止微板區(qū)有細(xì)胞生長，非微板區(qū)也會鋪滿細(xì)胞；或者即便是單個細(xì)胞落在微板區(qū)，在完成鋪展后，細(xì)胞會因為微板外空間沒有MPC聚合物阻止黏附的作用而生長至微板外，也就是鋪展到非微板區(qū)，這樣一個細(xì)胞就會橫跨微板區(qū)和非微板區(qū)。二是細(xì)胞懸液濃度的調(diào)整，不同的細(xì)胞類型，因鋪展后的面積和增殖速度不同，需要摸索不同的接種濃度以達(dá)到最佳單細(xì)胞生長效果。本實驗中成纖維細(xì)胞的細(xì)胞懸液濃度經(jīng)不斷調(diào)試后確定為4×104mL-1，每個35 mm培養(yǎng)皿中接種1 mL細(xì)胞懸液，能很好地實現(xiàn)整個基底上的單細(xì)胞-微板培養(yǎng)。微板陣列被單細(xì)胞覆蓋的比率可達(dá)75%～80%左右，能為后續(xù)單細(xì)胞牽引力的測量實驗提供很好的基礎(chǔ)條件。

4 結(jié)論

本研究采用MEMS微加工工藝，加工方案經(jīng)優(yōu)化設(shè)計，通過兩次Parylene-C淀積與刻蝕，最終制備出具有(124.3±4.6) nm柔性連接的Parylene-C微折疊板，從而能很好地實現(xiàn)細(xì)胞黏附所引起的微板折疊，有效地避免了微板連接處硬度太高所引起的折疊失敗和后續(xù)計算牽張力的誤差。

細(xì)胞鋪展和黏附面積很大程度上取決于細(xì)胞可黏附區(qū)域的大小。本文微板制備工藝可精準(zhǔn)控制微板方形區(qū)域Parylene-C的厚度和面積，后續(xù)的研究將進(jìn)一步考慮微板面積與細(xì)胞黏附面積的關(guān)系。微板形狀設(shè)計的不同可能也會引起細(xì)胞鋪展形態(tài)發(fā)生改變，進(jìn)而也會影響細(xì)胞與微板的黏附模式。后續(xù)嘗試設(shè)計多種微板形狀用于對細(xì)胞牽張力的測試也是非常必要的。此外，100 nm厚度的Parylene-C微折疊板連接雖然能很好實現(xiàn)細(xì)胞對微板的折疊，但建立細(xì)胞牽張力與微板折疊角度的定量關(guān)系是至關(guān)重要的，比如細(xì)胞使微板發(fā)生折疊后，根據(jù)微板的折疊角度，再結(jié)合有限元模擬微板折疊相應(yīng)角度所需的彎矩，即可計算出單細(xì)胞牽引力的大小。這將是本文后續(xù)研究的重點。

本文細(xì)胞實驗證實，Parylene-C微板可用于計算和分析不同類型黏附細(xì)胞的牽引張力，為細(xì)胞力學(xué)生物學(xué)領(lǐng)域研究細(xì)胞-基質(zhì)黏附、細(xì)胞鋪展、細(xì)胞分裂以及細(xì)胞力學(xué)特性提供了一種有效的測量方法。