裴玉瓊,徐墜成,王艷天,顧欣,盛先杰,徐藝,繆志偉

(1.南京中醫(yī)藥大學藥學院,江蘇 南京 210023;2.南京中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院,江蘇 南京 210029;3.南京中醫(yī)藥大學附屬張家港醫(yī)院,江蘇 張家港 215600)

地榆SanguisorbaofficinalisL.為薔薇科植物的干燥根,具有涼血止血,解毒斂瘡等功效[1]。地榆及其復方制劑應用廣泛,臨床多于治療便血、痔血、血痢、燒傷、燙傷和慢性腸道感染[2-4]。地榆化學成分豐富,主要含酚類、黃酮類、三萜類等化合物[5-6]。地榆中的地榆皂苷Ⅰ、地榆皂苷Ⅱ等具有較好的抗炎和抗癌作用,而鞣花酸、沒食子酸、兒茶素及其衍生物等可用于抗感染、抑菌、抗氧化、抗皺、抗過敏和神經保護等[7-9]。

全面闡釋中藥活性成分在體內的代謝情況對中藥藥效物質基礎研究極為重要[10]。超高效液相色譜-四極桿串聯(lián)飛行時間質譜(UHPLC-Q-TOF/MS)技術是目前對樣品進行快速定性和半定量分析的常用方法之一,具有高靈敏度、高分離能力和高效率的顯著優(yōu)勢。中藥藥源性成分繁多,在生物樣品中含量較低,加之內源性物質和基質帶來的干擾,給生物樣本里中藥成分的分析帶來困難。因此,應用先進的液質聯(lián)用技術,排除干擾后還可以捕捉到眾多低含量組分的二級質譜信息,從而鑒定到更多的代謝產物,對代謝途徑的正確推測也提供了幫助[11]。

目前文獻中僅見地榆水提物在化學成分群中的研究[5],缺少地榆，尤其是鞣質類成分在體內代謝過程的研究。因此,本研究擬對地榆水提物體內代謝產物進行全面分析,以期為進一步解析地榆體內代謝過程,闡明其藥效物質基礎提供實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

Triple TOF 5600TM質譜儀(美國AB SCIEX公司);Prominence LC-20A超快速高效液相色譜儀(日本Shimadzu公司);Milli-Q超純水機(美國Millipore公司);Speed Vac離心濃縮儀(美國Thermo Scientific公司);電熱恒溫鼓風干燥箱(上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司)。

1.2 藥材與試劑

對照品沒食子酸(批號:18032703),地榆皂苷Ⅰ(批號:18030201),地榆皂苷Ⅱ(批號:RFS-D0231),兒茶素(批號:154-23-4),山柰酚(批號:520-18-3)購自成都瑞芬思生物科技有限公司。對照品鞣花酸(批號:E102710)購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。對照品尿石素A(批號:APN698)購自上海畢得醫(yī)藥科技股份有限公司。對照品尿石素B(批號:B28N9D76184)購自上海源葉生物科技有限公司。對照品槲皮素(批號:10081-9905)購自中國藥品生物制品檢定所。所有對照品純度均≥98%。地榆藥材(批號:18101501)購自汕頭市粵東藥業(yè)有限公司。甲醇、乙腈(色譜純,德國Merk公司),甲酸(色譜純,阿拉丁試劑有限公司),水(色譜純,美國Millipore公司)。

1.3 動物

SD大鼠,雄性,SPF級,體質量180～220 g,購自南京市江寧區(qū)青龍山動物繁殖場,許可證號:SYXK(蘇)2018-0049,動物合格證編號:201931580。飼養(yǎng)于SPF環(huán)境,自由飲水、進食,室內溫度(22±2)℃,濕度(50±5)%,12 h/12 h晝夜循環(huán)。本實驗符合《江蘇省實驗動物管理條例》中實驗動物倫理道德的相關規(guī)定,動物實驗倫理審查表號:AEWC-20201201。

2 方法

2.1 地榆水提物和對照品溶液的制備

取地榆藥材100 g,水煎煮2次,每次1 h,第1次10倍體積水,第2次8倍體積水。合并煎液過濾,濾液70 ℃減壓濃縮至生藥量為1 g·mL-1。取200 μL加入800 μL超純水混勻,渦旋3 min,通過固相萃取(SPE)小柱(美國Waters公司)進行分離純化,將濾液收集揮干后,加入200 μL甲醇,渦旋3 min,4 ℃、12 000 r·min-1離心10 min,取上清為地榆水提物供試液。

分別精密稱取沒食子酸、地榆皂苷Ⅰ、地榆皂苷Ⅱ、鞣花酸、尿石素A、尿石素B、兒茶素、山柰酚和槲皮素對照品適量,以甲醇溶液配制成質量濃度都為200.0 ng·mL-1的對照品混合溶液。

2.2 動物給藥與樣品采集

將12只SD大鼠飼養(yǎng)于代謝籠中,分為空白組與給藥組,每組6只。實驗前禁食12 h,期間自由飲水,為了尋找更多的代謝產物,按照人劑量的2倍[1],給藥組灌胃地榆水提物3 g·kg-1(生藥量);空白組灌胃等量的生理鹽水。于給藥后0、0.5、1、2、4、6、8、12 h眼眶取血于肝素鈉處理的EP管中,4 000 r·min-1離心10 min,取上清,即得血漿樣品。將大鼠置于代謝籠中，收集24 h尿液和糞便。以上樣品均于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 生物樣品前處理

血漿樣本供試液制備:將不同時間點血漿等體積混合均勻后,取600 μL混合后的血漿加入2.4 mL超純水稀釋,通過C18SPE小柱(美國Waters公司)進行分離、富集,將濾液收集揮干,加入200 μL甲醇,渦旋3 min,4 ℃、12 000 r·min-1離心10 min,取上清液為血漿樣本供試液。

尿液樣本供試液制備:取1.5 mL尿液加入1.5 mL超純水,渦旋3 min,通過C18SPE小柱(美國Waters公司)進行分離純化,將濾液收集揮干,加入200 μL甲醇,渦旋3 min,4 ℃、12 000 r·min-1離心10 min,取上清液為尿液樣本供試液。

糞便樣本供試液制備:糞便于40 ℃下恒溫干燥后稱取0.3 g,加入3 mL乙腈-甲醇-水(體積比5∶3∶2),超聲30 min,4 ℃、12 000 r·min-1離心10 min,取上清液揮干,加入3 mL超純水復溶,渦旋3 min,通過C18SPE小柱(美國Waters公司)進行分離純化,將濾液收集揮干,加入200 μL甲醇,渦旋3 min,4 ℃、12 000 r·min-1離心10 min,取上清液為糞便樣本供試液。

2.4 色譜條件

色譜柱:Thermo AcclaimTMRSLC 120 C18柱(3.0 mm×100 mm,2.2 μm),柱溫:40 ℃,流動相A:0.1%甲酸水,流動相B:乙腈。流速:0.4 mL·min-1,進樣量:3 μL。梯度洗脫程序:0～3 min,10%B;3～18 min,10%～90%B;18～25 min,90%B;25～28 min,90%～10%B;28～30 min,10%B。

2.5 質譜條件

采用正、負離子檢測模式,掃描范圍為m/z50～1 500,電噴霧離子源(ESI),離子源溫度(TEM):550 ℃;氣簾氣(CUR):40 psi(1 psi=6.89 kPa);霧化器(GS1):55 psi;輔助加熱器(GS2):55 psi;離子源噴霧電壓(IS):5 500 V/-5 500 V;碰撞電壓(CE):40 V/-40 V;去簇電壓(DP):100 V/-100 V。

2.6 數(shù)據(jù)處理

通過文獻建立地榆化學成分數(shù)據(jù)庫,使用MetabiolitePilotTM和Peakview 1.2進行數(shù)據(jù)處理。

3 結果

3.1 地榆水提物化學成分及其質譜裂解規(guī)律解析

通過查閱國內外文獻[3,12-13],鑒定了地榆中45個化學成分,包括33個酚類成分、8個三萜類成分及3個黃酮類成分和1個單萜烯醇苷,其中7個化合物通過與對照品的保留時間及其裂解碎片比較得到進一步確認，詳見圖1和表1。

注:*表示化合物與對照品確認。圖1 地榆水提物和對照品在正、負離子模式下的基峰離子色譜

表1 地榆水提物化學成分鑒定

(續(xù)表)

注:*表示化合物與對照品確認。

地榆水提物在正、負離子模式下進行UHPLC-Q-TOF/MS分析,發(fā)現(xiàn)地榆皂苷Ⅰ、地榆皂苷Ⅱ和地榆皂苷Ⅲ只在負離子模式下能被檢測到碎片離子,MS/MS譜圖和碎片路徑如圖2所示[4，8]。與對照品相比，地榆皂苷Ⅰ的母離子為m/z765.444 5[M-H]-(C41H66O13)和m/z811.449 9[M+HCOO]-(C41H66O13)。[M-H]-很容易消除1個葡萄糖(Glu)產生碎片離子m/z603.389 0[M-H-C6H10O5]-(C35H56O8)，它可以通過H2O的中性丟失進一步在m/z585.380 2[M-H-C6H10O5-H2O]-(C35H54O7)處生成碎片離子。對于地榆皂苷Ⅱ，母離子為m/z603.390 8[M-H]-(C35H56O8)，碎片離子m/z585.379 8[M-H-H2O]-(C35H54O7)是由母離子H2O中性丟失產生的。此外，還可以清楚地觀察到地榆皂苷Ⅲ的母離子為m/z633.399 2[M-H]-(C36H58O9)和m/z679.404 6[M+HCOO]-(C36H58O9)，丟失1個Glu后產生碎片離子m/z471.355 1[M-H-C6H10O5]-(C30H47O4)，而碎片離子m/z453.335 0[M-H-C6H10O5-H2O]-(C30H45O3)是進一步H2O中性丟失產生的。三萜類化合物極易發(fā)生中性小分子碎片(H2O)丟失。

圖2 地榆皂苷Ⅰ(A)、地榆皂苷Ⅱ(B)和地榆皂苷Ⅲ(C)的MS/MS

3.2 血漿、尿液及糞便的代謝產物分析

運用MetabiolitePilotTM2.0軟件導入原型成分結構,并將空白組和給藥組樣本進行代謝產物鑒定篩選。通過對比空白組和給藥組樣品色譜峰的保留時間及質譜數(shù)據(jù),運用Peakview 1.2軟件結合對照品、參考文獻及地榆化學成分的質譜裂解規(guī)律,對地榆體內代謝產物進行了鑒定。原型成分及代謝產物具體信息見表2。從大鼠血清、尿液及糞便中共檢測出69個外源性成分，包括24個原型成分和45個代謝產物。其中24個原型成分包括16個酚類成分、7個三萜類成分及1個單萜烯醇苷。地榆在大鼠體內的代謝途徑主要包括還原、甲基化、脫水、氧化、硫酸化及葡萄糖醛酸結合等。

3.2.1 酚類及其代謝產物的鑒定 從正、負總離子流圖的化合物分析可知,地榆水提物的主要成分為酚類化合物。在給藥組生物樣品中檢測到沒食子酸、沒食子兒茶素、表兒茶素、兒茶素等16種酚酸類原型成分。原型成分中未檢測到鞣花酸，可能是因為其本身為多酚類化合物,而多酚類化合物較難吸收入體內，容易在胃腸道被內源性物質代謝為尿石素A、尿石素C、尿石素D等,其代謝產物主要發(fā)生甲基化和葡萄糖醛酸化等反應。

以鞣花酸代謝途徑為例,詳見圖3。代謝產物C2的母離子為m/z169.015 0[M-H]-(C7H6O5),碎片離子m/z125.025 1是由其脫去1分子羧基得到的,與對照品匹配誤差較小,故推測代謝產物C2為沒食子酸。代謝產物C25-10的母離子m/z315.014 5[M-H]-(C15H8O8)與鞣花酸母離子m/z300.998 7[M-H]-(C14H6O8)相差14,故推測C25-10有可能為鞣花酸甲基化得到的產物。代謝產物C25-9的母離子m/z275.020 1[M-H]-(C13H8O7),通過文獻對比[14]和碎片離子信息匹配,證實其為尿石素M5。代謝產物C25-7m/z259.025 6[M-H]-(C13H8O6)與尿石素M5母離子275.020 1[M-H]-(C13H8O7)相差16,推測代謝產物C25-7可能是尿石素M5在C環(huán)上損失1分子羥基得到的,其碎片離子信息與文獻對比[14]一致,鑒定其為尿石素D。代謝產物C25-8m/z261.040 7[M-H]-(C13H10O6)與尿石素D母離子相差2,鑒定其可能為尿石素D還原反應的代謝產物。代謝產物C25-5m/z243.030 4[M-H]-(C13H8O5)與尿石素D母離子相差16,推測代謝產物C25-5可能是尿石素D在A環(huán)上損失1分子羥基得到的,其碎片離子信息與文獻[14]對比一致,鑒定其為尿石素C。代謝產物C25-6m/z241.014 6[M-H]-(C13H10O6)與尿石素C相差2,推測C25-6可能為尿石素C氧化反應的代謝產物。代謝產物C25-1m/z227.035 5[M-H]-(C13H8O4)與尿石素C母離子m/z243.030 4[M-H]-(C13H8O5)相差16,推測代謝產物C25-1可能是尿石素C損失1分子羥基得到的,通過與文獻[14]中碎片離子信息比對,鑒定其為尿石素A。而代謝產物C25-2m/z306.991 7[M-H]-(C13H8O7S)、C25-3m/z241.052 0[M-H]-(C14H10O4)和C25-4m/z403.067 0[M-H]-(C19H16O10)結合已知文獻報道[14]的代謝產物結構分析,最終被推測為甲基化硫酸化尿石素A、甲基化尿石素A和葡萄糖醛酸化尿石素A。

表2 血漿、尿液和糞便中原型成分和代謝產物的鑒定

(續(xù)表一)

(續(xù)表二)

3.2.2 三萜皂苷類及其代謝產物鑒定 皂苷原型成分口服給藥后往往吸收較差，其體內代謝通常經由胃腸道的水解和吸收入血后肝臟的代謝兩步完成[15]。本實驗以地榆皂苷Ⅰ代謝途徑為例,詳見圖4。地榆皂苷Ⅰ的母離子m/z765.444 2[M-H]-(C41H66O13)，碎片離子m/z603.389 2[M-H-C6H10O5]-(C35H56O8)為母離子消除1個Glu所產生。代謝產物C39-1m/z603.388 2[M-H]-(C35H56O8)與地榆皂苷Ⅰ的母離子相差162,且存在碎片離子m/z585.380 7[M-H-H2O]-,誤差較小,故推測代謝產物C39-1為地榆皂苷Ⅰ丟失1分子Glu的代謝產物。代謝產物C39-2m/z471.346 3[M-H]-(C30H48O4)與地榆皂苷Ⅰ的母離子相差294,推測其為脫去1分子Glu和1分子阿拉伯糖(Ara)的代謝產物,碎片離子m/z453.335 6[M-H-H2O]-為H2O中性丟失產生。代謝產物C39-3m/z669.375 8[M+Cl]-(C36H58O9)與地榆皂苷Ⅰ的母離子相差132,推測其為脫去1分子Ara所得，該代謝物的主要2個碎片離子m/z471.347 7[M+Cl-C6H10O5-2H2O]-、m/z453.339 1[M+Cl-C6H10O5-3H2O]-推測是分別通過丟失1分子Glu和進而丟失H2O產生的。代謝產物C39-4m/z469.330 2[M-H]-(C30H46O4)與地榆皂苷Ⅰ的母離子相差296,推測丟失1分子Glu、1分子Ara和2個氫離子,碎片離子m/z451.320 8[M-H-H2O]-,m/z407.330 7[M-H-H2O-CO2]-分別為H2O中性丟失和繼而丟失1分子CO2所致。代謝產物C39-5m/z455.348 9[M-H]-(C30H48O3)與地榆皂苷Ⅰ的母離子相差310,推測為丟失1分子Glu、1分子Ara和水合脫氧產物,碎片離子m/z437.336 0[M-H-H2O]-為H2O中性丟失產生。地榆皂苷Ⅰ的代謝產物都會發(fā)生中性小分子碎片(H2O)丟失,這可能是因為三萜類化合物的母核在體內被氧化時,在碎裂過程中會出現(xiàn)額外的脫水現(xiàn)象,脫水部位形成雙鍵,從而改變了原型中的特征離子[16]。去阿拉伯糖基化和去葡萄糖基化是地榆皂苷Ⅰ的主要代謝途徑。

圖3 鞣花酸化合物的代謝途徑

圖4 地榆皂苷Ⅰ的代謝途徑

4 討論

本研究采用UHPLC-Q-TOF/MS技術,在灌胃給予地榆水提物后,從大鼠血清、尿液及糞便中共鑒定出69個外源性成分,包括24個原型成分和45個代謝產物。其中24個原型成分包括16個酚類成分、7個三萜類成分及1個單萜烯醇苷,分別為沒食子酸、沒食子兒茶素、原花青素B3、兒茶素、表兒茶素、短葉蘇木酚酸、地榆皂苷Ⅰ、地榆皂苷Ⅱ、地榆皂苷Ⅲ、坡模醇酸等。在45個代謝產物中,有33個來源于酚類成分,6個來源于三萜類成分和6個來源于黃酮類成分。由此可初步判斷,地榆水提物發(fā)揮藥效成分的物質基礎主要來源于酚類成分。有研究表明[17],鞣花酸及其代謝產物尿石素可有效改善腸道微生物菌群，預防或抑制腸道疾病的發(fā)生發(fā)展。鞣花酸及尿石素的作用主要包括抗氧化、抗炎及微生物菌群調控等[18]。我們在皂苷類及其代謝產物鑒定中,發(fā)現(xiàn)地榆皂苷Ⅰ的代謝產物都會發(fā)生中性小分子碎片(如H2O)丟失,其主要代謝途徑為去阿拉伯糖基化和去葡萄糖基化。

在這69個外源性成分中,有22個可在血漿中被檢測到,12個可在尿液中被檢測到,62個可在糞便中被檢測到。其中,在血漿中能夠被測到的主要為沒食子酸鞣質類成分及其代謝產物,而三萜類成分因吸收較差而較少有血漿暴露。結果表明,糞便排泄是地榆水提物主要的排泄途徑,部分原型成分和代謝產物尚未進入血液循環(huán)就通過糞便被排出體外。例如,在地榆水提物中可以檢測到鞣花酸的存在,但是在大鼠血清、尿液及糞便中均未檢測到鞣花酸,可能是因為其本身為多酚類化合物,而多酚類化合物較難吸收入體內,容易被內源性物質代謝為尿石素類化合物。也可能是因為鞣花酸濃度太低,低于檢測限。

結果表明,地榆水提物在大鼠體內的代謝途徑主要包括還原、甲基化、脫水、氧化、硫酸化及葡萄糖醛酸結合等反應。本研究首次利用UHPLC-Q-TOF/MS技術對地榆水提物化學成分及其代謝產物進行系統(tǒng)性研究,為闡明其藥效物質基礎提供實驗依據(jù)。