武月園，燕鵬云，劉 洋，冀健龍，菅傲群，桑勝波

(太原理工大學(xué) a.微納系統(tǒng)研究中心，b.新型傳感器與智能控制教育部和山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，太原 030024)

在生物細(xì)胞工程、藥物研究及環(huán)境監(jiān)測(cè)等領(lǐng)域，常需要對(duì)流體內(nèi)微粒進(jìn)行分析研究，因此在流體中實(shí)現(xiàn)對(duì)微粒的操控具有重要研究意義和實(shí)用價(jià)值[1-2]。與各類操縱技術(shù)，如流體聚焦[3]、光鑷[4-5]和磁場(chǎng)分離[6]等相比，介電泳技術(shù)[7-8]基于電場(chǎng)力產(chǎn)生的穩(wěn)定捕獲場(chǎng)，可以實(shí)現(xiàn)微米級(jí)生物粒子[9-11](諸如蛋白質(zhì)、核酸、脂質(zhì)和糖類等生物大分子及細(xì)胞)的分離、捕獲和定向操縱，具有精確、快速、低成本、無標(biāo)記的優(yōu)點(diǎn)[12-13]。

1951年介電泳現(xiàn)象由美國(guó)物理化學(xué)家POHL[14]首次在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，懸浮在介質(zhì)中的微粒在非均勻電場(chǎng)作用下可產(chǎn)生定向運(yùn)動(dòng)，其運(yùn)動(dòng)方向取決于二者介電常數(shù)的相對(duì)大小。到20世紀(jì)90年代，隨著微納加工技術(shù)的出現(xiàn)，利用介電泳效應(yīng)收集、定位和分離懸浮液中的微粒的技術(shù)取得了很大的進(jìn)步，臨床醫(yī)學(xué)和藥理學(xué)研究的迫切需求也促進(jìn)了介電泳技術(shù)的發(fā)展[15]。介電泳技術(shù)依賴于粒子和介質(zhì)溶液的固有電性質(zhì)，被操控的目標(biāo)粒子不需要標(biāo)記，同時(shí)介電泳芯片的實(shí)現(xiàn)方式相對(duì)簡(jiǎn)單，因此成為微流控設(shè)備中實(shí)現(xiàn)大量粒子(如細(xì)胞、蛋白質(zhì)、DNA和病毒等)集體性操控法的最廣泛的方法之一[7,15]。

DASTIDE R et al[16]設(shè)計(jì)并制備了一種基于叉指電極陣列的阻抗生物傳感器，利用正介電泳力將大腸桿菌聚焦并集中到微通道的中心，并將其引導(dǎo)檢測(cè)區(qū)微通道，實(shí)現(xiàn)了低濃度大腸桿菌O157:H7的檢測(cè)。KIM et al[17]人在微流控芯片中，設(shè)計(jì)了六電極芯片產(chǎn)生介電泳力，促進(jìn)膠體微球的晶體生長(zhǎng)，從而形成尺寸約為200 μm的非離子聚丙烯酰胺(PAA)晶體團(tuán)簇。COTTET et al團(tuán)隊(duì)[18]設(shè)計(jì)了由8個(gè)電極組成的圓形排列介電泳芯片，并驗(yàn)證了其捕獲性能，采用PS微球和HEK細(xì)胞進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)測(cè)試，在流動(dòng)狀態(tài)中實(shí)現(xiàn)了可控制大小和成分的細(xì)胞聚集體。雖然以上結(jié)構(gòu)都實(shí)現(xiàn)了對(duì)溶液內(nèi)目標(biāo)微粒不同形式的匯聚，但是所用電極結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜，需要高精度光刻工藝才能實(shí)現(xiàn)，提高了器件的經(jīng)濟(jì)和時(shí)間成本。

本文設(shè)計(jì)并制備了基于星形平面電極的聚苯乙烯(PS)微球富集芯片，充分利用星形結(jié)構(gòu)產(chǎn)生的不均勻電場(chǎng)，在介電泳力作用下形成了微球聚集體。采用lift-off工藝，克服了陣列電極加工工藝復(fù)雜的問題，制作成本低廉。研究了信號(hào)頻率、幅值大小、PS微球濃度對(duì)匯聚效果的影響，該電極芯片利用比較簡(jiǎn)單的結(jié)構(gòu)就完成了對(duì)大量微球的定向集體性運(yùn)動(dòng)控制，實(shí)現(xiàn)了良好的富集效果，對(duì)后續(xù)實(shí)現(xiàn)對(duì)微米級(jí)生物粒子的操縱，研究其生理、病理性質(zhì)奠定了基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)原理與裝置

1.1 介電泳原理

本文設(shè)計(jì)的星形平面電極結(jié)構(gòu)如圖1所示。在非均勻電場(chǎng)中，懸浮在磷酸緩沖鹽溶液(PBS)內(nèi)PS微球在介電泳力作用下向星形電極的中心移動(dòng)，達(dá)到富集的效果。其在電場(chǎng)中所受到的介電泳力可用式[13,19]表示

(1)

(2)

式中：ε是介電常數(shù)，下標(biāo)p和m分別代表粒子和介質(zhì)溶液。CM因子的正負(fù)決定粒子受到正介電泳響應(yīng)或者負(fù)介電泳響應(yīng)，這意味著粒子向高電場(chǎng)或低電場(chǎng)的區(qū)域移動(dòng)。CM因子的實(shí)部定義為

(3)

圖1 介電泳力操縱PS小球富集示意圖Fig.1 Illustration of PS pellet enrichment manipulated by dielectrophoretic force

在懸浮液內(nèi)，PS微球處于非勻強(qiáng)電場(chǎng)內(nèi)，其感應(yīng)電荷的分布不對(duì)稱[15,19]。因極化作用與介質(zhì)接觸的表面誘導(dǎo)出電荷形成電偶極子，其電性會(huì)隨著電場(chǎng)的變化發(fā)生反轉(zhuǎn)使得微球發(fā)生定向的遷移運(yùn)動(dòng)。如圖1所示，兩個(gè)相對(duì)電極接入相同極性的信號(hào)，使得相鄰兩個(gè)電極的極性相反，星形電極外接交流信號(hào)會(huì)產(chǎn)生非均勻電場(chǎng)，在電極的邊緣處存在著強(qiáng)電場(chǎng)，而遠(yuǎn)離邊緣的電極中心為弱電場(chǎng)區(qū)。

當(dāng)PS微球比介質(zhì)溶液有著更差的極化性質(zhì)，微球表面的電偶極子會(huì)排斥電場(chǎng)，向著電極邊緣匯聚。從空間角度看，電場(chǎng)便會(huì)繞過微球使其向強(qiáng)電場(chǎng)方向移動(dòng)，如圖2中a粒子，也就是說小球受到了正介電泳力[20-21]。當(dāng)介質(zhì)溶液極化量大于微球極化量，微球表面吸引較多的異性電荷，電場(chǎng)便會(huì)穿過微球內(nèi)部使其向弱電場(chǎng)方向移動(dòng)，即電極邊緣處的PS微球向著星形電極的中心運(yùn)動(dòng)，也就是說粒子受到了負(fù)介電泳力作用[21]，如圖2中b粒子所示。在微粒與介質(zhì)溶液確定的情況下，介電泳力的正負(fù)取決于Re[fcm]的符號(hào)，大小由施加電場(chǎng)決定，因此可以通過調(diào)節(jié)頻率和電場(chǎng)強(qiáng)度，提高PS微球的富集效率。

圖2 非均勻場(chǎng)中介質(zhì)粒子極化示意圖Fig.2 Schematic diagram of dielectric particle polarization in inhomogeneous field

1.2 實(shí)驗(yàn)裝置

實(shí)驗(yàn)試劑為AZ5124光刻膠、AZ系列顯影液、丙酮和無水乙醇。采用PS微球(單分散PS微球直徑為5 μm，密度為1.030 kg/m3，購(gòu)于天津倍思樂色譜技術(shù)開發(fā)中心)與去離子水配制不同比例濃度的PS微球懸浮液。采用少量磷酸鹽緩沖液制備低電導(dǎo)率溶液，使用移動(dòng)式電導(dǎo)率儀(?，擜R8011)測(cè)量其電導(dǎo)率，用此溶液調(diào)節(jié)PS懸浮液的電導(dǎo)率。PS微球懸浮液現(xiàn)用現(xiàn)配，并用超聲清洗機(jī)震蕩10 min使PS微球均勻分散。

星形電極各部分尺寸如圖3(a)所示，以15 mm×15 mm普通白玻璃為基底，采用金屬剝離(Lift-off)工藝在基底上形成星形電極。其中PS小球富集區(qū)域的最大間隔為450 μm，相鄰兩個(gè)電極的最小間隔為200 μm.電極的制作工藝流程如圖3(b)所示，實(shí)驗(yàn)前將玻璃基底依次置于去離子水、無水乙醇和異丙醇內(nèi)，之后用超聲清洗機(jī)各清洗15 min，保證基底的整潔性為下一步實(shí)驗(yàn)做準(zhǔn)備。選用正/負(fù)可改變型光刻膠AZ5214的正膠性質(zhì)，使用勻膠機(jī)將其均勻涂覆在玻璃基底上，前烘堅(jiān)膜后在紫外燈下(沃科技有限公司生產(chǎn)，其型號(hào)為FUV-6BK)曝光，經(jīng)過AZ顯影液去除溶解曝光過的光刻膠。采用磁控濺射鍍膜技術(shù)(中國(guó)科學(xué)院沈陽(yáng)科學(xué)儀器股份有限公司，JGP-450磁控濺射系統(tǒng))在基底上鍍5 nm的Cr和100 nm的Au.之后將玻璃基底置于丙酮或酒精中，附在殘留光刻膠上的Au膜會(huì)被剝離，最終得到星形結(jié)構(gòu)的電極。Cr的作用是增強(qiáng)Au膜與襯底的粘附性，避免在剝離過程中Au膜在丙酮或酒精溶液內(nèi)脫落。

圖3 星形電極結(jié)構(gòu)Fig.3 Star electrode structure

2 結(jié)果與分析

本文以5 μm PS微球?yàn)檠芯繉?duì)象，實(shí)驗(yàn)定性分析了溶液電導(dǎo)率、交流信號(hào)電場(chǎng)頻率和幅值以及匯聚時(shí)間對(duì)PS微球富集的影響，以PS微球的團(tuán)簇狀態(tài)驗(yàn)證星形電極的富集效果。

根據(jù)介電泳力公式(1)和CM因子定義公式(3)可知，影響微粒受力的參數(shù)有：介質(zhì)溶液的介電常數(shù)εm、粒子半徑R、CM因子(粒子介電常數(shù)εp，電導(dǎo)率σ和電場(chǎng)的角頻率ω)和電場(chǎng)強(qiáng)度E.選用PS微球?yàn)閷?shí)驗(yàn)分析物，因此R和εp兩個(gè)參數(shù)為確定值。介質(zhì)溶液的介電常數(shù)εm由其電導(dǎo)率σ和電場(chǎng)頻率ω共同決定，電場(chǎng)強(qiáng)度E由信號(hào)電壓決定，因此調(diào)節(jié)電導(dǎo)率，信號(hào)電壓及電場(chǎng)頻率可以改變微粒所受到的介電泳力，從而獲得理想的富集效果。

2.1 臨界頻率的測(cè)定

根據(jù)公式(3)可知，電導(dǎo)率和信號(hào)頻率影響粒子和介質(zhì)的復(fù)介電常數(shù)，CM因子的實(shí)部由粒子和介質(zhì)的復(fù)介電常數(shù)決定，并且CM因子的正負(fù)決定粒子受正介電泳響應(yīng)或者負(fù)介電泳響應(yīng)。因此當(dāng)所研究的微粒已確定，則其電導(dǎo)率為常數(shù)，施加在顆粒上的介電電泳響應(yīng)取決于介質(zhì)溶液的電導(dǎo)率和信號(hào)頻率。理論研究表明[22]，當(dāng)溶液介質(zhì)為低電導(dǎo)率時(shí)，可獲得較好的負(fù)介電泳效應(yīng)。因此，本文首先使用低電導(dǎo)率的介質(zhì)溶液，研究改變信號(hào)頻率對(duì)微球所受介電泳力方向的影響，為PS微球的富集提供依據(jù)。

使用移液槍向芯片上注入100 μL PS微球懸浮液，施加電壓峰值VP-P為5 V的交流信號(hào)，改變施加信號(hào)的頻率，觀察PS微球的介電泳響應(yīng)。未施加交流電壓時(shí)，PS微球均勻的分散在電極上，如圖4(a)所示；當(dāng)信號(hào)頻率為1 kHz時(shí)，PS聚苯乙烯微球受到負(fù)介電泳力向電場(chǎng)強(qiáng)度弱的區(qū)域運(yùn)動(dòng)，電極邊緣處的PS微球向星形區(qū)域中心富集，如圖4(b)所示；當(dāng)頻率為1 MHz時(shí)，PS聚苯乙烯微球同樣受到負(fù)介電泳力向電極中心富集，如圖4(c)所示。

圖4 PS微球的介電泳響應(yīng)Fig.4 Electrophoretic response of PS microspheres

結(jié)果表明，在電導(dǎo)率較低的懸浮介質(zhì)中，PS微球在頻率1 kHz到10 MHz均表現(xiàn)出負(fù)介電泳行為，其中在1 MHz時(shí)，PS微球呈現(xiàn)向中心團(tuán)簇效果最佳，即負(fù)介電泳力效果最好。同時(shí)，在此實(shí)驗(yàn)中觀察到溶液電導(dǎo)率主要影響PS微球所受的介電泳力方向，而對(duì)其大小無顯著的影響。

2.2 交流信號(hào)電壓幅值對(duì)于匯聚效果的影響

由微粒所受介電泳力公式(1)可知，交流信號(hào)電壓的幅值直接決定了其所受介電泳力的大小。根據(jù)以上對(duì)頻率研究的基礎(chǔ)上，考察電壓幅值對(duì)PS微球富集的影響，對(duì)電極芯片上的低電導(dǎo)率PS懸浮液施加頻率為1 MHz的交流信號(hào)，記錄了幅值VP-P為3 V、9 V和14 V下PS微球的運(yùn)動(dòng)情況。

如圖5(a)所示當(dāng)正弦信號(hào)電壓VP-P為3 V時(shí)，PS微球受到負(fù)介電泳力向電極中心緩慢運(yùn)動(dòng)，最終到達(dá)中心成為團(tuán)簇狀態(tài)耗時(shí)達(dá)1 h以上；將正弦信號(hào)電壓幅值VP-P調(diào)整為9 V時(shí)，在CCD相機(jī)系統(tǒng)下觀察到當(dāng)電極接入信號(hào)瞬間，PS微球受到負(fù)介電泳力迅速向電極中心聚攏，由于相鄰的兩個(gè)電極間隙尺寸小，如圖5(b)所示該區(qū)域附近的PS微球優(yōu)先在這里成點(diǎn)線狀團(tuán)簇，而相對(duì)的兩個(gè)電極邊緣附近的PS微球要經(jīng)過15 min才能到達(dá)中心成富集狀態(tài)；當(dāng)調(diào)整電壓幅值VP-P為14 V時(shí)如圖6(c)所示，PS微球同樣向電極中心運(yùn)動(dòng)，但是速度比較慢，最終成團(tuán)簇狀態(tài)需要45 min.

圖5 不同交流信號(hào)電壓幅值下的富集效果Fig.5 Enrichment effect under different amplitude of AC signal voltage

如圖6所示，通過實(shí)驗(yàn)研究了1～16 V電壓值VP-P下PS微球呈現(xiàn)富集狀態(tài)所需要的時(shí)間。從圖中可以看出電壓幅值過大或者過小，PS微球在介質(zhì)溶液內(nèi)富集所需要的時(shí)間都比較久，而在電壓值VP-P為9 V附近用時(shí)較短僅為15 min.結(jié)果表明向低電導(dǎo)率PS微球懸浮液施加正弦信號(hào)頻率為1 MHz時(shí)，電壓幅值VP-P為9 V富集效果最佳。

圖6 在交流信號(hào)電壓幅值下PS微球最終呈富集狀態(tài)所需的時(shí)間Fig.6 Time required for PS microspheres to be enriched at the voltage amplitude of AC signal

2.3 在不同濃度的懸浮液中PS微球的富集實(shí)驗(yàn)

在獲得頻率和電壓的最佳參數(shù)后，本節(jié)研究了不同濃度PS懸浮液的介電泳響應(yīng)。將PS微球與去離子水配制成一定濃度范圍懸浮液，并調(diào)節(jié)電導(dǎo)率為1 μS/cm.對(duì)于極低濃度的分析物溶液，在CCD相機(jī)系統(tǒng)下不易觀察到PS微球的富集情況，所以配制的分析物溶液濃度應(yīng)大于105 mL-1(0.16 amol/mL).本文研究主要為后續(xù)研究傳感器對(duì)超低濃度分析物的檢測(cè)限奠定基礎(chǔ)，而高濃度的分析物溶液已具有較強(qiáng)的傳感器響應(yīng)信號(hào)，不需要進(jìn)一步聚集，因此本文未對(duì)高濃度PS微球溶液(大于2.08amol/mL)的介電泳效應(yīng)進(jìn)行分析。因文章篇幅限制，本文展示了2.08 amol/mL、1.19 amol/mL和0.33 amol/mL這3種濃度下的PS微球懸浮液的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，如圖7-圖9所示。

采用移液槍將少量濃度為2.08 amol/mL懸浮液注入到電極上，PS微球均勻的分散在電極中心和間隙中如圖7(a)所示。施加電壓峰值VP-P為9 V、頻率為1 MHz的正弦信號(hào)，5 min后電極邊緣的PS微球受到負(fù)介電泳力呈現(xiàn)向電極中心運(yùn)動(dòng)的趨勢(shì)如圖7(b)所示，兩相鄰電極間最先出現(xiàn)PS團(tuán)簇成點(diǎn)線狀，中心富集不明顯。保持正弦信號(hào)接入到電極上，如圖7(c)觀察到15 min時(shí)PS微球匯聚成點(diǎn)線狀，并呈現(xiàn)成星形團(tuán)簇狀態(tài)富集在電極中心。繼續(xù)施加信號(hào)，觀察到由于微粒間相互作用以及蒸發(fā)導(dǎo)致的溶液量減少使得微粒運(yùn)動(dòng)緩慢最終停止向中心移動(dòng)，最終在芯片電極上PS微球富集成星形狀。

圖7 交流信號(hào)頻率為1 MHz、電壓幅值為9 V，濃度為2.08 amol/mL的PS微球懸浮液在星形電極中心的富集Fig.7 Enrichment of PS microsphere suspension at the center of star electrode with AC signal frequency of 1 MHz, voltage amplitude of 9 V and concentration of 2.08 amol/mL

圖8 交流信號(hào)頻率為1 MHz、電壓幅值為9 V，濃度為1.19 amol/mL的PS微球懸浮液在星形電極中心的富集Fig.8 Enrichment of PS microsphere suspension at the center of star electrode with AC signal frequency of 1 MHz, voltage amplitude of 9 V and concentration of 1.19 amol/mL

當(dāng)降低濃度為1.19 amol/mL時(shí)，施加相同的正弦信號(hào)同樣可以觀察到此富集過程(如圖8所示)。對(duì)于更低濃度的PS微球懸浮液(0.33 amol/mL)，也可以觀察到類似的現(xiàn)象(如圖9所示)。結(jié)果表明在實(shí)驗(yàn)條件相同的情況下，濃度范圍在0.33～2.08 amol/mL的PS微球溶液表現(xiàn)出相似的富集效果。

圖9 交流信號(hào)頻率為1 MHz、電壓幅值為9 V，濃度為0.33 amol/mL的PS微球懸浮液在星形電極中心的富集Fig.9 Enrichment of PS microsphere suspension at the center of star electrode with AC signal frequency of 1 MHz, voltage amplitude of 9 V and concentration of 0.33 amol/mL

3 結(jié)論

本文設(shè)計(jì)并制作了介電泳星形電極芯片，從實(shí)驗(yàn)上分析了介質(zhì)溶液內(nèi)微粒的富集運(yùn)動(dòng)。通過分析臨界頻率確定低電導(dǎo)率的PS微球懸浮液在1 kHz到10 MHz表現(xiàn)負(fù)介電泳響應(yīng)，驗(yàn)證了在1 MHz時(shí)負(fù)介電泳力效果最好。當(dāng)施加交流信號(hào)電壓幅值VP-P為9 V、頻率為1 MHz時(shí)，濃度范圍在0.33～2.08 amol/mL的樣品懸浮液注入到電極上，PS微球在15 min內(nèi)可以富集到電極中心。在關(guān)閉交流信號(hào)后，PS微球維持富集狀態(tài)，為下一步的樣品分析奠定基礎(chǔ)。本文通過分析電導(dǎo)率、電場(chǎng)頻率、幅值信號(hào)對(duì)PS微球介電泳運(yùn)動(dòng)的影響，得到了實(shí)現(xiàn)最佳富集效果的實(shí)驗(yàn)條件，在生物醫(yī)藥工程中具有廣闊的應(yīng)用前景。