鄭東翔，鐘喨，黃智峰，曾建峰，吳松

（中山市中醫(yī)院泌尿外科，中山 528400）

氯胺酮是一種臨床常見的麻醉藥物，主要應(yīng)用于小兒外科麻醉[1]。由于氯胺酮的興奮及致幻作用，其逐漸成為娛樂場所濫用的新型毒品[2]。氯胺酮濫用患者多出現(xiàn)明顯的泌尿系統(tǒng)損害，臨床表現(xiàn)為尿頻、尿急、血尿及膀胱區(qū)疼痛等，稱為氯胺酮相關(guān)性膀胱炎（KC）[3]。目前針對KC的治療藥主要包括抗膽堿藥物、非甾體類及甾體類抗炎藥物，但部分患者藥物療效不佳[4]。多項研究發(fā)現(xiàn)，氯胺酮能夠通過多種通路增強氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而導(dǎo)致膀胱炎癥的發(fā)生。在氯胺酮誘導(dǎo)的KC大鼠模型中，可見膀胱組織環(huán)氧化酶-2（COX-2）、一氧化氮合酶（iNOS）和內(nèi)皮細(xì)胞一氧化氮合酶（eNOS）的表達上調(diào)，這些氧化應(yīng)激酶的增加可能在KC發(fā)展中起到重要作用[5]。氯胺酮還可引起核因子κB（NF-κB）向核內(nèi)易位，從而激活COX-2，導(dǎo)致大鼠膀胱炎癥[6]。另有研究發(fā)現(xiàn)[7]，氯胺酮可升高線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)介導(dǎo)的氧化應(yīng)激酶活性，從而導(dǎo)致潰瘍性膀胱炎和膀胱細(xì)胞凋亡。中醫(yī)認(rèn)為KC歸屬為“淋癥”范疇，治以清熱利濕、活血祛瘀、通淋止痛為主。芍藥甘草湯有養(yǎng)血斂陰，緩急止痛之效，為臨床治療石淋絞痛的常用方。現(xiàn)代藥理學(xué)研究證明[8]，其具有抗氧化、鎮(zhèn)痛止痙及抗炎等作用，對尿路感染及尿路結(jié)石患者具有較好的療效。本研究觀察芍藥甘草湯灌腸對KC模型大鼠的治療作用，并通過NF-κB/COX-2/Nrf2通路探討其抑制氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)，改善膀胱功能，減輕膀胱組織損傷的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 雄性SD大鼠共40只，SPF級，體質(zhì)量（200±20）g，飼養(yǎng)于室溫 18～25℃，相對濕度45%～55%環(huán)境中，實驗前適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。

1.2 藥物與試劑 鹽酸氯胺酮注射液（2 mL∶0.1 g）購自武漢久安藥業(yè)有限公司，批號：19011015。左氧氟沙星膠囊（100 mg/片）購自安徽三精萬森制藥有限公司，批號：181229。芍藥甘草湯處方為：白芍30 g，生甘草10 g，由中山市中醫(yī)院門診部藥房提供實驗用生藥，經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)張丹雁教授鑒定，分別為毛茛科芍藥屬植物芍藥（Paeonia lactiflora Pall.）的干燥根及豆科甘草屬植物甘草（Glycyrrhiza uralensis Fisch.）的干燥根及根莖。藥材參照《中國藥典》2015年版現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)，經(jīng)薄層色譜法鑒別，甘草以乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水（15∶1∶1∶2）為展開劑，甘草酸單銨鹽（質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.0%）為對照品；白芍以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（40∶5∶10∶0.2）為展開劑，芍藥苷（質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.8%）為對照品，結(jié)果均具有鑒別特征，符合國家標(biāo)準(zhǔn)，可以入藥。實驗前將藥材加水煎煮濃縮，貯存于4℃冰箱備用。蘇木精-伊紅（HE）染色試劑盒購自上海生工生物工程有限公司；IL-6、IL-8、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA法）檢測試劑盒購自上海酶科生物科技有限公司；總蛋白提取試劑盒購自美國Sigama公司，Anti-NF-κB p65、Anti-COX-2、Anti-Nrf2、Anti-βactin購自美國 R＆D 公司，TransAMTM NF-κB p65、Nrf2活性檢測試劑盒購自Active Motif公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗動物分組與給藥 將40只SD大鼠隨機分為4組：空白組、模型組、左氧氟沙星組、芍藥甘草湯組，每組10只。以左氧氟沙星為陽性對照組，模型組、左氧氟沙星組及芍藥甘草湯組采用氯胺酮（30 mg/kg）腹腔注射制備KC模型，每日1次，持續(xù)12周。造模停藥3 d后，膠體金法檢測大鼠尿液標(biāo)本中氯胺酮濃度，質(zhì)控區(qū)（C）檢測線處出現(xiàn)紅色條帶，而測試區(qū)（T）未出現(xiàn)紫紅色條帶為陽性，證實造模成功。模型制備成功后，芍藥甘草湯組按生藥量3.6 g/kg保留灌腸，藥液臨用前用生理鹽水稀釋至終濃度為0.72 g/mL，加熱至30℃，采用2 mL注射器連接小兒導(dǎo)尿管緩慢推入。左氧氟沙星組給予40 mg/kg灌腸，正常組給予生理鹽水灌腸，給藥體積均按5 mL/kg計，每日1次，持續(xù)4周。

1.3.2 膀胱尿流動力學(xué)檢測 各組大鼠腹腔注射水合氯醛（200 mg/kg）麻醉，固定大鼠四肢，行恥骨上緣縱向切口，以直徑1 mm的硬膜外導(dǎo)管經(jīng)尿道插入膀胱，導(dǎo)管連接三通管，三通管與微量灌注泵相連，用生理鹽水以0.2 mL/min速率灌注，另一端連接尿動力檢測儀的壓力換能器，記錄大鼠膀胱殘余尿量、膀胱最大容量、最大膀胱內(nèi)壓及膀胱順應(yīng)性變化，膀胱順應(yīng)性=膀胱最大容量/最大膀胱內(nèi)壓。

1.3.3 疼痛閾值檢測 參照文獻[9]方法，將大鼠單獨放置于有金屬網(wǎng)格的透明塑料測試籠，適應(yīng)30min后，分別以 1.0、2.0、4.0、8.0、15.0、20.0 g的纖維細(xì)絲依次刺激大鼠肛門與尿道口之間區(qū)域，每根纖維刺激10次，每次持續(xù)1～2 s，大鼠出現(xiàn)弓背、跳躍，舔咬下腹部等動作為有反應(yīng)，將反應(yīng)次數(shù)大于5次的纖維力度定為大鼠的疼痛閾值。

1.3.4 HE染色觀察膀胱組織病理學(xué)變化 取部分膀胱組織于4%多聚甲醛中固定，脫水、透明后石蠟包埋，作5 μm厚切片，再經(jīng)烤片、脫蠟至水、HE染色、70%鹽酸乙醇分化、脫水透明、中性樹膠封片等操作后完成制片，光學(xué)顯微鏡下觀察膀胱組織的形態(tài)學(xué)變化。

1.3.5 血清中炎性因子含量檢測 大鼠眼球取血，離心后取血清于-20℃冰箱保存待測。血清常溫下放置1h后3 000 r/min離心15min，離心半徑13.5cm，加入樣品稀釋劑 40 μL，抗體 100 μL，血清 10 μL，置于37℃孵育1 h，洗滌液清洗5次，加入顯色液100 μL，37 ℃避光孵育 15 min，加入終止液 50 μL，于酶標(biāo)儀450 nm下檢測各反應(yīng)孔OD值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算血清中白介素-1β（IL-1β）、白介素-6（IL-6）及TNF-α的含量。

1.3.6 膀胱組織中 NF-κB p65、COX-2、Nrf2 蛋白表達檢測 取大鼠膀胱組織100～200 mg，剪碎后置于裂解液中，使用組織勻漿器冰上勻漿，4℃離心機12 000 r/min離心20 min，離心半徑8 cm，提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。進行制膠、上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜和封閉后，一抗4℃孵育過夜，TBST洗膜，辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的二抗37℃孵育1 h，TBST洗膜。ECL發(fā)光液孵育后，凝膠成像分析系統(tǒng)曝光圖像，計算目標(biāo)蛋白與相應(yīng)內(nèi)參的光密度比值，分析NF-κB p65、核因子 E2 相關(guān)因子 2（Nrf2）、環(huán)氧化酶-2（COX-2）的蛋白含量。

1.3.7 膀胱組織中NF-κBp65、Nrf2的活性檢測 將蛋白提取液A和B分別加入蛋白酶抑制劑混勻備用，大鼠膀胱組織解凍后，取100～200 mg加入預(yù)冷磷酸鹽緩沖液（PBS）勻漿，4℃離心機離心5 min，離心半徑8 cm，后棄上清液，加入蛋白提取液A，高速渦旋震蕩，PBS洗滌后離心棄上清液，加入蛋白提取液B，高速渦旋震蕩，離心后吸取上清液即得到核蛋白。采用BCA法測定核蛋白濃度，參照Trans AMTM檢測試劑盒說明書測定膀胱組織NF-κB p65、Nrf2的DNA活性：分別設(shè)置空白孔、樣本孔、特異性結(jié)合孔、非特異性競爭孔和陽性對照孔，按操作步驟加入反應(yīng)試劑，于450 nm下測定各孔OD值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算NF-κB p65、Nrf2相對結(jié)合活性。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 24.0統(tǒng)計軟件進行分析，實驗數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 膀胱尿動力學(xué)檢測結(jié)果 模型組大鼠膀胱最大容量、殘余尿量及膀胱順應(yīng)性較空白組顯著增加，最大膀胱內(nèi)壓顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。左氧氟沙星組及芍藥甘草湯組大鼠膀胱最大容量、殘余尿量及膀胱順應(yīng)性均低于模型組，最大膀胱內(nèi)壓均高于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 各組大鼠尿動力學(xué)指標(biāo)比較（±s）Tab.1 Comparison of urodynamic indexes of rats in each group（±s）

注：與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05。

組別 動物數(shù) 膀胱最大容量（mL） 最大膀胱內(nèi)壓（cm H2O） 殘余尿量（mL） 膀胱順應(yīng)性（mL/cm H2O）空白組 10 1.41±0.36 85.08±11.21 0.15±0.10 0.017±0.003模型組 10 4.93±1.10* 46.36±8.07* 1.98±0.31* 0.106±0.002*左氧氟沙星組 10 2.73±0.37# 65.14±9.69# 0.67±0.17# 0.042±0.002#芍藥甘草湯組 10 2.35±0.40# 68.23±8.26# 0.50±0.23# 0.034±0.004#

2.2 疼痛閾值比較 模型組大鼠與空白組大鼠比較，疼痛閾值明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。左氧氟沙星組及芍藥甘草湯組大鼠與模型組相比，疼痛閾值明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表 2。

表2 各組大鼠疼痛閾值比較（±s）Tab.2 Comparison of pain threshold of rats in each group（±s）

表2 各組大鼠疼痛閾值比較（±s）Tab.2 Comparison of pain threshold of rats in each group（±s）

注：與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05。

組別 動物數(shù) 疼痛閾值（g）空白組 10 13.20±4.87模型組 10 1.90±1.20*左氧氟沙星組 10 6.40±5.04#芍藥甘草湯組 10 7.00±4.81#

2.3 膀胱組織病理形態(tài)學(xué)觀察 光鏡下可見，空白組大鼠膀胱平滑肌肌束排列有序，肌束間結(jié)構(gòu)緊密，膀胱組織未見異常變化。模型組大鼠與空白組相比，膀胱平滑肌明顯增生肥大，固有層充血、水腫，可見大量炎性細(xì)胞浸潤。左氧氟沙星組及芍藥甘草湯組大鼠膀胱組織損傷較模型組減輕，平滑肌增生肥大明顯減輕，固有層可見少量炎性細(xì)胞浸潤，膀胱炎癥減輕。見圖1。

圖1 各組大鼠膀胱組織病理形態(tài)學(xué)改變（HE，×200）Fig.1 Histopathological changes of bladder of rats(HE，×200)

2.4 血清中IL-1β、IL-6、TNF-α炎癥因子含量 模型組大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α的含量較空白組明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。左氧氟沙星組及芍藥甘草湯組大鼠與模型組比較，IL-1β、IL-6、TNF-α的含量有所降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表 3。

表3 各組大鼠血清中 IL-1β、IL-6、TNF-α 的表達（±s）Tab.3 IL-1β、IL-6、TNF-α in serum of rats in each group（±s）ng/mL

表3 各組大鼠血清中 IL-1β、IL-6、TNF-α 的表達（±s）Tab.3 IL-1β、IL-6、TNF-α in serum of rats in each group（±s）ng/mL

注：與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05。

組別 動物數(shù) IL-1β IL-6 TNF-α正常組 10 0.102±0.014 101.59±33.28 1.352±0.231模型組 10 0.358±0.051*190.85±35.76*2.935±0.304*左氧氟沙星組 10 0.174±0.046# 132.50±41.26#1.763±0.415#芍藥甘草湯組 10 0.162±0.053# 125.38±32.51#1.658±0.280#

2.5 膀胱組織中 NF-κB p65、COX-2、Nrf2 的蛋白表達 模型組大鼠膀胱組織中NF-κB p65、COX-2的蛋白表達顯著升高，而Nrf2的表達明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與模型組比較，左氧氟沙星組及芍藥甘草湯組大鼠膀胱組織中NF-κB p65、COX-2的蛋白表達均明顯降低，Nrf2的表達顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖2。

2.6 膀胱組織NF-κB p65、Nrf2的DNA結(jié)合活性情況 模型組膀胱組織核蛋白中NF-κB p65的DNA結(jié)合活性顯著升高，Nrf2的結(jié)合活性明顯降低（P＜0.05）。與模型組比較，左氧氟沙星及芍藥甘草湯明顯降低了NF-κB p65的DNA結(jié)合活性，升高了Nrf2的結(jié)合活性（P＜0.05）。見表 4。

表4 各組大鼠膀胱組織NF-κB p65、Nrf2的DNA結(jié)合活性（±s）Tab.4 DNA binding activity of NF-κB p65 and Nrf2 in bladder tissue of rats in each group（±s）ng

表4 各組大鼠膀胱組織NF-κB p65、Nrf2的DNA結(jié)合活性（±s）Tab.4 DNA binding activity of NF-κB p65 and Nrf2 in bladder tissue of rats in each group（±s）ng

注：與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05。

組別 動物數(shù) NF-κB p65 Nrf2正常組 10 0.213±0.036 0.384±0.029模型組 10 0.488±0.072* 0.120±0.014*左氧氟沙星組 10 0.251±0.028# 0.246±0.027#芍藥甘草湯組 10 0.259±0.043# 0.253±0.031#

3 討論

氯胺酮具有麻醉、鎮(zhèn)痛效用，常作為麻醉藥物用于臨床外科手術(shù)中，還可用于頑固性癌性疼痛的止痛治療[1]。由于氯胺酮的中樞神經(jīng)興奮及致幻作用，使其成為娛樂場所濫用的新型毒品之一，俗稱“K粉”。長期吸食氯胺酮會造成神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)等多系統(tǒng)組織器官的毒性損害[2]。近年來，氯胺酮相關(guān)性泌尿系統(tǒng)損害逐漸受到國內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注，尤其對KC的研究逐漸增多。KC臨床表現(xiàn)為尿頻、尿急、血尿及膀胱區(qū)疼痛等癥狀，目前的治療方法以戒斷氯胺酮為主，配合抗膽堿藥物、非甾體類及甾體類抗炎藥物，但仍有部分患者藥物療效不佳[3-4]。中醫(yī)將KC歸屬為“淋癥”范疇，癥見小便短赤頻數(shù)，淋瀝刺痛，少腹拘急，或痛引腰腹，治以清熱利濕，通淋止痛為主。芍藥甘草湯最早記載于張仲景《傷寒論》，由白芍、甘草兩味藥組成。芍藥性酸寒，具有斂陰養(yǎng)血之效，甘草性甘溫，有緩急止痛之功，兩者配伍可用于治療肝脾不和，脘腹疼痛，及筋脈失養(yǎng)，腿腳攣急等癥。后世醫(yī)家用其治療石淋絞痛，發(fā)現(xiàn)止痛效果突出[10]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究證實本方具有明顯的抗氧化、鎮(zhèn)痛止痙及抗炎等作用[6]，方中有效成分芍藥苷能顯著抑制TNF-α的表達，減少炎癥細(xì)胞浸潤，從而緩解炎性疼痛[11]。甘草酸能夠降低炎性細(xì)胞因子IL-6、IL-10的水平，提高抗氧化能力，緩解炎癥癥狀[12]。

KC發(fā)生的確切機制尚不清楚，目前發(fā)現(xiàn)的可能機制主要有膀胱黏膜毒性損傷、自身免疫反應(yīng)及氧化應(yīng)激等[13-15]。氧化應(yīng)激相關(guān)酶COX-2可能在KC的發(fā)生過程中具有重要作用[16]。COX-2能夠催化花生四烯酸轉(zhuǎn)化為前列腺素，進而誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)發(fā)生[17]。研究發(fā)現(xiàn)[18]，氯胺酮能夠促進膀胱組織中COX-2的表達，其表達的增加可能是通過NF-κB通路實現(xiàn)的。NF-κB是炎癥過程中炎癥介質(zhì)的重要轉(zhuǎn)錄因子，與IL-6、TNF-α等多種促炎細(xì)胞因子的表達密切相關(guān)[19]。Nrf2則是調(diào)控抗氧化基因的重要調(diào)節(jié)因子，能夠抑制氧化應(yīng)激和NF-κB激活對炎癥反應(yīng)起到保護作用[20]。由此可見，NF-κB/COX-2/Nrf2通路在機體炎癥反應(yīng)過程中起著重要作用。

中藥保留灌腸是一種中醫(yī)外治療法，能夠使藥物通過直腸靜脈叢迅速吸收，并可經(jīng)門靜脈進入體循環(huán)，達到整體治療的效果，與口服給藥相比具有藥物利用率高，不良反應(yīng)少的優(yōu)勢[21]。本研究在前期臨床試驗中采用芍藥甘草湯灌腸結(jié)合常規(guī)治療方案，發(fā)現(xiàn)對KC患者效果顯著，患者經(jīng)治療后臨床癥狀明顯減輕[22]。在此基礎(chǔ)上，本研究通過腹腔注射氯胺酮建立大鼠KC模型，探討芍藥甘草湯灌腸治療對KC的作用機制。實驗結(jié)果顯示，芍藥甘草湯灌腸能夠降低膀胱最大容量、殘余尿量及膀胱順應(yīng)性，升高最大膀胱內(nèi)壓，并提高大鼠疼痛閾值，提示其能改善大鼠下尿路功能，減輕膀胱區(qū)及尿道疼痛。病理學(xué)結(jié)果顯示，芍藥甘草湯治療后大鼠膀胱組織損傷明顯改善，炎性細(xì)胞浸潤減少，同時，芍藥甘草湯能夠有效降低IL-1β、TNF-α、IL-6炎癥因子水平，降低膀胱組織中NF-κB p65、COX-2的蛋白表達上調(diào)Nrf2的表達。模型組大鼠膀胱組織NF-κB p65 DNA結(jié)合活性較空白組顯著增高，Nrf2結(jié)合活性明顯降低，提示氯胺酮通過激活NF-κB通路，促進了大鼠膀胱組織氧化應(yīng)激的發(fā)生。芍藥甘草湯治療降低了NF-κB p65的脫氧核糖核酸結(jié)合活性，使Nrf2的結(jié)合活性增高，表明芍藥甘草湯能夠通過激活Nrf2增強大鼠抗氧化能力，抑制NF-κB介導(dǎo)的氧化應(yīng)激及其誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，從而起到對KC的治療作用。