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        自噬相關(guān)基因Beclin1、LC3在妊娠期糖尿病患者胎盤組織表達(dá)及臨床意義

        2021-11-25 11:48:22王洪偉關(guān)紅瓊王茹黃曉妹
        疑難病雜志 2021年11期
        關(guān)鍵詞:陽性細(xì)胞胎盤胎兒

        王洪偉,關(guān)紅瓊,王茹,黃曉妹

        妊娠期糖尿病(gestational diabetes mellitus,GDM)是常見的妊娠期并發(fā)癥,隨著人們飲食、生活習(xí)慣的改變,GDM發(fā)病率有上升的趨勢[1]。GDM不僅增加了孕婦發(fā)生不良妊娠結(jié)局的風(fēng)險,同時也增加了孕婦妊娠后2型糖尿病和心血管疾病的發(fā)病風(fēng)險[2]。因此,研究與GDM發(fā)生有關(guān)機(jī)制具有重要的意義。自噬廣泛存在于各種生物細(xì)胞中,是細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)代謝的重要途徑,參與細(xì)胞生長分化、廢物清除及結(jié)構(gòu)重建等多種生理過程。自噬失調(diào)與多種疾病的發(fā)生發(fā)展有關(guān),研究表明,高糖水平可增強(qiáng)絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞的自噬[3]。Beclin1、微管相關(guān)蛋白輕鏈3(microtubule associated protein light chain3,LC3)是編碼自噬相關(guān)蛋白的重要基因[4-5],現(xiàn)檢測GDM患者胎盤組織Beclin1、LC3表達(dá)水平,并分析二者與GDM患者一般資料之間的關(guān)系,探討自噬在GDM發(fā)病機(jī)制中的可能作用,報道如下。

        1 資料與方法

        1.1 臨床資料 選取2019年4月—2021年2月在海南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院產(chǎn)科行剖宮產(chǎn)的GDM患者95例為研究對象(GDM組),年齡23~37(29.84±3.58)歲,孕周36~40(38.17±1.83)周。同期選取在醫(yī)院行剖宮產(chǎn)的正常妊娠孕婦95例為對照組,年齡21~38(29.27±4.31)歲,孕周36~41(38.62±2.01)周。2組孕婦均為單胎妊娠,年齡及孕周比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)(批號:[2019]倫審核第13號),受試者及家屬知情同意并簽署知情同意書。

        1.2 病例選擇標(biāo)準(zhǔn) GDM患者參照“妊娠合并糖尿病診治指南(2014)”[6]中關(guān)于GDM診斷標(biāo)準(zhǔn)確診。(1)納入標(biāo)準(zhǔn):①孕前無糖尿病,妊娠期為首次診斷;②既往無不良妊娠史;③臨床資料完整。(2)排除標(biāo)準(zhǔn):①合并腎病等其他妊娠期并發(fā)癥;②患有自身免疫性疾病;③合并甲狀腺、垂體等內(nèi)分泌疾病。

        1.3 觀察指標(biāo)與方法

        1.3.1 臨床資料收集:收集2組孕婦體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、空腹血糖(FPG)、空腹胰島素(FINS)水平,以及分娩時新生兒體質(zhì)量等資料。

        1.3.2 胎盤樣本處理:孕婦分娩后30 min內(nèi)獲取胎盤組織,稱取胎盤質(zhì)量。取胎盤母體面中央組織2 cm×2 cm×2 cm組織塊,生理鹽水漂洗,留取一部分保存至-80 ℃冰箱,其余用4%多聚甲醛固定12 h,梯度酒精脫水30 min,石蠟包埋。

        1.3.3 胎盤組織中Beclin1、LC3 mRNA表達(dá)檢測:采用實(shí)時熒光定量PCR(qRT-PCR)法檢測,以RNA提取試劑盒(天根生化科技北京有限公司)對胎盤組織中RNA進(jìn)行提取,檢測RNA濃度,將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA,之后進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng),反應(yīng)條件:預(yù)變性 95℃ 5 min,變性 95 ℃ 30 s,退火 60℃ 30 s,共40個循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參基因,引物由寶生物工程(大連)有限公司合成,引物序列見表1。采用2-ΔΔCt法計算Beclin1、LC3 mRNA的相對表達(dá)量。

        表1 胎盤組織中Beclin1、LC3 mRNA引物序列

        1.3.4 胎盤組織中Beclin1、LC3蛋白表達(dá)檢測:采用免疫組織化學(xué)法檢測,石蠟標(biāo)本進(jìn)行連續(xù)切片,二甲苯脫蠟,梯度酒精脫蠟至水,PBS清洗,抗原修復(fù),室溫封閉1 h。加入兔抗人Beclin1、LC3單抗(英國Abcam公司),4 ℃孵育過夜,加入山羊抗人IgG二抗(英國Abcam公司)(稀釋比1∶1 000),37 ℃孵育1 h,加入DAB染色試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)進(jìn)行染色,蘇木素復(fù)染,酸酒精短暫分化后,脫水、透明、封片。細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)黃色或棕色顆粒為陽性。采用免疫反應(yīng)積分(IRS)法對染色結(jié)果進(jìn)行半定量評分。陽性細(xì)胞百分比評分:無陽性細(xì)胞 0分,占比<25%記1分,25%≤占比≤50%記2分,50%<占比≤75%記3分,占比>75%記4分。陽性細(xì)胞染色強(qiáng)度評分:無染色0分,淺黃色1分,黃褐色2分,棕褐色3分。IRS=陽性細(xì)胞百分比評分×陽性細(xì)胞染色強(qiáng)度評分,以IRS≤3分為陰性,IRS>3分為陽性。

        1.3.5 妊娠結(jié)局:記錄孕婦和胎兒健康狀況,如發(fā)生產(chǎn)后出血、羊水過多、胎兒窘迫、巨大兒等為不良妊娠結(jié)局。

        2 結(jié) 果

        2.1 2組臨床資料和不良妊娠結(jié)局比較 與對照組比較,GDM組年齡、孕周差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),BMI、FPG、FINS、胎盤質(zhì)量、新生兒體質(zhì)量及產(chǎn)后出血、羊水過多、胎兒窘迫、巨大兒發(fā)生率均顯著升高(P<0.05),見表2。

        表2 GDM組與對照組臨床資料和不良妊娠結(jié)局比較

        2.2 2組胎盤組織Beclin1、LC3 mRNA表達(dá)水平比較 與對照組比較,GDM組胎盤組織Beclin1、LC3 mRNA表達(dá)水平均顯著升高(P<0.01),見表3。

        表3 GDM組與對照組胎盤組織Beclin1、LC3 mRNA表達(dá)水平比較

        2.3 2組胎盤組織Beclin1、LC3蛋白表達(dá)比較 Beclin1、LC3均在細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)。與對照組比較,GDM組胎盤組織Beclin1、LC3蛋白陽性表達(dá)率均顯著升高(P<0.01),見表4、圖1。

        圖1 對照組與GDM組胎盤組織Beclin1、LC3蛋白表達(dá)比較(免疫組織化學(xué)染色,×200)

        表4 GDM組與對照組胎盤組織中Beclin1、LC3蛋白表達(dá)比較 [例(%)]

        2.4 胎盤組織Beclin1、LC3蛋白表達(dá)在GDM患者不同臨床資料和不良妊娠結(jié)局中比較 Beclin1及LC3蛋白表達(dá)在GDM患者年齡、孕周、BMI比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);Beclin1及LC3蛋白陽性表達(dá)GDM患者FPG、FINS、胎盤質(zhì)量、新生兒體質(zhì)量及產(chǎn)后出血、羊水過多、胎兒窘迫、巨大兒發(fā)生率均高于Beclin1、LC3蛋白陰性表達(dá)GDM患者(P<0.05),見表5。

        表5 胎盤組織Beclin1、LC3蛋白表達(dá)在GDM患者不同臨床資料和不良妊娠結(jié)局中比較

        2.5 Logistic回歸分析影響GDM患者發(fā)生不良妊娠結(jié)局的危險因素 以GDM患者是否發(fā)生不良妊娠結(jié)局為因變量,排除年齡等混雜因素后,以胎盤組織Beclin1、LC3蛋白表達(dá)為自變量進(jìn)行多因素Logistic回歸分析,結(jié)果表明,胎盤組織Beclin1、LC3蛋白陽性表達(dá)是GDM患者發(fā)生不良妊娠結(jié)局的危險因素(P<0.01),見表6。

        表6 Logistic回歸分析影響GDM患者發(fā)生不良妊娠結(jié)局的危險因素

        3 討 論

        GDM是指孕婦妊娠期間首次發(fā)生或出現(xiàn)糖尿病,影響GDM發(fā)生的危險因素包括超重、肥胖、高齡、家族糖尿病史等[7]。正常妊娠過程中,母體會通過一系列的生理變化以滿足胎兒生長的需要,胰島素敏感性降低是重要的代謝適應(yīng),在妊娠后期,孕婦處于胰島素抵抗?fàn)顟B(tài),使血糖稍微升高,促進(jìn)葡萄糖通過胎盤運(yùn)輸,促進(jìn)胎兒的生長[8]。目前主要認(rèn)為胰島素抵抗和胰島β細(xì)胞功能障礙導(dǎo)致的糖耐量受損是引起GDM發(fā)生的主要原因[9-10]。本研究結(jié)果表明,GDM患者FPG、FINS均顯著高于正常妊娠孕婦。胎盤是母體與胎兒物質(zhì)交換的主要器官,GDM可導(dǎo)致胎盤細(xì)胞功能、血管發(fā)生異常,導(dǎo)致胎盤發(fā)生病理性變化,從而影響子宮內(nèi)胎兒的正常生長發(fā)育[11]。本研究結(jié)果表明,GDM患者胎盤質(zhì)量、新生兒體質(zhì)量及產(chǎn)后出血、羊水過多、胎兒窘迫、巨大兒發(fā)生率均顯著高于正常妊娠孕婦,提示GDM發(fā)生過程中胎盤形成異常,可能會導(dǎo)致不良妊娠結(jié)局的發(fā)生,具體機(jī)制有待深入研究。

        自噬是在缺氧、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、氧化還原應(yīng)激等狀態(tài)下,維持細(xì)胞內(nèi)能量穩(wěn)態(tài)的過程,自噬失調(diào)與包括糖尿病在內(nèi)的代謝性疾病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[12]。Akcora等[13]研究表明,與正常妊娠孕婦比較,子癇前期孕婦自噬活性增加。Tu等[14]研究表明,抑制自噬能夠減輕糖尿病腎病大鼠的胰島素抵抗。Beclin1、LC3蛋白均是自噬的標(biāo)志性蛋白,Beclin1基因位于人染色體17q21,其編碼的Beclin1蛋白是自噬發(fā)生與調(diào)控的主要蛋白之一,其通過調(diào)節(jié)自噬前體的形成,引導(dǎo)相關(guān)蛋白定位于自噬體膜,其還可以調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬與凋亡之間的平衡[15-16]。LC3定位于前自噬泡和自噬泡膜表面,與自噬體的形成有關(guān),是表示自噬程度的特異性蛋白[17]。本研究發(fā)現(xiàn),GDM組胎盤組織中自噬基因Beclin1、LC3 mRNA表達(dá)水平及蛋白陽性表達(dá)率顯著高于對照組,且Beclin1、LC3蛋白陽性表達(dá)GDM患者FPG、FINS水平高于陰性表達(dá)患者,提示自噬可能與GDM的發(fā)生有關(guān),與Li等[18]研究結(jié)果相似,猜測是因?yàn)楦哐且种铺ケP血管生成,導(dǎo)致GDM患者胎盤組織缺血、缺氧,細(xì)胞中活性氧水平增加,激活自噬。正常自噬能夠維持細(xì)胞功能和組織結(jié)構(gòu),而過度自噬會引起內(nèi)皮細(xì)胞損傷,引起胎盤發(fā)育異常,導(dǎo)致組織缺血、缺氧、營養(yǎng)缺乏,引發(fā)胎盤功能障礙,增加巨大兒等不良妊娠結(jié)局發(fā)生的風(fēng)險[19]。Li等[18]研究表明,GDM患者胎盤中白介素-6(IL-6)、IL-8等炎性因子及自噬相關(guān)基因7(ATG7)和Beclin1表達(dá)顯著升高,胎盤中炎性反應(yīng)和自噬的發(fā)生會增加新生兒感染的風(fēng)險。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),GDM組胎盤組織中Beclin1、LC3蛋白陽性表達(dá)患者胎盤質(zhì)量、新生兒體質(zhì)量及不良妊娠結(jié)局的發(fā)生率均高于Beclin1、LC3蛋白陰性表達(dá)患者,提示自噬可能與胎盤異常生長及不良妊娠結(jié)局有關(guān)。Logistic回歸分析結(jié)果表明,胎盤組織Beclin1、LC3蛋白陽性表達(dá)是GDM患者發(fā)生不良妊娠結(jié)局的危險因素,原因可能是高糖水平可能引發(fā)胎盤的自噬,導(dǎo)致不良妊娠結(jié)局的發(fā)生,具體機(jī)制有待進(jìn)一步的研究。

        綜上所述,GDM患者胎盤組織中自噬基因Beclin1、LC3表達(dá)顯著升高,胎盤組織中Beclin1、LC3蛋白陽性表達(dá)是GDM患者發(fā)生不良妊娠結(jié)局的危險因素,自噬可能與GDM的發(fā)生及不良妊娠結(jié)局有關(guān)。由于本研究僅從臨床水平上分析了胎盤組織中Beclin1、LC3的表達(dá)情況,下一步還需結(jié)合體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探討自噬在GDM發(fā)生發(fā)展中的可能機(jī)制。

        利益沖突:所有作者聲明無利益沖突

        作者貢獻(xiàn)聲明

        王洪偉:設(shè)計研究方案,課題設(shè)計,實(shí)施研究過程,論文撰寫;關(guān)紅瓊:提出研究思路,分析試驗(yàn)數(shù)據(jù),論文審核;王茹:實(shí)施研究過程,資料搜集整理,論文修改;黃曉妹:進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析

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