聶 倩， 張青青， 白忠臣， 張正平

(1.貴州大學 大數據與信息工程學院，貴州 貴陽 550025； 2.貴州大學 貴州省光電子技術及應用重點實驗室，貴州 貴陽 550025； 3.貴州大學 醫(yī)學院，貴州 貴陽 550025)

0 引 言

Tau蛋白與微管蛋白(microtuble associated protein,MAP)，相互作用，參與神經細胞骨架的構建，在神經系統(tǒng)中起著重要作用[1]。近年來，在神經退行性疾病的研究中，Tau蛋白作為阿爾茨海默氏病(Alzheimer’s disease,AD)的生物標志物之一，在輔助疾病的臨床診斷和干預治療中具有重要意義[2]。

近年來，出現了許多生物傳感器的技術如電化學方法和光學方法用于檢測微量的Tau蛋白[3～10]。光學生物傳感器是最常見的生物傳感器[8]，目前，表面增強拉曼散射(surface enhanced Raman scattering,SERS)、熒光法和光波干涉法已經被廣泛應用于其中[9,10]。由于光學生物傳感器中的SERS傳感器相比電化學傳感器和壓電傳感器具有更高的檢測靈敏度和更低的檢測限，并且能夠直接、實時和無標記檢測。因此，這里選擇SERS傳感器來研究和構建Tau蛋白生物傳感器。

SERS是利用金屬納米結構表面產生的表面等離子體共振(surface plasmon resonance,SPR)[11]引起的高強度局域電磁場來增強待測分子拉曼信號的一種高靈敏度技術。SERS作為一種振動光譜技術，可以提供有關分子結構的具體信息。利用SERS技術，能檢測到濃度極低的有機物的分子振動信號，實現生物和化學分子的無損和超高的靈敏度的檢測[12]。通常采用表面粗糙的貴金屬納米結構如金、銀和銅等來產生電磁熱點以獲得SERS信號，電磁場的強度可以通過調節(jié)納米結構形態(tài)來調節(jié)。因此制備精細的金屬納米結構基底對于SERS信號的強度和靈敏度十分重要。

1 實驗與方法

1.1 實驗材料

聚合度為1 700，醇解度為98 %的聚醋酸乙烯醇(polyvinyl acetate,PVA)粉末(上海阿拉丁試劑有限公司)用作還原劑；三聚氰胺粉末(分析純，上海阿拉丁試劑有限公司)用作薄膜的增強因子(enhancement factors,EFs)測試；硝酸銀(AgNO3)粉末(分析純，國藥集團有限公司)用于沉積銀島薄膜；甲醇(天津富宇精細化工有限公司)用于溶解三聚氰胺；Tau441蛋白質(ab84700，上海艾博抗有限公司)用作待檢測蛋白質分子；濃度為0.01 mol/L的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline,PBS)(上海索萊寶有限公司)，用于Tau441蛋白質的稀釋劑；表面鍍有氧化銦錫薄膜的ITO玻璃(華南湘城科技有限公司)的規(guī)格為20 mm×20 mm×0.55 mm，用作銀島薄膜的支撐基底；在整個實驗中使用的水均為去離子水。所有試劑在使用時均沒有經過進一步純化。

1.2 薄膜基底的制備

1)PVA/AgNO3混合液的制備:a.PVA水溶液的制備:稱取5 g PVA粉末溶解到45 mL去離子水中，并在90 ℃下以500 r/min的轉速攪拌1 h，獲得質量分數為10 %的PVA水溶液;b.AgNO3水溶液的制備：分別稱取AgNO3粉末(0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5)g溶解在1 mL去離子水中，得到質量分數為0 %，9 %，17 %，23 %，28 %，33 %的AgNO3水溶液;c.PVA/AgNO3混合液的制備:將AgNO3水溶液分別與5 mL，質量分數為10 %PVA水溶液均勻混合，放置在黑暗環(huán)境中1 h，備用。

2)旋涂法制備PVA/AgNO3復合薄膜:分別量取0.2 mL含有不同質量分數AgNO3的PVA/AgNO3水溶液均勻滴在ITO玻璃基底上，采用旋涂法制備PVA/AgNO3復合薄膜。勻膠機采用三階轉速以獲得均勻的薄膜：第一轉速500 r/min，10 s；第二轉速1 000 r/min，10 s；第三轉速4 000 r/min，40 s。

3)復合薄膜的熱處理:使用自制熱處理系統(tǒng)對復合薄膜進行熱處理，自制熱處理系統(tǒng)如圖1(a)所示，主要由支撐架、酒精燈、加熱臺(80 mm×80 mm×3 mm)、溫度傳感器和玻璃罩組成。自制熱處理系統(tǒng)的溫度特性如圖1(b)所示，隨著加熱時間的增加，加熱臺表面的溫度逐漸升高，在350 s時達到500 ℃并穩(wěn)定在其附件，溫度的均勻性為(500±3)℃。熱處理前，加熱10 min使加熱臺受熱均勻。隨后，PVA/AgNO3復合薄膜放置于加熱臺上，在500 ℃左右下加熱10 min，然后取下薄膜并冷卻至室溫，獲得銀島薄膜基底。

圖1 自制熱處理器及其溫度特性

1.3 薄膜基底的表征

使用材料顯微系統(tǒng)(DM—2700,Leica,Germany)觀察薄膜表面形貌，該顯微系統(tǒng)配備電荷耦合器件(CCD,Du934P,Andor)。使用接觸式臺階儀(ET 150,Kosaka Lab,Japan)測量薄膜基底的厚度。使用場發(fā)射掃描電子顯微鏡和能量色散X射線光譜儀(SEM-EDS, SU8100,Hitachi,Japan)表征銀島薄膜的形態(tài)和薄膜表面元素組成及元素分布。使用X射線衍射儀(D8 Advance,Bruker,Germany)表征薄膜基底的化學組成。使用顯微拉曼光譜儀系統(tǒng)(SR—500I—B1,Andor,England)測量拉曼光譜，激發(fā)光源為532 nm連續(xù)激光器(Torus, Laser Quantum,England)。

1.4 溶液的配置和Tau蛋白生物傳感器構建

三聚氰胺溶液的配制：將50 mg三聚氰胺粉末溶解在500 mL甲醇溶液中，并在300 r/min和60 ℃下攪拌10 min制備得到濃度為100 mg/L的三聚氰胺甲醇溶液。

Tau蛋白檢測液的配制。用移液槍將濃度為0.2 g/L，規(guī)格為250 μL的Tau蛋白原溶液分裝在25管微量離心管中，每管10 μL。取5管用作配制溶液，使用PBS作為稀釋劑分別配制濃度為500,100,85,70,50,30,15,10,1 mg/L的Tau蛋白溶液保存于冰箱4～6 ℃環(huán)境下備用。

Tau蛋白生物傳感器的構建示意圖如圖2所示。系統(tǒng)由激光器、浸泡過Tau蛋白溶液的薄膜基底、光纖、濾光片、CCD、耦合器、動鏡、透鏡、衰減器、拉曼光譜儀和電腦組成。

根據2017年陜西省統(tǒng)計年鑒，陜西省有11個地級市，按區(qū)域分為3個地區(qū)：陜南（漢中市、安康市、商洛市）、陜北（延安市、榆林市）、關中（西安市、銅川市、寶雞市、咸陽市、渭南市、楊凌示范區(qū)）。本文主要從這3個區(qū)域的發(fā)展狀況為出發(fā)點對陜西省區(qū)域協(xié)調發(fā)展進行研究。

圖2 Tau蛋白生物傳感器的構建簡圖

2 結果與討論

2.1 薄膜基底的形貌

AgNO3的含量直接決定了薄膜上納米結構的形態(tài)。當AgNO3質量分數為9 %時，還原出的銀納米顆粒平均大小為162.6 nm，如圖3(a)所示;當AgNO3質量分數為17 %時，迷宮結構銀納米線的平均寬度為277.6 nm，如圖3(b)所示;當AgNO3質量分數增加到23 %時，迷宮結構銀納米線相互連接，平均寬度為282.9 nm,如圖3(c)所示;在質量分數為28 % AgNO3薄膜表面，均勻的納米骨架結構呈銀島形狀，平均寬度為291.5 nm，如圖3(d)所示；當AgNO3質量分數達到33 %時，薄膜表面上的納米結構非常不均勻，產生了大量的凹陷和凸起，平均寬度為348.4 nm，如圖3(e)所示。

圖3 不同質量分數的AgNO薄膜基底表面SEM圖和銀島尺寸統(tǒng)計

PVA熱還原銀離子的化學反應式如(1)所示[13]

-(CH2-CH-OH)n-+Ag+→-(CH2-CH-OAg)n-+H+→-(CH2-C=O)n-+Ag0+H+

(1)

在室溫下，AgNO3溶液與PVA溶液混合后，PVA鏈中的羥基與AgNO3配位，形成螯合物，PVA分子鏈中的強氫鍵斷裂，并且PVA中游離羥基上的孤對電子可以進入Ag+的d或f軌道，形成配位結構。熱處理過程中，PVA/AgNO3的螯合物逐漸分解， PVA中大量羥基被氧化為羰基，從而還原了銀離子，PVA逐漸消耗和降解，銀納米顆粒進一步聚合、相連、融合形成銀島薄膜。

2.2 薄膜基底的增強特性

前期研究表明[14]，用制備的薄膜基底檢測三聚氰胺時，當AgNO3質量分數為9 %，17 %，23 %時，拉曼光譜峰逐漸增強，增強因子也在逐漸變大。AgNO3質量分數為28 %時，拉曼信號在特征峰處強度增強超過20 000個單位，增強因子達到1 149。但是當質量分數超過28 %時，拉曼光譜峰值強度有所下降，在質量分數為33 %時增強因子下降為976。

薄膜基底表面的銀島納米結構形成等離子體，在532 nm激光激發(fā)下銀的導帶電子集體振蕩引起局部表面等離子體激元共振(localized surface plasmon resonances,LSPR)。LSPR與入射光的耦合導致在等離子體納米結構周圍的二次電場產生等離子體熱點，有效地將電磁場集中在金屬表面/附近(距離<10 nm)并得到極大增強。這種電磁場的極大增強產生了SERS增強效應[15]。隨著AgNO3含量增大，其薄膜表面產生的銀納米顆粒增多，并聚集連接融合成銀島結構，銀島間隙變小，形成的等離子體熱點增多，極大地增強了三聚氰胺分子的拉曼信號。

由圖3(e)可知，AgNO3質量分數為33 %的薄膜基底表面由于過量的銀納米顆粒聚集融合擠壓，形成許多凹陷和凸起，骨架中孔的大小和分布很不均勻，形成的等離子體熱點減少，SERS信號減弱；凹陷和凸起對儀器的聚焦也產生了很大影響，使得正向散射增強從而降低了SERS信號。

綜上分析可知，AgNO3質量分數為28 %的薄膜基底表面均勻性好，SERS增強因子較高，故選用此薄膜基底來構建Tau蛋白生物傳感器。如圖4所示。

圖4 質量分數為28 %的AgNO3薄膜基底拉曼光譜圖

2.3 薄膜基底檢測Tau蛋白的靈敏度和檢測限

圖5(a)為薄膜基底上Tau蛋白和PBS緩沖劑的拉曼光譜圖，從圖5(a)中可以明顯看到，PBS緩沖液沒有明顯的拉曼峰，Tau蛋白溶液在640 cm-1處有最強拉曼峰，因此,選擇此處的拉曼光譜峰作為Tau蛋白的特征峰進行分析。

將薄膜基底分別放入20 mL濃度為100，70，50，30，10，1 mg/L的Tau蛋白溶液中浸泡8 h后，使得Tau蛋白質分子充分吸附在銀島薄膜表面形成蛋白質薄膜，它們的拉曼光譜如圖5(b)所示。當Tau蛋白檢測濃度逐漸降低時，薄膜基底的拉曼峰值強度逐漸降低。當檢測濃度為100 mg/L時，特征峰處的SERS信號強度為2 086；低濃度Tau蛋白的特征峰處的拉曼光譜如圖5(c)所示，當檢測濃度為10 mg/L時，特征峰處SERS信號強度為475。當Tau蛋白濃度低至1 mg/L時，特征峰處SERS強度為150左右，依然具有很好的識別性，能很好地與背景峰進行區(qū)分。

圖5 檢測Tau蛋白的拉曼光譜圖

根據不同濃度Tau蛋白特征峰處的SERS拉曼強度進行“量—效”關系曲線擬合由圖6(a)所示，在10～100 mg/L濃度范圍之間，薄膜基底檢測Tau蛋白的拉曼特征峰具有良好的線性關系，擬合方程為y=17.99x+291.3(x=10～100 mg/L)，相關系數為R2=0.997。根據擬合方程可知，方程的斜率為17.99(a.u./(mg/L)。

為驗證Tau蛋白生物傳感器的“量—效”關系穩(wěn)定性和可靠性，將兩片薄膜基底分別放入濃度為15,85 mg/L的Tau蛋白溶液中浸泡8 h后，測試其拉曼光譜，驗證結果如圖6(b)所示。由圖可知，這兩個濃度的SERS信號強度均勻地落在了擬合曲線的邊緣附近。

圖6 Tau蛋白生物傳感器的“量—效”關系擬合曲線和驗證圖

3 結 論

本文通過熱誘導還原銀離子制備銀島薄膜基底，并以此構建Tau蛋白生物傳感器。該薄膜基底具有均勻的銀島納米結構，其骨架的平均寬度為281.5 nm。以三聚氰胺為分子探針，該基底展現出良好的增強特性，其EFs可以達到1 149。以該基底和顯微拉曼測量系統(tǒng)構建Tau蛋白生物傳感器，檢測Tau蛋白的最低檢測限可以達到1 mg/L；在10～100 mg/L范圍內，傳感器具有較好的線性關系；最后對擬合方程進行穩(wěn)定性驗證，傳感器表現出較好的穩(wěn)定性和可靠性。傳感器中的薄膜基底制備方法簡單、快速、成本低廉，并且具有良好的增強特性，可以為制備低成本的薄膜基底提供一種新的思路；制備的傳感器能對低濃度Tau蛋白進行定量檢測，在通過檢測Tau蛋白水平來早期篩查和診斷AD疾病方面具有很大的潛力。