安禎祥　何遠(yuǎn)利　唐東昕　黃丹　王敏　王芳

中圖分類號 R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號 1001-0408（2021）21-2587-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2021.21.05

摘 要 目的：研究扶脾柔肝顆粒（FRG）對肝纖維化模型大鼠的改善作用機(jī)制。方法：將大鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、秋水仙堿片組（化學(xué)藥陽性對照，0.2 mg/kg）、扶正化瘀膠囊組（中藥陽性對照，0.415 g/kg）和FRG低、中、高劑量組（20、40、80 g/kg），除空白組和模型組各11只大鼠外（各取1只用于判斷是否造模成功），其余每組10只。除空白組外，其余各組大鼠腹腔注射50% CCl4橄欖油溶液并灌胃30%乙醇以復(fù)制肝纖維化模型。造模成功后，各給藥組大鼠灌胃相應(yīng)藥物，空白組和模型組大鼠灌胃等體積生理鹽水，每天1次，連續(xù)4周。末次灌胃后，觀察大鼠肝組織病理形態(tài)學(xué)變化;檢測大鼠血清中透明質(zhì)酸（HA）、層粘連蛋白（LN）、Ⅲ型前膠原（PCⅢ）、Ⅳ型膠原蛋白（Col Ⅳ）水平;檢測大鼠肝組織中Beclin-1、LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)水平;檢測大鼠肝組織中蛋白激酶B（Akt）、腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）、 p70核糖體蛋白S6激酶（p70S6K）的mRNA和蛋白表達(dá)水平。結(jié)果：與空白組比較，模型組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，纖維組織增生明顯，部分有假小葉形成;血清中HA、LN、PCⅢ、Col Ⅳ水平和肝組織中Beclin-1、LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)水平以及Akt、AMPK、mTOR、p70S6K 的mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著升高（P<0.01）。與模型組比較，F(xiàn)RG各劑量組大鼠肝組織損傷明顯減輕，血清和肝組織中上述指標(biāo)（FRG低劑量組LN 、PCⅢ除外）水平均顯著降低（P<0.05或P<0.01）。結(jié)論：FRG可改善大鼠肝纖維化，其作用機(jī)制可能與下調(diào)肝組織中自噬相關(guān)蛋白和Akt/AMPK/mTOR/p70S6K信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá)有關(guān)。

關(guān)鍵詞 扶脾柔肝顆粒;肝纖維化;自噬;Akt/AMPK/mTOR/p70S6K信號通路;大鼠

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To study the mechanism of improvement effects of Fupi rougan granule （FRG） on hepatic fibrosis model rats. METHODS： The rats were randomly divided into blank group， model group， Colchicine tablet group （chemical positive control， 0.2 mg/kg）， Fuzheng huayu capsule group （TCM positive control， 0.415 g/kg）， FRG low-dose， medium-dose and high-dose groups （20， 40， 80 g/kg）， with 10 rats in each group， except for 11 rats in blank group and model group （one rat was used to judge whether the modeling was successful）. Except for blank group， other groups were given intraperitoneal injection of 50% CCl4 olive oil solution and intragastric administration of 30% ethanol to induce hepatic fibrosis model. After modeling， administration groups were given relevant medicine intragastrically; blank group and model group were given constant volume of normal saline intragastrically， once a day， for consecutive 4 weeks. After last administration， morphology changes of liver tissue in rats were observed. The serum levels of HA， LN， PCⅢ and Col Ⅳ in rats were detected， and protein expression of Beclin-1 and LC3-Ⅱin liver tissue were also determined. mRNA and protein expression of Akt， AMPK， mTOR， p70S6K were detected in liver tissues of rats. RESULTS： Compared with blank group， the structure of hepatic lobules in the model group was disordered， the proliferation of fibrous tissue was obvious， and some pseudolobules were formed; the serum levels of HA， LN， PCⅢ and Col Ⅳ， the protein expression of Beclin-1 and LC3-Ⅱ in liver tissue as well as mRNA and protein expression of Akt， AMPK， mTOR and p70S6K were increased significantly （P<0.01）. Compared with model group， the liver injury of rats in FRG groups was significantly relieved， and the levels of the above indexes in serum and liver tissue （except for LN and PCⅢ in FRG low-dose group） were significantly reduced （P<0.05 or P<0.01）. CONCLUSIONS： FRG can improve hepatic fibrosis in rats， the mechanism of which may be associated with down-regulating the expression of autophagy associated protein and Akt/AMPK/mTOR/p70S6K signaling pathway related protein.

KEYWORDS? ?Fupi rougan granule; Hepatic fibrosis; Autophagy; Akt/AMPK/mTOR/p70S6K signaling pathway; Rats

肝纖維化是由多種不同病因所致慢性肝損傷而引起的病理性修復(fù)過程，以細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）異常沉積為特點(diǎn)，進(jìn)一步可轉(zhuǎn)變?yōu)楦斡不蚋伟1]。研究表明，肝纖維化患者經(jīng)過干預(yù)治療后，可以得到緩解甚至恢復(fù);若干預(yù)不及時，可進(jìn)展為肝硬化，從而難以恢復(fù)[2]。因此，肝纖維化的治療是阻斷肝疾病惡化的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。 肝纖維化的病理機(jī)制復(fù)雜，目前仍缺乏有效的靶向藥物進(jìn)行治療。中醫(yī)藥具有多靶點(diǎn)、多途徑、多層次的治療優(yōu)勢，如中藥復(fù)方制劑復(fù)方鱉甲軟肝片、扶正化瘀膠囊等已廣泛用于肝纖維化的治療，且具有較好的臨床療效[3]。

扶脾柔肝顆粒（FRG）是由貴州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院開發(fā)的院內(nèi)制劑，由黃芪、白術(shù)、苡仁、丹參等9味藥物組成，具有健脾柔肝、補(bǔ)氣活血的功效，主要用于治療肝纖維化、肝硬化等[4-5]，其臨床療效較好，具有推廣和開發(fā)為上市新藥的價值。

研究發(fā)現(xiàn)，蛋白激酶B（Akt）/腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）/p70核糖體蛋白S6激酶（p70S6K）是經(jīng)典的自噬信號通路[6-7]，在肝纖維化的發(fā)生發(fā)展過程中具有重要作用，可參與調(diào)節(jié)肝星狀細(xì)胞的增殖活化、膠原合成、自噬和凋亡等[8-9]。Beclin-1和LC3-Ⅱ是自噬特異性標(biāo)記蛋白，可以反映自噬水平[10]。FRG是否可通過上述通路發(fā)揮改善肝纖維化的作用，尚不明確?；诖耍狙芯渴紫葟?fù)制肝纖維化模型大鼠，然后以FRG進(jìn)行干預(yù)后，檢測大鼠肝纖維化相關(guān)指標(biāo)[層粘連蛋白（LN）、透明質(zhì)酸（HA）、Ⅲ型前膠原（PCⅢ）、Ⅳ型膠原蛋白（Col Ⅳ）]水平，觀察其肝組織的病理形態(tài)學(xué)變化，并檢測其肝組織中上述幾種蛋白的表達(dá)水平，以探討FRG改善肝纖維化的作用機(jī)制，以期為FRG的臨床應(yīng)用及新藥開發(fā)提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有：FA2004型電子天平（上海上平儀器有限公司），D3024R型低溫高速離心機(jī)（美國Scilogex公司），VE 180型微型垂直電泳槽、VE 186型轉(zhuǎn)移電泳槽、EPS 300型電泳儀（上海天能科技有限公司），TY-80B型脫色搖床（金壇市榮華儀器制造有限公司），BSA224S型精密電子天平（德國Satorius公司），MUTISKAN MK3型酶標(biāo)儀（美國Thermo Fisher Scientific公司），TL998-Ⅳ型實(shí)時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）儀（西安天隆科技有限公司）。

1.2 主要藥品與試劑

FRG由黃芪30 g、白術(shù)30 g、苡仁30 g、丹參30 g、當(dāng)歸15 g、牛膝15 g、莪術(shù)15 g、蒼術(shù)15 g、枳殼15 g組成，各藥材配方顆粒均購自華潤三九醫(yī)藥股份有限公司，批號分別為1504001w、1502001w、1502001s、1503002s、1502002w、1502001w、1503001w、1502001w、1410001w;秋水仙堿片（國藥準(zhǔn)字H53021904，規(guī)格0.5 mg）購自云南玉溪生物制藥有限公司;扶正化瘀膠囊（國藥準(zhǔn)字Z20020073，規(guī)格0.3 g）購自上海黃海制藥有限責(zé)任公司;LN酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）試劑盒、HA ELISA試劑盒、PCⅢ ELISA試劑盒、Col Ⅳ ELISA試劑盒、蘇木精-伊紅（HE）染色液（批號分別為20160320、20160101、20160225、20160218、D006）均購自南京建成生物工程研究所;兔源Akt多克隆抗體、兔源AMPK多克隆抗體、兔源mTOR多克隆抗體、兔源P70S6K多克隆抗體、兔源Beclin-1多克隆抗體、兔源LC3-Ⅱ多克隆抗體、兔源甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）多克隆抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔免疫球蛋白G抗體（二抗）、BCA蛋白測定試劑盒（批號分別為E1A6261、E1A6422、E1A6308、E18-6226、E90562、E1A4007、E1C604-1、E1WP318、E1WP201-2）均購自南京恩晶生物科技有限公司;ECL發(fā)光試劑（批號P0018A）購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;二甲基亞砜（DMSO）購自美國Sigma公司; PCR引物由上海捷瑞生物工程有限公司設(shè)計(jì)并合成（PCR引物序列與產(chǎn)物長度見表1）;其余試劑為實(shí)驗(yàn)室常用規(guī)格，水為純凈水。

1.3 動物

本研究所用動物為SPF級SD大鼠，雌雄各半，共72只，體質(zhì)量（160±20） g，購自南通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，動物生產(chǎn)許可證號為SCXK（蘇）2014-0001。

2 方法

2.1 分組、造模與給藥

大鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、秋水仙堿片組（化學(xué)藥陽性對照，0.2 mg/kg，劑量根據(jù)臨床等效劑量設(shè)置）、扶正化瘀膠囊組（中藥陽性對照，0.415 g/kg，劑量根據(jù)臨床等效劑量設(shè)置）和FRG低、中、高劑量組（20、40、80? ? g/kg，劑量根據(jù)臨床等效劑量的1、2、4倍設(shè)置），空白組和模型組各11只大鼠，其余每組10只。除空白組外，其余各組大鼠參照文獻(xiàn)[11]方法進(jìn)行造模，具體方法如下：大鼠每周腹腔注射50%CCl4橄欖油溶液（1.5 mL/kg）2次，并從造模第2周開始灌胃30%乙醇（10 mL/kg），每2天1次，共造模8周。造模結(jié)束后，從空白組和模型組中隨機(jī)各抽取1只大鼠處死，然后按照《病毒性肝炎防治方案》中肝纖維化分期標(biāo)準(zhǔn)來判斷大鼠的肝纖維化程度，當(dāng)模型組大鼠肝組織有2 期以上肝纖維化形成時，則表明肝纖維化模型建立成功[12]。造模成功后，各給藥組大鼠灌胃相應(yīng)藥物（臨用時以水溶解），空白組和模型組大鼠灌胃等體積生理鹽水，每天1次，連續(xù)4周。

2.2 標(biāo)本采集

末次灌胃后，大鼠禁食12 h，然后腹主動脈采血。血樣經(jīng)抗凝離心后，收集上層血清，于-20 ℃保存，備用。取血完成后，處死各組大鼠，取其肝組織，部分以4%多聚甲醛固定，部分于-80 ℃保存，備用。

2.3 大鼠肝組織病理形態(tài)學(xué)觀察

取“2.2”項(xiàng)下各組大鼠固定于4%多聚甲醛的肝組織，進(jìn)行石蠟包埋、切片（厚度為4 μm）。各組大鼠取3張切片進(jìn)行HE染色（另外3張切片后續(xù)進(jìn)行免疫組化實(shí)驗(yàn)），然后于光學(xué)顯微鏡下觀察大鼠肝組織的病理形態(tài)學(xué)變化，并拍照。

2.4 大鼠血清中HA、LN、PCⅢ、Col Ⅳ水平的測定

采用ELISA法進(jìn)行測定。取“2.2”項(xiàng)下各組大鼠的血清樣品，按相應(yīng)試劑盒說明書方法操作，采用酶標(biāo)儀于450 nm波長下測定大鼠血清中HA、LN、PCⅢ、Col Ⅳ的水平。

2.5 大鼠肝組織中Beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)水平的檢測

采用免疫組化法進(jìn)行檢測。取“2.3”項(xiàng)下另外3張切片，經(jīng)脫蠟水化、組織抗原修復(fù)、山羊血清封閉后，滴加Beclin-1、LC3-Ⅱ一抗（稀釋度均為1 ∶ 100），室溫孵育2 h;以TBST沖洗5 min×3次，滴加二抗（稀釋度為1 ∶ 500），室溫孵育1 h; 以TBST沖洗5 min×3次，經(jīng)DAB顯色后，脫水封片，并于光學(xué)顯微鏡下觀察，拍照。當(dāng)切片中出現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒則為相應(yīng)蛋白的陽性表達(dá)，采用彩色病理圖文分析系統(tǒng)測定陽性染色部分的平均光密度，以表示目的蛋白的表達(dá)水平。

2.6 大鼠肝組織中Akt、AMPK、mTOR、p70S6K mRNA的表達(dá)水平檢測

采用逆轉(zhuǎn)錄PCR（qRT-PCR）法進(jìn)行檢測。取“2.2”項(xiàng)下凍存的肝組織5份，經(jīng)裂解、氯仿抽提、異丙醇沉淀、75%乙醇洗滌后，收集總RNA;然后將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為：PCR MasterMix 10 μL，上下游引物各 0.6 μL，cDNA 0.4 μL，H2O 8.4 μL。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性10 min;95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 min，共41個循環(huán)。以β-actin為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算Akt、AMPK、mTOR、p70S6K mRNA的表達(dá)水平。

2.7 大鼠肝組織中Akt、AMPK、mTOR、p70S6K蛋白表達(dá)水平的檢測

采用Western blot法進(jìn)行檢測。取“2.2”項(xiàng)下凍存的肝組織3份，經(jīng)裂解后，提取總蛋白。采用BCA法測定蛋白濃度后，對蛋白進(jìn)行加熱變性處理。取變性蛋白進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，以5% BSA封閉1 h;以TBST緩沖液沖洗5 min×3次，分別加入Akt、AMPK、mTOR、p70S6K、GAPDH一抗（稀釋度均為1 ∶ 1 000），4 ℃孵育過夜;以TBST緩沖液沖洗5 min×3次，加入二抗（稀釋度為1 ∶ 5 000），室溫孵育1 h;以TBST緩沖液沖洗5 min×3次，加入ECL顯色后，置于凝膠成像系統(tǒng)中成像。采用Adobe Photoshop CS5軟件分析相應(yīng)蛋白條帶的灰度值，以目的蛋白與內(nèi)參蛋白GAPDH的灰度值比值表示目的蛋白的表達(dá)水平。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

3 結(jié)果

3.1 FRG對肝纖維化模型大鼠肝組織病理形態(tài)學(xué)的影響

空白組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)正常，肝索排列整齊;模型組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，纖維組織增生明顯，部分有假小葉形成;藥物干預(yù)組大鼠肝組織損傷均較模型組明顯減輕，詳見圖1。

3.2 FRG對大鼠血清中HA、LN、PCⅢ、Col Ⅳ水平的影響

與空白組比較，模型組大鼠血清中HA、LN、PCⅢ、Col Ⅳ水平均顯著升高（P<0.01）;與模型組比較，各藥物干預(yù)組大鼠血清中HA、LN（FRG低劑量組和扶正化瘀膠囊組除外）、PCⅢ（FRG低劑量組除外）、Col Ⅳ水平均顯著降低（P<0.05或P<0.01），詳見表2。

3.3 FRG對大鼠肝組織中Beclin-1、LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)的影響

與空白組比較，模型組大鼠肝組織中Beclin-1、 LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)水平均顯著升高（P<0.01）;與模型組比較，各藥物干預(yù)組大鼠肝組織中Beclin-1、LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P<0.05或P<0.01），詳見圖2、圖3、表3。

3.4 FRG對肝纖維化模型大鼠肝組織中Akt、AMPK、mTOR、p70S6K mRNA表達(dá)的影響

與空白組比較，模型組大鼠肝組織中Akt、AMPK、mTOR、p70S6K mRNA表達(dá)水平均顯著升高（P<0.01）;與模型組比較，各藥物干預(yù)組大鼠肝組織中Akt、AMPK、mTOR、p70S6K mRNA表達(dá)水平均顯著降低（P<0.01），詳見表4。

3.5 FRG對肝纖維化模型大鼠肝組織中Akt、AMPK、mTOR、p70S6K蛋白表達(dá)的影響

與空白組比較，模型組大鼠肝組織中Akt、AMPK、mTOR、p70S6K蛋白表達(dá)水平均顯著升高（P<0.01）;與模型組比較，各藥物干預(yù)組大鼠肝組織中Akt、AMPK、mTOR、p70S6K蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P<0.01），詳見圖4、表5。

4 討論

肝纖維化屬于中醫(yī)“肝積”“脅痛”“積聚”等范疇?！夺t(yī)宗必讀》有云：“積之成者，正氣不足，而后邪氣踞之”。中醫(yī)認(rèn)為，肝纖維化的基本病機(jī)為正虛瘀結(jié)，主要治療方法為扶正補(bǔ)虛、活血化瘀、散結(jié)。本研究所用FRG具有健脾柔肝、補(bǔ)氣活血的功效，臨床治療效果良好，但其具體作用機(jī)制尚不明確?；诖?，本研究主要探討FRG改善肝纖維化的作用機(jī)制，以期為其臨床應(yīng)用及新藥開發(fā)提供參考。扶正化瘀膠囊是已被證實(shí)能多環(huán)節(jié)、多層次、多靶點(diǎn)抗纖維化的中藥復(fù)方制劑[13]，秋水仙堿片具有保護(hù)肝功能、改善肝纖維化的作用[14]，故本研究選取扶正化瘀膠囊作為中藥陽性對照，選擇秋水仙堿片作為化學(xué)藥陽性對照。

肝纖維化過程中，HA、LN、PCⅢ和Col Ⅳ在肝臟中異常沉積，從而導(dǎo)致膠原纖維的異常增生，最終導(dǎo)致肝纖維化[15]。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)FRG干預(yù)后，大鼠肝組織損傷以及血清中HA、LN（低劑量組除外）、PCⅢ（低劑量組除外）、ColⅣ水平均較模型組顯著降低，這表明FRG可改善大鼠肝纖維化。

自噬是細(xì)胞利用可回收的細(xì)胞器以維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的一種適應(yīng)性機(jī)制[16-17]。Beclin-1是啟動自噬的必要條件，可調(diào)控自噬體的形成[18]。LC3-Ⅱ是自噬體膜的結(jié)構(gòu)蛋白，可反映自噬體的數(shù)量，是自噬過程中的標(biāo)志蛋白[19]。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)FRG干預(yù)后，大鼠肝組織中Beclin-1、LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)水平均較模型組顯著降低，這表明FRG可通過抑制細(xì)胞自噬，發(fā)揮改善大鼠肝纖維化的作用。

Akt/AMPK/mTOR是經(jīng)典的自噬通路，在肝纖維化的發(fā)展過程中具有重要作用。mTOR是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是上游信號通路調(diào)控細(xì)胞生長、增殖和自噬的交匯點(diǎn)，是Akt和AMPK共同調(diào)控的主要信號節(jié)點(diǎn)[20-22];其可通過影響自噬相關(guān)蛋白Beclin-1、LC3-Ⅱ來調(diào)節(jié)自噬[23-25]。mTOR正常存在于細(xì)胞漿中，被Akt激活后轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核，從而激活下游靶分子p70S6K，進(jìn)而促進(jìn)肝星狀細(xì)胞的增殖，最終導(dǎo)致肝纖維化[9，26]。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)FRG干預(yù)后，大鼠肝組織中Akt、AMPK、mTOR、p70S6K 的mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著降低。這表明，F(xiàn)RG可通過下調(diào)Akt/AMPK/mTOR/p70S6K信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá)，發(fā)揮改善大鼠肝纖維化的作用。

綜上所述，F(xiàn)RG可改善大鼠肝纖維化，其作用機(jī)制可能與下調(diào)肝組織中自噬相關(guān)蛋白和Akt/AMPK/mTOR/p70S6K信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá)有關(guān)。

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（收稿日期：2021-06-07 修回日期：2021-08-29）

（編輯：唐曉蓮）