連紫宇,朱磊,劉亞軍,胡靜怡,程成,沈洪

(南京中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院,江蘇 南京 210029)

潰瘍性結腸炎(Ulcerative colitis,UC)是一種慢性腸道炎癥,當前研究表明其發(fā)病機制與機體遺傳易感性和外界因素引起的免疫功能紊亂有關[1]。中醫(yī)證候研究是中醫(yī)現代化的關鍵環(huán)節(jié),證候的準確辨識是臨床論治有效的前提[2],因此,建立客觀的證候診斷標準,對于提高中醫(yī)的臨床診療水平具有重要的意義。

素體脾胃虛弱是UC的發(fā)病基礎,且脾虛證候的演變和轉歸影響著疾病的發(fā)生、發(fā)展過程,但目前UC脾氣虛證的研究仍然存在診斷標準不統(tǒng)一、主觀指標過多、辨證方法單一、生物學內涵不清、可操作性差等不足,阻礙了中醫(yī)證候研究的規(guī)范化和現代化,因此深入研究UC脾虛證的生物學本質,探索其生物學基礎對于該病的早期預防和治療意義重大。UC以活動期和緩解期反復交替發(fā)作為主要特征，當前研究認為UC活動期以濕熱蘊腸為主要病機，緩解期以脾氣虛弱為主要病機，濕熱證和脾虛證是UC臨床最常見的證候，因此本研究將UC濕熱證和脾氣虛證進行比較，觀察UC脾氣虛證的特征性表現。

代謝組學是20世紀90年代末發(fā)展起來的一項研究手段,能夠定量化、動態(tài)化分析機體內源性小分子代謝物的變化。生理條件下機體代謝處于動態(tài)平衡中,當受到病理因素影響時機體內代謝產物水平出現異常變化,代謝穩(wěn)態(tài)被破壞并影響疾病的發(fā)生發(fā)展。已有研究發(fā)現UC患者的氨基酸代謝、脂質代謝與健康人存在差異,表明代謝紊亂與UC的發(fā)生發(fā)展有關[3]。此外,脾為氣血生化之源,具有消化食物運送水谷精微至全身的作用?，F代醫(yī)學認為,機體通過物質代謝從外界攝取營養(yǎng)物質,同時經過體內分解吸收將其中蘊藏的化學能釋放出來，轉化為組織和細胞可以利用的能量以維持生命活動。因此有學者提出,中醫(yī)理論中脾主運化、主升清、化生氣血的功能與現代醫(yī)學描述的生物體代謝過程極為相似[4]。為了探索UC脾氣虛證與代謝改變的內在關聯，本研究以UC脾氣虛證患者為研究對象，以健康對照人群和UC濕熱證為對照，利用代謝組學技術表征UC脾氣虛證，以探索UC脾氣虛證的生物學本質。

1 臨床資料

1.1 一般資料

收集2020年5月至2020年12月于江蘇省中醫(yī)院就診的UC患者61例,其中辨證為脾氣虛證者31例,辨證為濕熱證者30例,同時收集于江蘇省中醫(yī)院進行體檢的健康對照組27例。本研究已通過江蘇省中醫(yī)院倫理委員會審查批準(批件號:2019NL-097-04)。如表1所示,3組患者性別、年齡未發(fā)現統(tǒng)計學差異,基線具有一致性。

表1 2組基線資料比較

1.2 診斷標準

1.2.1 西醫(yī)診斷標準 潰瘍性結腸炎參照《炎癥性腸病診斷與治療的共識意見(2018年 北京)》[5]診斷標準,結合臨床表現、實驗室檢查、影像學檢查、內鏡和組織病理學表現進行綜合分析,在排除感染性和其他非感染性結腸炎的基礎上做出診斷。

1.2.2 中醫(yī)辨證標準 參照國家中醫(yī)藥管理局發(fā)布的《中醫(yī)病證診斷療效標準》[6]、中華中醫(yī)藥學會發(fā)布的《中醫(yī)內科常見病診療指南》[7]和《潰瘍性結腸炎中醫(yī)診療專家共識意見(2017)》[8]中脾氣虛證、濕熱證辨證標準,由2名接受過嚴格培訓的副高以上中醫(yī)師辨證。

UC脾氣虛證。主癥:①黏液膿血便,白多赤少,或為白凍;②腹瀉便溏,夾有不消化食物;③脘腹脹滿。次癥:①腹部隱痛;②肢體困倦;③食少納差;④神疲懶言。舌脈:①舌質淡紅,邊有齒痕,苔薄白膩;②脈細弱或細滑。

UC濕熱證。主癥:①腹瀉,便下黏液膿血;②腹痛;③里急后重。次癥:①肛門灼熱;②腹脹;③小便短赤;④口干;⑤口苦。舌脈:①舌質紅,苔黃膩;②脈滑。

1.3 納入標準

1.3.1 潰瘍性結腸炎受試者 ①符合潰瘍性結腸炎西醫(yī)診斷標準;②中醫(yī)辨證為濕熱證或脾氣虛證;③年齡在18～70歲之間;④患者知情并簽署知情同意書。

1.3.2 健康受試者 ①在本院體檢的健康志愿者;②年齡在18～70歲之間,性別不限;③體格檢查,血白細胞計數,谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)、血尿素氮(BUN)、肌酐(Cr),心電圖、胸片檢查均在正常范圍;④知情同意,自愿受試,獲得知情同意書過程應符合倫理原則。

1.4 排除標準

1.4.1 潰瘍性結腸炎受試者 ①妊娠期、哺乳期婦女;②具有嚴重的原發(fā)性心、肝、肺、腎、造血系統(tǒng)等疾病;③由于智力或行為障礙不能給予充分知情同意者;④懷疑或確有酒精、藥物濫用病史;⑤原發(fā)性、繼發(fā)性感染性疾病患者,如膽囊炎,肺炎等。

1.4.2 健康受試者 ①糞常規(guī)檢查異常;②近1月內出現腹痛、腹瀉癥狀;③妊娠期、哺乳期婦女;④具有嚴重的原發(fā)性心、肝、肺、腎、造血系統(tǒng)等疾病;⑤由于智力或行為障礙不能給予充分知情同意者;⑥懷疑或確有酒精、藥物濫用病史;⑦具有原發(fā)性、繼發(fā)性感染性疾病患者,如膽囊炎、肺炎等;⑧具有炎癥性腸病家族史者。

2 方法

2.1 血清樣本采集

受試者空腹肘靜脈采血3 mL于采血管中,室溫靜置2 h,待樣本分層后吸取上清至新的EP管中,3 000 r·min-1,4 ℃條件下離心20 min,吸取上清置于新的EP管中,-80 ℃條件下保存。

2.2 樣本前處理

取50 μL離心后的血清于1.5 mL RNAfree EP管中,加入550 μL色譜級甲醇,充分震蕩15～20 min;15 000 r·min-1,4 ℃條件下離心10 min,吸取500 μL上清于新的1.5 mL RNAfree EP管中;真空、室溫條件下揮干液體,觀察管底部沉淀;管中加入100 μL色譜級甲醇復溶,18 000 r·min-1,4 ℃條件下離心10 min,吸取上清于新的1.5 mL RNAfree EP管中,后再次18 000 r·min-1,4 ℃條件下離心10 min,吸取60 μL上清于進樣管中待測[9]。

2.3 色譜質譜條件

色譜條件:采用UPLC/MS SYNAPT G2-Si配有Waters ACQUITY UPLC H-Class液相色譜系統(tǒng)進行色譜分析,色譜柱采用Waters Atlantis T3柱(100 mm×2.1 mm×1.8 μm),流動相A為60%乙腈(含有0.1%甲酸),流動相B為90%異丙醇(含有0.1%甲酸),設置流速為0.4 mL·min-1,柱溫為55 ℃。采用梯度洗脫以進行色譜分離,梯度洗脫條件如下:0～2 min,60%A;2～2.1 min,57%A;2.1～12 min,50%A;12～12.1 min,60%A;12.1～18 min,60%A;18～18.1 min,60%A;18.1～20 min,60%A。

質譜條件:采用電子噴霧離子源,正離子模式檢測,掃描采用Sensitivity模式,數據采集采用IDA模式,掃描范圍為m/z350～1 000。具體質譜參數如下:質量范圍50～1 200;掃描時間0.15 s;碰撞電壓20～50 V;碰撞能量40 V。采用Lock Sray進行自動校準。

2.4 代謝物鑒定

將質譜分析所得數據導入Progenesis QI(Waters,Milford,USA)工作站中,用內標將所得數據進行校正,得到一個包含前體離子m/z并保留時間和峰面積的多元數據矩陣。將包含前體離子m/z、保留時間和峰面積的多元數據矩陣與Human Metabolome Database數據庫(https://hmdb.ca/textquery)和Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes數據庫(https://www.kegg.jp/)進行比配鑒定,軟件自動給出樣品中化合物的鑒定結果。導入EZinfo數據處理軟件中進行偏最小二乘判別分析,將Max fold change>2的候選化合物通過提取離子色譜峰并手動檢查后,剔除假陽性結果。篩選Abundance>1 000,P<0.05的化合物,并且手動剔除無碎片匹配或碎片匹配不合理的化合物,對篩選出的化合物進行匹配鑒定和含量分析。

2.5 統(tǒng)計學方法

3 結果

3.1 疾病特征比較

2組間病程、病變范圍、血沉未發(fā)現統(tǒng)計學差異,UC脾氣虛證組C反應蛋白、糞鈣衛(wèi)蛋白水平低于UC濕熱證組,但差異無統(tǒng)計學意義。見表2。

表2 疾病特征

3.2 PLS-DA分析

結果如圖1所示,3組間具有一定的差異性。

注:HC.健康對照組;PX.UC脾氣虛證組;SR.UC濕熱證組圖1 潰瘍性結腸炎患者血清代謝物PLS-DA分析

3.3 差異代謝物篩選與鑒定

將健康對照、UC濕熱證、UC脾氣虛證3組血清代謝物豐度Top40進行熱圖分析,如圖2所示,3組間代謝物分布差異明顯,與健康組比較,UC患者血清中磷酸膽堿、溶血磷脂、硬脂酰胺、尿酸等代謝物豐度升高,進一步不同證候間比較發(fā)現,UC脾氣虛證患者血清中上述代謝物豐度均低于UC濕熱證者。

3.4 潰瘍性結腸炎脾氣虛證與濕熱證患者血清差異代謝物

進一步分析3組間差異具有統(tǒng)計學意義的代謝產物,結果顯示,與健康對照組比較,UC脾氣虛證組1-油酰基甘油磷酸膽堿、溶血磷脂、鞘氨醇、N-棕櫚酰磷酸乙醇胺、棕櫚酰肉堿、O-花生四烯?？s水甘油、2-亞油酰甘油豐度升高,二十二碳三烯酸、棕櫚酰胺豐度降低,與UC濕熱證患者比較,上述代謝物中2-亞油酰甘油豐度在UC脾氣虛證組升高,其余代謝物豐度均降低,提示UC脾氣虛證的發(fā)生發(fā)展可能與上述代謝物豐度的變化有關。見圖3。

3.5 ROC曲線分析

采用ROC曲線評估血清代謝產物對于UC脾氣虛證的診斷價值，結果如圖4～5所示,O-花生四烯?？s水甘油、棕櫚酰胺、2-亞油酰甘油在UC脾氣虛證中ROC曲線下面積高于濕熱證,提示上述3種代謝物可能是診斷UC脾氣虛證的潛在指標。此外,多因素聯合診斷ROC曲線結果顯示,棕櫚酰胺和2-亞油酰甘油聯合診斷UC脾氣虛證效應優(yōu)于單因素診斷和其他組合的多因素診斷,提示棕櫚酰胺和2-亞油酰甘油聯合在診斷UC脾氣虛證方面具有一定潛力。見圖4～5。

4 討論

已有大量研究證實UC的發(fā)生發(fā)展與代謝紊亂密切相關,Scoville等[3]比較炎癥性腸病(IBD)患者和健康人的血清代謝產物,結果發(fā)現IBD患者體內與脂質代謝、氨基酸代謝和三羧酸循環(huán)相關的多種代謝物發(fā)生了顯著改變。本研究結果顯示,UC患者血清中1-油?；视土姿崮憠A、溶血磷脂、鞘氨醇、N-棕櫚酰磷酸乙醇胺、棕櫚酰肉堿、花生四烯酸甘油、2-亞油酰甘油等代謝產物豐度高于健康對照組,二十二碳三烯酸豐度低于健康對照組,提示UC患者存在脂質代謝紊亂,與文獻報道結果一致。

進一步比較UC脾氣虛證和濕熱證血清代謝產物差異,結果顯示,與UC濕熱證患者比較,UC脾氣虛證組血清中1-油?；视土姿崮憠A、溶血磷脂、鞘氨醇、棕櫚酰肉堿、O-花生四烯?？s水甘油等代謝產物豐度降低,2-亞油酰甘油豐度升高。1-油酰基甘油磷酸膽堿是一種溶血磷脂,溶血磷脂是一類具有較強表面活性的磷脂,能使紅細胞及其他細胞膜破裂,引起溶血或細胞壞死,生理條件下,體內磷脂酶的存在位置和數量受到嚴格控制,因此機體并不會受到傷害[10]。經過磷脂酶B作用脫去脂肪酸后,溶血磷脂轉變成甘油磷酸膽堿或甘油磷酸乙醇胺,即失去溶解細胞膜的作用[11]。

注:HC.健康對照組;PX.UC脾氣虛證組;SR.UC濕熱證組;與HC組比較,#P<0.05,##P<0.01;與PX組比較,*P<0.05,**P<0.01。圖3 潰瘍性結腸炎不同證型患者血清差異代謝物

注:A～C.O-花生四烯酰縮水甘油、棕櫚酰胺、2-亞油酰甘油在UC脾氣虛證中的ROC曲線圖;D～F.O-花生四烯?？s水甘油、棕櫚酰胺、2-亞油酰甘油在UC濕熱證中的ROC曲線圖圖4 差異代謝物的ROC曲線圖

注:1.O-花生四烯酰縮水甘油;2.棕櫚酰胺;3.2-亞油酰甘油圖5 多因素ROC曲線

研究發(fā)現,1-油?；视土姿崮憠A可以升高內皮細胞黏附分子和生長因子表達,促進單核細胞趨化,從而促進炎癥反應[12]。棕櫚酰肉堿是長鏈脂肪酸衍生物,可通過改變膜的流動性和表面電荷在脂肪酸氧化過程中促進長鏈脂肪酸從細胞質向線粒體的轉移,是脂肪酸跨線粒體內膜運輸并參與β氧化的重要介質[13]。二十二碳三烯酸屬于極長鏈多不飽和脂肪酸,可以降低IL-1β、IL-6、TNF-α等炎癥因子的表達以發(fā)揮抑制炎癥的作用[14]。本研究結果顯示，UC濕熱證患者血清中1-油?；视土姿崮憠A、肉桂酸、二十二碳三烯酸的豐度均高于脾氣虛證，提示濕熱證患者存在較為嚴重的炎癥反應。

ROC曲線結果顯示,O-花生四烯?？s水甘油、棕櫚酰胺、2-亞油酰甘油可能是診斷UC脾氣虛證的潛在生物標志物?；ㄉ南┧崾墙Y合和激活內源性大麻素受體1和2的內源性信號脂質,且內源性大麻素受體的激活具有改善結腸炎癥的作用,而機體內花生四烯酸和內源性大麻素受體的水平受到脂肪酸酰胺水解酶的調控。O-花生四烯?；s水甘油是脂肪酸酰胺水解酶的抑制劑[15],研究發(fā)現,脂肪酸酰胺水解酶抑制劑可緩解葡聚糖硫酸鈉(DSS)誘導的實驗性腸炎小鼠體質量減輕和炎癥反應[16],TNBS誘導的結腸炎大鼠體內脂肪酸酰胺水解酶缺乏或抑制可導致內源性花生四烯酸水平升高,促炎細胞因子水平降低[17]。2-亞油酰甘油是一種單酰基甘油酯,由甘油分子3個羥基中的1個羥基和2個脂肪酸酯化而成。目前研究較多的單酰基甘油酯為2-花生四烯酰甘油,2-花生四烯酰甘油是機體主要的內源性大麻素,是花生四烯酸的前體,通過作用于大麻素受體來調節(jié)突觸神經傳遞[18]。近年來2-亞油酰甘油在果蠅體內和小鼠腦、脾和腸道中被發(fā)現,并且有研究報道2-亞油酰甘油可以通過影響Akt和ERK激酶級聯劑量依賴性地抑制神經元分化[19]。棕櫚酰胺是來自棕櫚酸的初級脂肪酸酰胺,關于初級脂肪酸酰胺在生物體中的產生和降解機制至今尚未闡明,目前認為脂肪酸酰胺與內源性大麻素競爭結合酶的活性位點,并且可以增加內源性大麻素的濃度[20]。以上3種代謝產物都與內源性大麻素系統(tǒng)有關,內源性大麻素系統(tǒng)包括大麻素受體、內源性配體以及合成或降解酶類組成,具有調節(jié)神經系統(tǒng)、緩解疼痛、調節(jié)心血管功能的作用,已有研究證實,激活大麻素受體1和2可以緩解腸道炎癥,內源性大麻素系統(tǒng)發(fā)揮緩解腸道炎癥作用可能與調節(jié)胃腸道動力和內臟高敏感有關,本研究結果顯示O-花生四烯?？s水甘油、棕櫚酰胺和2-亞油酰甘油對UC脾氣虛證的診斷效能更高,提示UC脾氣虛證和濕熱證的微觀生物學基礎可能與內源性大麻素系統(tǒng)有關。

代謝組學以客觀化的數據闡釋了脾氣虛證患者代謝改變的輪廓和差異代謝物,提示UC脾氣虛證與脂質代謝紊亂有關。脾氣虛弱是UC發(fā)病的基礎,應用組學技術得出的客觀化、微觀化指標表征UC脾氣虛證有助于闡明其生物學本質,為疾病的早期預防和治療提供參考和證據支撐。

在后續(xù)研究中，可以進行多中心、大樣本的隨機對照研究,以獲得證據等級更高的臨床研究結果,并應用代謝組學、蛋白組學、宏基因組學等多組學方法,全面探究中醫(yī)證候的生物學本質,進一步推進中醫(yī)藥的現代化發(fā)展。